Пресс-центр / новости / Наука /

Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 14.604.21.0069 о предоставлении субсидии от 27 июня 2014 г

Тема проекта: «Создание новых рекомбинантных биокатализаторов с потенциальными фармакологическими свойствами методами комбинаторной биологии».

За отчетный период 4-го этапа в рамках выполнения соглашения были проведены следующие работы:

  • разработка лабораторной методики получения штаммов-продуцентов, наработки, выделения и очистки лучших вариантов рекомбинантных биокатализаторов; наработка экспериментальных партий лучших вариантов биокатализаторов;
  • проведение химического полисиалирования в препаративных масштабах и наработка экспериментальных партий лучших вариантов химически полисиалированных биокатализаторов;
  • проведение физико-химических исследований новых биокатализаторов;
  • проведение дополнительных патентных исследований;
  • проведение исследований биологической активности получаемых в ходе ПНИ препаратов.

В результате выполнения работ четвертого этапа работ по Соглашению № 14.604.21.0069 о предоставлении субсидии получены нижеследующие основные результаты:

  1. Подобраны условия экспрессии и очистки мутантов Fab-фрагментовантител. Оптимальным вариантом условий их наработки было принято использование для индукции стартовой плотности культуры А600=5.0, рН экспрессионной среды было равно 7.0, внесение метанола до 0,5% каждые 24 часа на протяжении трех суток и экспрессия при температуре 30оС. Максимальный уровень продукции для мутантов L-L47R и L-L47K после оптимизации составил 27 мг/л и 18 мг/л, соответственно. На основе экспериментальных данных подобраны оптимальные условия выделения и очистки лучших вариантов L-L47R и L-L47K, мутантных Fab-фрагментов, которые позволяют с достоверной воспроизводимостью получать эти препараты с чистотой не менее 95%. Получены генетические конструкции pFUSE-BChE_14-6xHis и pFUSE-BChE_23-6xHis для экспрессии мутантов 14 и 23 рекомбинантной БуХЭ в клетках линии Hek293F, получены соответствующие штаммы-продуценты мутантной БуХЭ 14_1 и 23_1. Подобраны оптимальные условия наработки, выделения и очистки лучших вариантов, 14 и 23, мутантной БуХЭ, позволяющие с достоверной воспроизводимостью получать препараты с чистотой не менее 95%. Разработана «Лабораторная методика получения штаммов-продуцентов, наработки, выделения и очистки лучших вариантов рекомбинантных биокатализаторов» на основе Fab-фрагментов антител и бутирилхолинэстеразы, представленная в комплекте отчетной документации по 4 этапу. Наработаны экспериментальные партии лучших вариантов мутантных Fab-фрагментов:
    • для мутанта L47R получено 20.8 мг препарата c чистотой не менее 95%;
    • для мутанта L47K получено 12.3 мг препарата c чистотой не менее 95%.
    Соответствующие акты (№1 и №2) о наработке экспериментальных партий мутанта L47R и L47K представлены в комплекте отчетной документации по этапу.
  2.  Проведена наработка полисиалированной бутирилхолинэстеразы БуХЭ-ПСА24 и его мутантной форма БуХЭ-14-ПСА24. Наработку вели согласно «Методике получения химически полисиалированных рекомбинантных биокатализаторов» от 15.10.2015 г. Количество наработанного препарата составило 56 мг с чистотой более 95%, при сохранении удельной активности 82% для БуХЭ-ПСА24 и 19.6 мг с чистотой более 95%, при сохранении удельной активности 72% для БуХЭ-14-ПСА24. Для полученных препаратов БуХЭ-ПСА24 и БуХЭ-14-ПСА24 составлены акты наработки, представленные в комплекте отчетной документации по этапу.
