Пресс-центр / новости / Наука /

Информация о ходе выполнения прикладных научных исследований (проекта) по Соглашению с Министерством образования и науки Российской Федерации о предоставлении субсидии от «05» августа 2014 г. №14.604.21.0104

Результаты исследований

1. Аналог природного минибактенецина козы mini-ChBac7.5Nα не обладает выраженной противоопухолевой активностью в отношении трех типов опухолевых клеток человека (клеток эритромиелоидного лейкоза человека К-562, гистиоцитарной лимфомы человека U-937, клеток промиелоцитарного лейкоза человека HL-60) – ИК50 для перечисленных клеточных линий превышают 30 мкМ. Минибактенецин козы mini-ChBac7.5Nα не проявляет значимых цитотоксических свойств для нормальных клеток человека (эритроцитов, нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови, фибробластов кожи), что свидетельствует о его безопасности и, учитывая литературные данные о других пролин-богатых пептидах, о возможности разработки на его основе соединений, служащих переносчиками лекарственных средств в опухолевые клетки.
2. Рекомбинантные антимикробные пептиды аципенсин-1 и его укороченный аналог не обладают выраженной противоопухолевой активностью в отношении трех типов опухолевых клеток человека (аденокарцинома молочной железы SKBR-3, цервикальная аденокарцинома HeLa, эпидермоидная карцинома A431) – ИК50 для перечисленных клеточных линий превышают 100 мкМ. Аципенсин-1 и его укороченный аналог не проявляют значимого цитотоксического эффекта по отношению к нормальным эмбриональным фибробластам человека (HEF), что свидетельствует об их безопасности.
3. Аципенсин-1, несущий флуоресцентную метку (Ac1-BOBIPY), проникает в опухолевые клетки (эритромиелоидный лейкоз человека К-562) in vitro и детектируется в цитоплазме. Процесс транслокации Ас1-BODIPY в клетки-мишени происходит быстро, пептид выявляется в клетках уже через 5 мин после его внесения в клеточную суспензию. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения о возможности использования аципенсинов в качестве средств доставки лекарственных препаратов в опухолевые клетки.
4. Механизм противоопухолевого действия бактенецина ChBac3.4-1 и тахиплезина I зависит от типа клеток-мишеней. С помощью двойного окрашивания клеток иодидом пропидия и конъюгатом Аннексина V-FITC показано, что клетки множественной миеломы MM1R, обработанные пептидами, погибают как по пути апоптоза, так и некроза. Тахиплезин I в более высокой концентрации (55 мкМ) вызывает преимущественно некротическую гибель, а в более низкой концентрации, близкой к ИК50, количество клеток с признаками апоптоза и некроза примерно одинаковы. В случае бактенецина ChBac3.4-1 наблюдается относительно бόльшая доля клеток с признаками некроза. Эффекты обоих пептидов на клетки эритромиелоидного лейкоза К-562 сходны – эти клетки погибают преимущественно по пути некроза, хотя апоптотические клетки тоже встречаются. Уже через 30 мин инкубации клеток-мишеней с обоими пептидами наблюдается гибель значительного количества клеток (детектируемая по включению красителя трипанового синего) при применении пептидов в концентрациях, близких к ИК50 и выше. Анализ морфологических изменений в клетках MM1R или К-562 показывает, что уже через 30 мин после добавления ChBac3.4-1 или тахиплезина I в концентрации, близкой к ИК50, в значительной части клеток выявляются выраженные деструктивные изменения, проявляются дегенеративные дистрофические изменения цитоплазмы и ядра. При более длительных сроках инкубации наблюдаются клетки с особенностями, позволяющими предположить фрагментацию ядра, сопровождающую процесс апоптоза в этих клетках.
5. Подана заявка о выдаче патента Российской Федерации на РИД: Баландин С.В., Болосов И.А., Пантелеев П.В., Кокряков В.Н., Шамова О.В., Овчинникова Т.В. Плазмидный вектор pET-mChBac75Na, штамм бактерии Escherichia coli BL21(DE3)/ pET-mChBac75Na для экспрессии антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα и способ получения указанного пептида // Заявка на патент РФ №2016123389 от 14.06.2016.
6. Наиболее перспективными прототипами с точки зрения эффективности и безопасности являются тахиплезин I и бактенецин ChBac3.4-1. АМП ChBac3.4-1 по отношению к суспензионным клеточным линиями обладал более высокой цитотоксической активностью (4,4-10,2 мкМ) для опухолевых клеток и повышенной селективностью в отношении малигнизированных клеток по сравнению с нормальными (20-100 мкМ). При этом бактенецин ChBac3.4-1 является более цитотоксичным по сравнению с природным пролин-богатым линейным пептидом бактенецином 3.4 козы и минибактенецином mini-ChBac 7.5-Nα, и в то же время более специфичным, чем бактенецин ChBac3.4-2. В экспериментах по измерению гемолитической активности ГК₅₀ составила более 64 мкМ. Тахиплезин I обладал наиболее высокой цитотоксичностью по отношению ко всем изученным опухолевым клеточным линиями (14,8–43,5 мкМ), ИК₅₀ для гомезина, ареницина I и аципенсинов было значительно выше. В то же время, гемолитическая активность тахиплезина I была выше, чем у гомезина и аципенсина-1, но ниже чем у ареницина. Величина ИК₅₀ для нормальных адгезионных клеток у тахиплезина I в 2 раза ниже, чем у гомезина.
7. В рамках выполнения прикладных научных исследований в соответствии с требованиями ГОСТ Р 15.011-96 и п. 5.2 Технического задания были проведены дополнительные патентные исследования. Объектом дополнительных патентных исследований являлся способ получения антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα, рассматриваемого в качестве прототипа нового препарата для антимикробной терапии, а также средства доставки лекарственных агентов, в том числе противоопухолевых, в клетки-мишени, способного повысить эффективность методов химиотерапии при лечении социально значимых онкологических заболеваний. На основе проведенного анализа содержания охранных документов было установлено, что полученный в рамках выполнения проекта результат интеллектуальной деятельности (изобретение «Плазмидный вектор pET-mChBac75Na, штамм бактерии Escherichia coli BL21(DE3)/ pET-mChBac75Na для экспрессии антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα и способ получения указанного пептида»), не имеет прямых аналогов в патентной и научно-технической литературе, не подпадает под действие ранее выданных патентов и является патентно-чистым. В настоящее время существует общедоступное оборудование, химические реактивы, питательные среды, ферменты и расходные материалы, позволяющие реализовывать данный способ получения антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5Nα. Было установлено, что результат интеллектуальной деятельности, полученный в ходе выполнения НИР, обладает необходимым изобретательским уровнем и, таким образом, несет все основные признаки патентоспособности.

Выполненные работы и полученные результаты полностью соответствуют требованиям пп. 3.4–3.6, 3.9, 3.10, 4.2.3, 4.2.4, 4.3.4, 4.3.5, 5.2, 5.4 Технического задания и этапа №4 Плана-графика соглашения о предоставлении субсидии №14.604.21.0104 от «05» августа 2014 года по теме прикладных научных исследований «Разработка прототипов препаратов для противоопухолевой терапии на основе антимикробных пептидов - молекулярных факторов системы врожденного иммунитета».

Проект выполняется в Учебно-научном центре ИБХ РАН.

1 июля 2016 года

Прикрепленные файлы:

<form action="" method="post" class="commentForm" id="commentForm-{0}"> <input type="hidden" name="pressId" value="1723" /> <input type="hidden" name="parentId" value="{1}" /> <input type="hidden" name="id" value="{2}" /> <txt name="comment_text" id="comment_text">{3}</txt> <input type="button" class="button" value="Комментировать" /> <a class="button" href="javascript:void(null)">Отмена</a> <span class="wait">Подождите немного...</span> <div class="clear"></div> </form>