spiral6 labor1




sss

НЕКОТОРЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

rainbow
field-wind



Основные результаты, полученные нами
                     за последние 7 лет:





1) Открытие химерных ретроэлементов


  В 2002-2003 гг. нами было открыто (1-2), а в более поздних работах детально исследовано (3-4), семейство химерных ретроэлементов, распространяющееся в геномной последовательности по принципиально новому механизму. На первой стадии, обратно транскриптазный/интеграционный энзиматический аппарат ретротранспозона LINE связывает собственную мРНК или любую другую клеточную или эгоистическую цитоплазматическую РНК и транспортирует её в ядро. Там в ходе обратной транскрипции на матрице захваченной из цитоплазмы РНК и используя в качестве праймера никированную геномную ДНК, проходит образование полной или частичной кДНК-копии. При этом в ходе синтеза ретропозиционный аппарат перескакивает на другую матрицу – какую-либо ядерную РНК, и продолжает синтез кДНК-копии. Затем может происходить и второй акт смены матрицы, что приводит после репарации к образованию в геномной ДНК трёхчастных химерных ретроэлементов. При этом большинство химер всё же являются двойными элементами (5-6).

chimeras1

   Спектр прототипов объединяемых в химеры последовательностей широк – это и РНК различных ретроэлементов групп SINE и LINE, и мРНК белок-кодирующих генов, рибосомные РНК, 7SL РНК, самые разные малые ядерные и ядрышковые РНК, а также РНК с неизвестными функциями. Химеры были найдены в геномах млекопитающих, а также у некоторых грибов. Установлено, что во всех исследованных организмах, содержащих химеры, хотя бы некоторые их геномные копии транскрибируются РНК полимеразой II на уровне, сравнимом с транскрипцией генов домашнего хозяйства. Открытие механизма образования химер объясняет образование и быструю эволюцию некоторых групп мобильных элементов генома, а также является одним из новых механизмов эволюции генов путём «перетасовывания» существующих транскрибируемых последовательностей (7).

Chimeras2






2) Разработка новых экспериментальных подходов


   Для ряда молекулярно-генетических приложений мы разработали новые экспериментальные методы, позволяющие существенно оптимизировать проведение экспериментов и повышать качество получаемых на выходе результатов. Для поиска повторяющихся элементов, отличающих два исследуемых генома, нами были разработаны основанный на вычитающей гибридизации метод TGDA (8) и основанный на дифференциальной гибридизации на фильтре метод Diffir (9). Для уменьшения количества фоновых ложно-позитивных последовательностей в клонотеках, получаемых с использованием стадии гибридизации в растворе, был предложен метод MDR (10), основанный на селективной деградации несовершенных дуплексов особым видом эндонуклеаз. Наконец, для проведения полногеномного и полнотранскриптомного мониторинга экспрессии последовательностей геномных повторов одновременно на общем и индивидуальном уровнях, был разработан метод GREM, базирующийся на гибридизации фрагментов геномной ДНК, фланкирующей повторы, и 5’-участков кДНК (11). Этим и другим современным методам, основанным на гибридизации в растворе, была посвящена опубликованная нами в 2007 г. монография (12).

Book






3) Поиск человек-специфичных последовательностей генома
 
   Начиная с 2002 г. и до настоящего времени, мы ведём работу по структурно-функциональному исследованию специфичных для генома человека последовательностей, созданных эволюционно недавними вставками мобильных элементов (13). Для этого на полногеномном уровне проводили поиск специфичных для ДНК человека ретротранспозонов L1 (14) и эндогенных ретровирусов (ЭРВ) (15). Позднее (2006-2007 гг.) была проведена исчерпывающая характеризация транскрипционно активных человек-специфичных ЭРВ (чсЭРВ). Было выяснено, что некоторые из них располагаются в интронах генов в ориентации, противоположной направлению транскрипции (16-18). Удалось показать, что в двух случаях образующиеся с промоторов чсЭРВ антисмысловые транскрипты регулируют уровень мРНК для двух генов человека – SLB и SLC. Проводимые в настоящее время исследования показали, что четыре чсЭРВ обладают энхансорной активностью для соседних функциональных генов человека. Найденные 6 случаев человек-специфичной регуляции генов представляются достаточно весомым вкладом в менее чем 30 таких известных случаев, описанных к настоящему моменту (19).


fig01






4) Инженерия клеточных культур


   За период 2005-2008 гг. частично или полностью нами были разработаны некоторые системы экспрессии генов G белок-связанных рецепторов в гетерологичных системах. Создана система экспрессии обонятельных и вкусовых рецепторов млекопитающих в стволовых клетках-предшественниках сетчатки (20-21), а также обонятельных рецепторов животных в сенсиллах дрозофилы. Со 100% уровнем точности клонированы гены 25 вкусовых (22) и 35 обонятельных рецепторов высших эукариот.

phenotypes
(на рисунке показана проведённая у нас в лаборатории направленная дифференцировка эмбриональных клеток-предшественников сетчатки в различные виды нейронов, характерные для взрослой сетчатки).







ССЫЛКИ НА УПОМЯНУТЫЕ ПУБЛИКАЦИИ:

1) Buzdin, A., Ustyugova, S., Gogvadze, E., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2002) A new family of chimeric retrotranscripts formed by a full copy of U6 small nuclear RNA fused to the 3' terminus of L1. Genomics, 80(4):402-406.

