Пресс-центр / новости / Наука /

Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 14.607.21.0016 о предоставлении субсидии от 5 июня 2014 г

В результате выполнения работ по Соглашению № 14.607.21.0016 получены результаты:

1. Разработан лабораторный технологический регламент получения экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого. Технологический процесс получения экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого включает в себя следующие стадии:
   • Стадии вспомогательных работ: ВР 1 Водоподготовка; ВР 2 Санитарная подготовка; ВР 3 Контроль стерильности процесса производства;
   • Основные стадии технологического процесса: ТП 4 сбор листьев растений каланхоэ перестого; ТП 5 анализ растительного материала и экстракция цекропина Р1; ТП 6 проверка антибиотических свойств; УМО 7 Упаковка, маркировка экспериментальных образцов (готового продукта);
   • Стадии обеззараживания отходов: ОБО 8 Обезвреживание отходов и стоков на стадии лабораторного получения препарата.
2. Получены и наработаны экспериментальные образцы экстрактов трансгенных растений каланхоэ перистого. Для получения растительных экстрактов лекарственных растений каланхоэ перистого применяли метод холодового стресса (+40С, 7 сут), при котором в растении накапливаются антистрессовые биологически активные соединения. С помощью маркеров окислительного стресса ферментов-антиоксидантов - супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы показали, что трансгенные растения каланхоэ, экспрессирующие ген цекропина Р1, более устойчивы к холодовому стрессу и в них происходило повышенное накопление пептида цекропина Р1, что важно для фармакологического производства. Для получения экспериментальных образцов экстрактов каланхоэ, растительную ткань разрушали, гомогенизировали, центрифугировали, стерилизовали и добавляли консервант. Исследование антибиотической активности полученного экстракта к патогенному штамму Erwinia carotovora показало его повышенную устойчивость. Полученные экспериментальные образцы экстракта каланхоэ перистого, содержащего антимикробный пептид цекропин Р1, представляют собой устойчивый при хранении стерильный раствор с концентрацией пептида не менее 2 мкг/мл. По биологическим свойствам препарат пригоден для наружного применения как ранозаживляющее средство.
3. Разработаны программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов. В Программу и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов экстракта вошли исследования ранозаживляющих свойств при его накожном введении крысам SD, исследование острой токсичности и иммуномодулирующих свойств препарата на основе экстракта растения Kalanchoe pinnata, при его накожном и внутрижелудочном введении крысам SD, а также исследования антисептического действия экстрактов в отношении высокоинвазивных штаммов Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. Описаны методики прижизненных манипуляций с животными: введение препаратов, измерение массы тела, потребление корма и воды; клинические исследования: гематология, гистология, терминальные процедуры. В программу вошли методики исследования устойчивости экспериментальных образцов к окислительному стрессу и фитопатогенным бактериям.
4. В соответствии с Программой и методикой испытаний исследована устойчивость экспериментальных образцов экстрактов трансгенных растений каланхоэ к высокой температуре, длительному хранению и консервантам Исследование экспериментальных образцов экстрактов трансгенных растений каланхоэ к температуре показало их высокую устойчивость к повышенной температуре, в том числе кипячению, при этом их антибиотическая активность сохранялась, что свидетельствует об их высокой стабильности. Для хранения экстракта проведено исследование консервантов-стабилизаторов: спирт (24%), молочная кислота (лактат, 1%), флороформ (0,5%), сульфит натрия (1%), метабисульфит натрия (1%) и лимонная кислота (1%). Показано, что оптимальным консервантом является хлороформ (0,5%), при его использовании сохраняются все свойства экстракта, в том числе антибиотическая активность цекропина Р1. Эксперименты по длительному хранению экстракта показали, что при хранении в условиях +40С, экстракт сохраняет антимикробную активность в течение одного года.
