Пресс-центр / новости / Наука /

Опубликованы видеозаписи докладов секции В.И. Цетлина, сделанные во время объединенного Форума в Дагомысе (4-8 октября 2016 г.)

Доклады секции профессора, члена-корреспондента РАН В.И. Цетлина «Передача сигналов ионными каналами: от пространственной структуры к физиологическим механизмам», сделанные во время Форума, объединившего V Съезд биохимиков России и V Съезд физиологов СНГ в Дагомысе (4-8 октября 2016 г.), были опубликованы на странице ИБХ РАН на канале YouTube. Видеозаписи докладов, прочитанных на русском и английском языках, публикуются здесь.

ионные каналы, дагомыс, съезд биохимиков россии

Шуляк Юлия

Взаимодействие CYS-петельных ионных каналов с нейротоксинами и эндогенными модуляторами (англ.)

В.И. Цетлин, Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Среди ионных каналов, выполняющих в организме самые разнообразные роли, важное место занимают так называемые Cys-петельные рецепторы – лиганд-управляемые ионные каналы, к которым относятся никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nAChR), ионотропный подтип серотониного рецептора (5HT-3), глициновые рецепторы (GlyR), ионотропные рецепторы γ-аминомасляной кислоты ( GABA-A), а также ряд бактериальных рецепторов (GLIC, ELIC), недавние рентгеноструктурные исследования которых как в свободном виде, так и в комплексе с различными лигандами и модуляторами обеспечили быстрый прогресс в этой области. Нейротоксины различных классов (низкомолекулярные органические соединения, пептиды и белки) ранее сыграли важнейшую роль в идентификации и выделении рецепторов, а в настоящее время являются тонкими инструментами в фармакологических исследованиях рецепторов и ионных каналов, позволяя определять уровни индивидуальных подтипов одного и того же рецептора (например, мышечных и различных нейрональных nAChR) в норме и при различных патологиях – мышечных нарушениях, психических и таких нейродегенеративных заболеваниях как болезни Альцгеймера и Паркинсона. В исследованиях nAChR большую помощь оказывают α-конотоксины, нейротоксические пептиды из ядовитых моллюсков Conus, а также белковые нейротоксины из ядов змей. Анализ взаимодействий пептидых и белковых нейротоксинов с nAChR и другими Cys-петельными рецепторами позволяет получить информацию о соответствующих поверхностях связывания, необходимую для создания новых лекарств. В докладе будут суммированы недавние результаты, полученные в Отделе молекулярных основ нейросигнализации в сотрудничестве с лабораториями ИБХ и других институтов РАН, а также с зарубежными центрами в рамках международных грантов. Эти работы включали синтез более эффективных α-конотоксинов, протеомные исследования змеиных ядов и открытие новых типов трехпетельных нейротоксинов, а также анализ взаимодействия некоторых белков семейства Ly6 (имеющих пространственную структуру тоже трехпетельного типа и выполняющих роль эндогенных модуляторов nAChR) с различными Cys-петельными рецепторами.

 

Свет в модуляции функции рецептор-управляемых ионных каналов (англ.)

П.Д. Брежестовский, Институт системных нейронаук, Университет Экс-Марселя, Марсель, Франция

Фотохромные переключатели и генетически кодируемые биосенсоры произвели революцию в современных нейрофизиологических исследованиях. Эти подходы открыли беспрецедентные возможности для мониторинга и модуляции функций специфических нейронов и в буквальном смысле позволили проливать свет на выяснение механизмов функций нейрональных сетей в норме и патологии. Созданы и продолжают совершенствоваться новые светочувствительные биосенсоры для неинвазивного мониторинга ионов, ферментов и ионных каналов. Особенно важное значение для нейрофизиологии имеет создание фотохромных переключателей, регулирующих быструю тормозную синаптическую передачу в нервной системе позвоночных, которая определяется в основном ГАМКергическими и глицинергическими синапсами. Медиаторы, высвобождаемые из пресинаптических окончаний активируют расположенные постсинаптически анион-избирательные рецепторы ГАМК и глицина, нарушение активности которых приводит к таким патологиям, как эпилепсия и гиперекплексия. Каждая конкретная комбинация субъединиц этих рецепторов проявляет различные фармакологические, биофизические и функциональные свойства. Используя генетически кодируемые биосенсоры, мы ранее разработали методы для неинвазивного мониторинга активации рецептор-управляемых каналов. В последнее время совместно с химиками получены и исследованы новые типы регулируемых светом антагонистов и потециаторов. Это направление оптофармакологии, открывает новые возможности для быстрого оптического контроля цис-петельных рецепторов и, следовательно, для эффективной модуляции нейронных сетей в нервной системе позвоночных.