2) Buzdin, A., Gogvadze, E., Kovalskaya, E., Volchkov, P., Ustyugova, S., Illarionova, A., Fushan, A., Vinogradova, T., Sverdlov, E. (2003) The human genome contains many types of chimeric retrogenes generated through in vivo RNA recombination. Nucleic Acids Res., 31(15):4385-4390.

3) Buzdin, A. (2004) Retroelements and formation of chimeric retrogenes. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61(16):2046-2059

4) Гогвадзе, E., Буздин, A. (2005) Новый механизм образования ретрогенов в геномах млекопитающих: рекомбинация in vivo в ходе обратной транскрипции РНК. Молекулярная биология, 39(3):364-373.

5) E. Gogvadze, C.  Barbisan, M.-H.  Lebrun and A. Buzdin (2007) Tripartite chimeric pseudogene from the genome of rice blast fungus Magnaporthe grisea suggests double template jumps during long interspersed nuclear element (LINE) reverse transcription. BMC Genomics, 8(1):360

6) Гогвадзе, E., Буздин, A., Свердлов, E. (2005) Множественные акты смены матрицы в ходе LINE-опосредованной обратной транскрипции являются общим механизмом образования химерных ретроэлементов у млекопитающих. Биоорганическая химия, 31(1):82-89

7) Buzdin A, Gogvadze E, Lebrun MH. (2007) Chimeric retrogenes suggest a role for the nucleolus in LINE amplification. FEBS Lett., 581(16):2877-82. Epub 2007 May 25.

8) Buzdin, A., Khodosevich, K., Mamedov, I., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2002) A technique for genome-wide identification of differences in the interspersed repeats integrations between closely related genomes and its application to detection of human-specific integrations of HERV-K LTRs. Genomics, 79(3):413-422.

9) Mamedov, I., Batrak, A., Buzdin, A., Arzumanyan, E., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2002) Genome-wide comparison of differences in the integration sites of interspersed repeats between closely related genomes. Nucleic Acids Res., 30(14):e71.

10) Chalaya T., Gogvadze E., Buzdin A., Kovalskaya E., Sverdlov E.D. (2004). Improving specificity of DNA hybridization-based methods. Nucleic Acids Res., 32(16):e130.     

11) A. Buzdin, E. Kovalskaya-Alexandrova, E. Gogvadze, E. Sverdlov (2006) GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res., 34(9): e67.

12) Монография “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin, Sergey Lukyanov; Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7, 316 страниц.

13) Buzdin, A., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2005) Genome-wide experimental identification and functional analysis of human specific retroelements. Cytogenet. Genome Res.;110(1-4):468-474., in the special issue: "Retrotransposable elements and genome evolution"

14) Buzdin, A., Ustyugova, S., Gogvadze, E., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2003) Genome-wide targeted search for human specific and polymorphic L1 integrations. Human Genetics, 112(5-6):527-533.

15) Buzdin, A., Ustyugova, S., Khodosevich, K., Mamedov, I., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2003) Human-specific subfamilies of HERV-K (HML-2) long terminal repeats: three master genes were active simultaneously during branching of hominoid lineages. Genomics, 81(2):149-156.

16) Kovalskaya, E., Buzdin, A., Gogvadze, E., Vinogradova, T., Sverdlov, E.D. (2006) Functional human endogenous retroviral LTR transcription start sites are located between the R and U5 regions. Virology,  Mar 15; 346(2):373-378.

17) Буздин, A., Лебедев, Ю., Свердлов, E. (2003) Человек-специфичные вставки LTR HERV-K в интронах генов имеют неслучайную ориентацию и, возможно, участвуют в антисмысловой регуляции экспрессии генов. Биоорганическая химия, 29(1):103-106.

18) Buzdin A., Kovalskaya-Alexandrova E., Gogvadze E., Sverdlov E. (2006) At Least 50% of Human-Specific HERV-K (HML-2) Long Terminal Repeats Serve In Vivo as Active Promoters for Host nonrepetitive DNA Transcription. J Virol., 80(21):10752-62.

19) A. Buzdin (2007) Human specific endogenous retroviruses. TheScientificWorldJournal, 7: 1848-1868.

20) I. Kholodenko, R. Kholodenko, V. Sorokin, A. Tolmazova, O. Sazonova, A. Buzdin (2007) Anti-apoptotic effect of retinoic acid on retinal progenitor cells mediated by a protein kinase A-dependent mechanism. Cell Research,  17(2):151-62.

21) И.В.Холоденко, A. A. Буздин, Р.В.Холоденко, Ю.А.Байбикова, В.Ф.Сорокин, В.Н.Ярыгин, Е.Д.Свердлов (2006) Сокультивирование клеток-предшественников сетчатки (КПС) мыши с культурой клеток пигментного эпителия влияет на особенности дифференцировки КПС. Биохимия 71(7):767-74.

22) Д.А. Гиляров, Т.А. Сахарова, А.А. Буздин. Молекулярные рецепторы вкусовых веществ. (2009) Биоорганическая химия, Том 35, №1, стр.5-14.











Москва, 117997, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10

Тел.: +7-495-330-6574; Факс: +7-495-330-6538