5. Разработан лабораторный технологический регламент получения АМП цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого. Технологический процесс получения АМП цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого включает в себя следующие стадии:
   • Стадии вспомогательных работ: ВР 1 Водоподготовка; ВР 2 Санитарная подготовка; ВР 3 Контроль стерильности процесса производства;
   • Основные стадии технологического процесса: ТП 4 Проверка антибиотических свойств экстракта. ТП 5 Высаливание сульфатом аммония и очистка цекропина Р1 гельфильтрацией на колонках Sephadex G-50 и Superdex Peptide (HR 10/30). ТП 6 Анализ очищенного препарата методами HPLC и масс-спектрометроскопии; 7 Упаковка, маркировка экспериментальных образцов (готового продукта);
   • Стадии обеззараживания отходов: УМО 8 Обезвреживание отходов и стоков на стадии лабораторного получения препарата.
6. Получены и наработаны экспериментальные образцы АМП цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого. Для получения экспериментальных образцов АМП цекропина Р1 и очистки пептида из экстракта трансгенных растений каланхоэ использовали разные хромотографические сорбенты: Sephadex G-50, Sephadex G-25, Sephadex G-10. Проводились анализы выделенных фракций методами HPLC и масс-спектрометроскопии. Полученные фракции образцов, соответствующие основным пикам на хроматограммах высушивали с помощью вакуумного концентратора SpeedVac и хранили при температуре – 200С. Определенная методом масс-спектрометрии молекулярная масса пептида цекропина Р1, синтезированного в трансгенных растениях равна 3338 Да, что соответствует теоретической молекулярной массе синтетического цекропина Р1. Выход антимикробного пептида цекропина Р1 при его выделении и очистке из растений каланхоэ на сорбенте Sephadex G-50 и последующей очистке хроматографией на Superdex Peptide (HR 10/30) составил 71,4%.
7. Изучены факторы деградации цекропина Р1 при получении и хранении экстракта. В результате исследований факторов деградации цекропина Р1 при получении экстракта каланхоэ показано, что 1) в исходном экстракте эндогенные протеазы могут снизить антимикробные свойства препарата; 2) нагревание экстракта при температуре 65-700С приводит к инактивации протеаз; 3) Хранение очищенного экстракта в присутствии несоответствующих консервантов может снизить антимикробные свойства препарата; 4) Наиболее оптимальным консервантом для хранения препарата выявлено применение 0,5% хлороформа.
8. Подготовка научных публикаций и патентной заявки по теме ПНИ. В рамках проекта 1 статья была опубликована и 1 принята в печать в рецензируемых журналах, индексируемых в базе данных Web of Science:
   1. Н.С. Захарченко, Е.Б. Рукавцова, Т.В. Шевчук, О.В. Фурс, С.В. Пиголева, А.А. Лебедева, И.А. Чулина, Л.К. Байдакова, Я.И. Бурьянов. Получение и характеристика растений Kalanchoe pinnata L., экспрессирующих искусственный ген антимикробного пептида цекропина Р1. Прикладная биохимия и микробиология. 2016. Т. 52. № 4. С. 402-409.
   2. Т.В. Шевчук, Н.С. Захарченко, С.В. Тарлачков, О.В. Фурс, О.В. Дьяченко, Я.И. Бурьянов. Метилирование промотора 35S в растениях каланхоэ (Kalanchoe pinnata L.), устойчивых к канамицину и экспрессирующих трансген антимикробного пептида цекропина Р1. Биохимия. 2016 г.
   3. Подготовлена 1 патентная заявка по теме ПНИ.
9. Индустриальным партнером (ООО «ЭдиВак») и ФИБХ РАН проведено материально-техническое обеспечение выполнения экспериментальных работ этапа за счет привлекаемых внебюджетных средств, при выполнении прикладных научных исследований (проекта).

Все результаты выполнены в установленные сроки в соответствии с планом графиком исполнения обязательств и условиями технического задания Соглашения № 14.607.21.0016 о предоставлении субсидии от 5 июня 2014 г.

Руководитель проекта с.н.с., к.б.н. Захарченко Наталья Сергеевна, Лаборатория биотехнологии растений ФИБХ ИБХ (зав. лаб. д.б.н., проф. Бурьянов Ярослав Иванович).

30 июня 2016 года

Прикрепленные файлы:

<form action="" method="post" class="commentForm" id="commentForm-{0}"> <input type="hidden" name="pressId" value="1720" /> <input type="hidden" name="parentId" value="{1}" /> <input type="hidden" name="id" value="{2}" /> <txt name="comment_text" id="comment_text">{3}</txt> <input type="button" class="button" value="Комментировать" /> <a class="button" href="javascript:void(null)">Отмена</a> <span class="wait">Подождите немного...</span> <div class="clear"></div> </form>