  3. Были проведены исследования по оценке физико-химических свойств биокатализаторов: каталитических антител, полученных на основании компьютерных расчетов: L-L47R и L-L47K, каталитических антител, отобранных методом скрининга комбинаторной библиотеки: клоны A17/1, A17/3, A17/4, A17/5, A17/7, A17/8, A17/12, A17/13, A17/16, A17/17 и мутантных форм бутирилхолинэстеразы: БуХЭ-14 и БуХЭ-23. Было установлено, что антитела L-L47R и L-L47K можно отнести к биологическим антидотам классического типа (не каталитическим) и их рассматривать эффективные акцепторы параоксона. Антитела L-L47R и L-L47K обладают исключительной специфичностью по отношению к параоксону, а активность L-L47K в среднем в полтора раза выше активности L-L47R, что делает антитело L-L47K лучшим кандидатом каталитического антитела для проведения биологических испытаний. Было показано, что антитела A17/1, A17/3, A17/4, A17/5, A17/7, A17/8, A17/12, A17/13, A17/16, A17/17 не обладают значимой активностью по отношению к исходному субстрату фосфонату X, а также к субстрату, использованному для отбора. Полученные данные свидетельствуют, что отобранный из комбинаторной библиотеки клон БуХЭ-14, сохраняет не только высокую связывающую активность во взаимодействии с параоксоном, но и демонстрирует способность реактивироваться после ковалентного связывания – иными словами, клон БуХЭ-14 является каталитическим антидотом.
  4. В рамках дополнительного патентного поиска «Создание новых рекомбинантных биокатализаторов с потенциальными фармакологическими свойствами методами комбинаторной биологии» обнаружено и просмотрено свыше 500 источников патентной информации, из них для дальнейшего анализа отобрано 27 охранных документа. Принятые к рассмотрению патенты описывают различные способы модификации для улучшения потребительских свойств, а также способов анализа ее активности в организме имеют высокую патентоспособность и широкое терапевтическое применение. Объект патентования – способ конъюгации тетрамерной бутирилхолинэстеразы человека и полисиаловой кислоты различных молекулярных масс для терапии отравлений фосфорорганическими соединениями – не описан ни в одном из вариантов и не является частью уже существующего решения в патентах.
  5. Были проведены эксперименты по оценке биологической активности препаратов новых биокатализаторов. Для экспериментов были использованы самки мышей, поскольку они обычно являются более чувствительными к токсическому действию веществ по сравнению с самцами. Всего в эксперименте использовали 90 особей. Все эксперименты проводили по стандартам GLP и в соответствии с руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств и по стандартам, указанным в руководстве The Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Для исследований использовались разработанные в рамках проекта препараты полисиалированной бутирилхолинэстеразы БуХЭ-ПСА24 и каталитического антитела A17 L-L47K. В результате работы были определены фармакокинетические параметры для антитела A17 L-L47K, которые составили: t1/2распр. = 10±2 ч., t1/2вывед. = 640±60 ч. Было установлено, что наиболее оптимальной дозой параоксона является доза 550 мкг/кг в присутствии 1.5 мг/кг CBDP, оптимальными концентрациями для введения были выбраны 91 мг/кг БуХЭ-ПСА24 и 61 мг/кг A17 L-L47K. Для БуХЭ-ПСА24 было установлено, все животные получившее препарат выжили, однако сохранили высокие значения клинических проявлений. В случае антитела A17 L-L47K защитная эффективность оказалось недостаточной для терапии острых отравлений параоксоном. Таким образом, использование A17 L-L47K целесообразно для терапии хронических отравлений.

Работа выполнена за счет средств Индустриального Партнера ПАО «Фармсинтез», отчет представлен отдельным документом в комплекте отчетной документации по этапу.

Все задачи четвертого этапа работ выполнены в установленные сроки в соответствии с планом-графиком исполнения обязательств и условиями технического задания Соглашения №14.604.21.0069 о предоставлении субсидии от 27 июня 2014 г.  

Порект выполняется в Лаборатрии биокатализа ИБХ РАН.

16 июля 2016 года

Прикрепленные файлы: