Пресс-центр / новости / Наука /
Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 14.604.21.0110 о предоставлении субсидии от 07 августа 2014 г.
Тема проекта: «Разработка методов получения модифицированных высокоаффинных ДНК-аптамеров и создание на их основе нового эффективного средства для противоопухолевой терапии».
За отчетный период 4-го этапа в рамках выполнения соглашения были проведены следующие работы:
- оценено действие отобранных аптамеров, способных блокировать взаимодействие CD47 и SIRPa, ex vivo на культуре раковых клеток U937 в присутствии флуоресцеин-меченного рекомбинантного SIRPа;
- oценена специфичность действия отобранных аптамеров на культуре раковых клеток U937 с использованием блокирующих CD47-специфичных антител;
- проведён дополнительный раунд селекции непосредственно на клетках методом cell-SELEX с последующей регистрацией уровня взаимодействия отобранных ДНК-аптамеров с прочими гликозилированными белками, присутствующими на поверхности клеток в случае необходимости;
- отобран ДНК-аптамер, обладающий наибольшим сродством к CD47 и способностью блокировать его взаимодействие с SIRPa;
- оценена устойчивость аптамера-кандидата, отобранного на роль терапевтического агента к гидролизу в присутствии нуклеаз;
- разработаны дополнительные модификации, усиливающие стойкость аптамера к обработке нуклеазами в случае необходимости;
- получены ДНК-аптамеры с различными модификациями рибозного скелета для увеличения их стойкости к нуклеазам;
- определена константа диссоциации аптамера-кандидата на роль терапевтического агента методом поверхностного плазмонного резонанса.
В результате выполнения работ четвертого этапа работ по Соглашению № 14.604.21.0110 о предоставлении субсидии получены нижеследующие основные результаты.
- Была проведена серия экспериментов ex vivo на культурах раковых клеток для оценки терапевтического потенциала отобранных ранее вариантов модифицированных аптамеров. Поскольку основной целью терапевтического аптамера является прерывание взаимодействия между рецепторами CD47 и SIRPa, исследовалась сила блокирующего действия вариантов аптамеров в присутствии различных концентраций растворимого фрагмента SIRPa и моноклонального антитела B6H12.2, которое также обладает блокирующим действием и может конкурировать с тестируемыми аптамерами за сайт связывания с CD47.
- На обогащенных высокоаффинными последовательностями библиотеках модифицированных аптамеров было поставлено два дополнительных раунда селекции с использованием в качестве мишеней клеток U937, экспрессирующих целевой рецептор. Целью селекции был поиск альтернативных аптамерных последовательностей для терапевтического применения, чья способность связываться с CD47 лучше проявляется в условиях, приближенным к естественным. Дополнительные раунды селекции и следующая за ними идентификация наиболее представленных аптамерных последовательностей показали, что новые идентифицированные аптамеры совпадают по нуклеотидному составу с теми, которые были выявлены в ходе отбора in vitro, т.е. идентифицированные ранее аптамеры обладали наилучшими характеристиками сродства к белку-мишени среди всех представленных в аптамерной библиотеке.
- После определения пар оптимальных модифицированных аптамеров была проведена проверка их устойчивости к действию нуклеаз сыворотки, а также разработаны модификации рибозного скелета, способствующие их защите от действия нуклеаз. Было определено, что защита 5’- и 3’-концевых участков, а также введение в состав аптамера тиофосфатов приводит к существенному повышению устойчивости аптамерной молекулы к действию нуклеаз и, вероятно, является достаточным для их успешного использования in vivo.
- На основании этих данных были синтезированы ДНК-аптамеры с модификациями рибозного скелета для увеличения их стойкости к нуклеазам и методом поверхностного плазмонного резонанса определена константа диссоциации.
Проект выполняется в Группе экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки ИБХ РАН.
8 июля 2016 года