 

Pentameric ligand-gated ion channels functioning at the atomic resolution (англ.)

P.J. Corringer Pasteur Institute, Channel-receptor Unit, CNRS UMR 3571, 25 rue du Docteur Roux, Paris, France

Pentameric channel-receptors, including nicotinic acetylcholine, glycine and GABAA receptors, play a key role in fast excitatory and inhibitory transmission in the nervous system and are the target of numerous therapeutic and addictive drugs. They carry several neurotransmitter binding sites which govern the opening of a transmembrane ion channel. Extensively expressed in animals, they were found in several bacteria, especially the homolog from the cyanobacteria Gloeobacter violaceus (GLIC) which functions as a proton-gated ion channel. The simplified architecture of this archaic homologue, as well as its prokaryotic origin, allowed solving its X-ray structure in two closed and one open conformation. Those static structures suggest that channel opening occurs through symmetrical quaternary twist and “blooming” motions, together with tertiary deformation, according to a global transition that couples channel opening with reorganization of the binding pockets for neurotransmitters and allosteric effectors. To investigate the dynamics of the protein, we further engineered multiple fluorescent reporters, each incorporating a bimane and a tryptophan/tyrosine, whose close contact causes fluorescence quenching. We show that proton application causes a global compaction of the extracellular subunit interface, coupled to an outward motion of the M2-M3 loop near the channel gate, and that these movements are highly conserved in lipid vesicles and detergent micelles. Real-time recordings show that most structural reorganizations are completed within 2ms, much faster than channel opening. Our work thus identifies and structurally characterizes a new pre-active intermediate state in the transition pathway towards activation. Altogether, these combined structural and functional data give insights into the allosteric mechanisms operating in these integral membrane proteins, and pave the way for the rational design of new classes of allosteric modulators.

 

Modulation of glutamate receptor function by interacting membrane-resident proteins (англ.)

Michael Hollmann, Department of Biochemistry I - Receptor Biochemistry, Ruhr University Bochum, Bochum, Germany & NIH/NICHD, Bethesda, MD, USA.

Although ionotropic glutamate receptors (iGluRs) are able to function as tetrameric complexes on their own, many interacting and modulating auxiliary subunits have been identified over the last 15 years. Some of them influence biophysical properties of iGluRs, others modulate the trafficking of the receptors to the plasma membrane, and still other do both. The most commonly known auxiliary proteins are the transmembrane AMPA receptor regulatory proteins (TARPs), the cornichon homologs (CNIH), and the neuropilin- and tolloid-like proteins (NETOs). We used two different heterologous expression systems, Xenopus oocytes and HEK-293 cells, to characterize another class of proteins that modulate AMPA receptor function. We show that certain members of the claudin family, which have high structure and sequence homology with the TARP proteins, act as AMPAR modulators. Claudins are generally known as tight junction proteins that seal passageways within and in between plasma membranes. Of the 22-24 different claudin genes identified in rat, mouse, and humans, few have been functionally characterized. We show that claudin-20 and claudin-24 potentiate the current amplitude and modulate the desensitization of certain AMPA receptors. Other iGluR subtypes such as NMDARs and kainate receptors are not affected, and other claudins do not show this modulatory action. Amplitude potentiation was seen with GluA1 and GluA2 receptors, with effects being more pronounced with flip than with flop splice variants and with R than with Q editing variants. We further show that both claudin-20 and claudin-24 are expressed in the brain, particularly in the granule cell layers of the cerebellum and the olfactory bulb, with claudin-24 in addition found at low levels in principal cells of the hippocampus. Moreover, using FRET after acceptor bleaching, we demonstrated that claudin-20 interacts directly with GluA1. In summary, we identified an unexpected new class of AMPAR modulators that show exquisitely editing variant-specific effects, which are reminiscent of the properties of the type II-TARP g5.

 

3D-structure and allostery of pentameric ligand-gated ion channel (англ.)

P.J. Corringer Pasteur Institute, Channel-receptor Unit, CNRS UMR 3571, 25 rue du Docteur Roux, Paris, France

 

Токсины пауков, воздействующие на потенциал-чувствительные натриевые каналы (англ.)

А.A. Василевский, Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Пауки производят, вероятно, самые богатые яды на Земле. Поскольку функция ядов состоит в парализации добычи и отпугивании агрессоров, неудивительно, что потенциал-чувствительные натриевые каналы зачастую выступают мишенью токсинов пауков. Тем не менее, существует большое разнообразие таких токсинов, с точки зрения как специфичности, так и механизма их действия. Например, некоторые токсины пауков воздействуют на различные натриевые каналы с близкой эффективностью, в то время как другие селективны к каналам насекомых, будучи совсем не активными в отношении млекопитающих. Такие специфичные инсектотоксины, как полагают, являются потенциально безопасными биоинсектицидами. Токсины пауков могут выступать поровыми блокаторами или воздействовать на воротные механизмы натриевых каналов. Среди модификаторов воротных механизмов мы находим токсины, облегчающие или ингибирующие активацию, а также ингибиторы инактивации каналов. Эти эффекты, как полагают, связаны с конкретными частями каналов (так называемыми рецепторными сайтами), с которыми токсины связываются и за счет чего влияют на ворота определенным образом. Удивительно, но мы также знаем примеры, когда токсины пауков воздействуют одновременно как на активацию, так и на инактивацию натриевых каналов. Совсем недавно мы обнаружили, что ингибиторы активации натриевых каналов из яда пауков показывают многообещающую активность против мутантных каналов, ассоциированных с гипокалиемическим периодическим параличом. Токсины пауков блокируют так называемые «токи через воротную пору» в этих каналах и, таким образом, предоставляют интересные возможности для терапии.

Токсины пауков, воздействующие на потенциал-чувствительные натриевые каналы А.A. Василевский, Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва Пауки производят, вероятно, самые богатые яды на Земле. Поскольку функция ядов состоит в парализации добычи и отпугивании агрессоров, неудивительно, что потенциал-чувствительные натриевые каналы зачастую выступают мишенью токсинов пауков. Тем не менее, существует большое разнообразие таких токсинов, с точки зрения как специфичности, так и механизма их действия. Например, некоторые токсины пауков воздействуют на различные натриевые каналы с близкой эффективностью, в то время как другие селективны к каналам насекомых, будучи совсем не активными в отношении млекопитающих. Такие специфичные инсектотоксины, как полагают, являются потенциально безопасными биоинсектицидами. Токсины пауков могут выступать поровыми блокаторами или воздействовать на воротные механизмы натриевых каналов. Среди модификаторов воротных механизмов мы находим токсины, облегчающие или ингибирующие активацию, а также ингибиторы инактивации каналов. Эти эффекты, как полагают, связаны с конкретными частями каналов (так называемыми рецепторными сайтами), с которыми токсины связываются и за счет чего влияют на ворота определенным образом. Удивительно, но мы также знаем примеры, когда токсины пауков воздействуют одновременно как на активацию, так и на инактивацию натриевых каналов. Совсем недавно мы обнаружили, что ингибиторы активации натриевых каналов из яда пауков показывают многообещающую активность против мутантных каналов, ассоциированных с гипокалиемическим периодическим параличом. Токсины пауков блокируют так называемые «токи через воротную пору» в этих каналах и, таким образом, предоставляют интересные возможности для терапии.

 

Новые свойства классических токсинов (англ.)

Ю.Н. Уткин, Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Фосфолипазы A2 (ФЛА2) и трех-петельные токсины (ТПТ) представляют собой наиболее многочисленные семейства белков змеиных ядов. Они проявляют различные виды биологической активности, набор которых постоянно расширяется. В поисках новых эффекторов никотиновых холинорецепторов (нХР), мы изучали способность ФЛА2 из разных змей блокировать ответы нейронов прудовика на ацетилхолин или цитизин и ингибировать связывание α-бунгаротоксина с нХР и ацетил-холин-связывающими белками (АСБ). Было установлено, что ФЛА2 ядов степной гадюки и гадюки Никольского, кобры Naja kaouthia и крайта Bungarus fasciatus из разных семейств змей неконкурентного подавляли токи в нейронах прудовика и конкурировали с α-бунгаротоксином за связывание с нХР мышечного и нейронного α7-типов, а также с АСБ. Наблюдаемые эффекты не зависели от фосфолиполитической активности. Поскольку содержание ФЛА2 в ядах достаточно высоко, обнаруженная активность может способствовать пагубному действию ядов. Полученные данные свидетельствуют о том, что способность взаимодействовать с нХР может быть общим свойством ФЛА2 змеиного яда. Ионотропные рецепторы γ-аминомасляной кислоты (ГАМКР) являются членами семейства Cys-петельных рецепторов, которое включает в себя также нХР. Они регулируют торможение нейронов и являются мишенью бензодиазепинов и общих анестетиков. Во время поиска новых лигандов ГАМКР, мы обнаружили, что ТПТ α-кобратоксин (α-Ctx), классический блокатор нХР, полностью блокировал ГАМК-индуцированные токи в рецепторах α1β3γ2 типа, экспрессированных в ооцитах Xenopus (IC50 = 236 нМ) и с меньшей активностью ингибировал ГАМКР α1β2γ2 ≈ α2β2γ2 больше α5β2γ2 больше α2β3γ2 и α1β3δ типов. Рецептор α1β3γ2 типа также ингибировался некоторыми другими ТПТ, включая α-нейртоксины длfинного типа α-бунгаротоксин и Ls III, а также нетрадиционный токсин WTX. Электрофизиологические эксперименты выявили смешанный конкурентный и неконкурентный тип ингибирования α-CTX. Моделирование и молекулярно-динамические исследования показали, что α-Ctx взаимодействует с ГАМКР таким же образом, как он взаимодействует с лиганд-связывающим доменом нАХР. Таким образом, даже очень хорошо изученные змеиные токсины могут демонстрировать новые неожиданные свойства.

 

Актин-управляемые натриевые каналы в электроневозбудимых клетках (англ.)

А.В. Сударикова, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия

В последние годы появляются новые данные, свидетельствующие о значимости потенциал-независимых натриевых каналов для регуляции клеточных функций и передачи сигнала. В различных клетках неэпителиального происхождения, в том числе, клетках крови найдены натрий-селективные каналы, активность которых критически зависит от состояния актинового цитоскелета. Нами показана и детально изучена функциональная связь натриевых каналов с динамикой примембранного актина в клетках лейкемии человека К562. В клетках лимфомы U937 активность каналов также регулировалась разборкой и сборкой микрофиламентов. В то же время неизвестна молекулярная природа натриевых каналов, которые на основании цитоскелет-зависимого механизма активации и инактивации могут быть названы «актин-управляемыми». Работа направлена на определение возможных молекулярных коррелятов каналов и их функциональной роли в клетках лейкемии человека К562 и лимфомы U937. Ранее нами показана экспрессия на уровне мРНК альфа-, бета, гамма-hENaC, TRPM4 в клетках К562 и U937. В патч-кламп экспериментах определены биофизические характеристики натриевых каналов: они характеризуются проводимостью 10–12 пСм (145 мМ Na+), непроницаемы для двухвалентных катионов (Ca2+ и Mg2+), не блокируются амилоридом. Выявлена активация каналов при внеклеточном действии трипсина, аналогичный эффект ранее показан для каналов ENaC почки. Электрофизиологические тесты, включая отсутствие кальций-зависимой активации, не дают аргументов в пользу TRPM4 как возможного прототипа исследуемых каналов. Полученные результаты позволяют предположить, что это амилорид-нечувствительные каналы ENaC. Функциональная экспрессия альфа-субъединицы ENaC подтверждена с помощью иммуноцитохимических подходов. С использованием анионного красителя DiBAC4(3) проанализировано участие исследуемых каналов и актинового цитоскелета в регуляции мембранного потенциала в клетках лейкемии человека. Выявлен интересный эффект натрий-зависимой деполяризации при механической стимуляции мембраны протоком жидкости. Активация каналов при разборке цитоскелета, вероятно, вносит вклад в деполяризацию плазматической мембраны.

 

Молекулярные механизмы неоднородности депо-управляемого входа кальция в клетки (рус.)

А.В. Шалыгин, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия

Депо-управляемые каналы плазматической мембраны активируются при опустошении внутриклеточных кальциевых де-по. Эти каналы играют важную роль в кальциевом гомеостазе клеток, а нарушения в их работе связаны с различными заболеваниями. Молекулярный состав и регуляция этих каналов остаются недостаточно изученными. Методом локальной фиксации потенциала в конфигурации, где регистрируются токи через отдельные каналы, мы продемонстрировали, что в клетках могут сосуществовать несколько типов депо-управляемых каналов. Так в клетках А431 и НЕК293 нами были охарактеризованы три типа кальциевых каналов: малоселективные каналы Imax с проводимостью 17 пСм, неселективные каналы INS с проводимостью 4,5 пСм и высокоселективные каналы Imin с проводимостью 1,2 пСм. Следующей задачей было определить, отличается ли молекулярный состав этих каналов. Известно два семейства белков, участвующих в формировании депо-управляемых каналов: белки ORAI и TRPC. Мы обнаружили, что каналы Imax состоят из белков TRPC1 (причем белки ORAI не входят в состав поры), белки TRPC3 являются регуляторной субъединицей каналов INS. Были получены данные, указывающие на участие белков ORAI в формировании каналов Imin, белки TRPC1 и TRPC3 не влияли на каналы Imin. Основными активаторами депо-управляемых каналов являются кальциевые сенсоры эндоплазматического ретикулума белки семейства STIM. У млекопитающих есть два гомолога: белки STIM1 и STIM2, с разной чувствительностью к концентрации кальция в депо. Неизвестно, отличается ли регуляция различных типов депо-управляемых каналов белками STIM1 и STIM2. Нами были поставлены опыты на клетках с увеличением или уменьшением экспрессии белков STIM1 и STIM2, а также селективной активации эндогенных сенсоров. Было обнаружено, что каналы Imax (TRPC1) активируются белками STIM1 и STIM2, каналы INS (TRPC3) только белком STIM1, каналы Imin регулируются белком STIM2. Таким образом, в клетке сосуществуют депо-управляемые кальциевые каналы с различным молекулярным составом, электрофизиологическими характеристиками и разными внутриклеточными регуляторами. Можно предположить, что это позволяет клеткам формировать множество кальциевых ответов, которые запускают большой спектр клеточных процессов.

 

Природные низкомолекулярные компоненты, модулирующие работу кислоточувствительных ионного канала 3-го типа (рус.)

Д.И. Осмаков, Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Кислоточувствительные ионные каналы или ASICs (acid-sensing ion channels) – тримерные мембранные белки, относящиеся к семейству дегенерин/эпителиальных Na+-каналов. Один из представителей данного типа каналов, ASIC3 рецептор, широко представлен в нейронах периферической нервной системы и играет важную роль в процессе восприятия болевых стимулов при различных физиологических и патологических процессах. Использование природных низкомолекулярных лигандов является одним из эффективных методов изучения функционирования данных каналов не только в фундаментальном плане, но и в практическом, т.к. позволяет разрабатывать новые препараты направленного действия. Лекарственные растения с давних времен известны как богатый источник разнообразных биологически активных соединений – лигандов тех или иных рецепторов или ферментов. Из растений видов Thyms armeniacus и Laurus nobilis нами были выделены низкомолекулярные модуляторы работы каналов ASIC3 типа. В первом случае – это впервые открытое нами соединение севанол, подавляющее работу ASIC3 в микромолярных концентрациях и обладающее противоболевым и противовоспалительным эф-фектом в тестах на мышах. Структурно-функциональный анализ, проведенный на севаноле и его структурных аналогах, полученных химическим синтезом, продемонстрировал влияние тех или иных групп молекулы на активность по отношению к рецептору. В случае с L. nobilis – это потенциатор, в микромолярных концентрациях более чем в три раза усиливающий работу только человеческих ASIC3, не оказывая эффекта на ASIC3 грызунов, несмотря на высокую степень идентичности.

 

Новые природные и синтетические холинергические лиганды в структурно-функциональных исследованиях Cys-петельных рецепторов и как база для клинической практики (рус.)

И.Е. Кашеверов, Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Семейство Cys-петельных рецепторов является сегодня одним из наиболее изученных среди мембранных ионных каналов, благодаря наличию богатого природного источника одного из представителей – никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР) электрических органов рыб, обнаружению более простых структурных гомологов, а также открытию большого количества лигандов. Современные исследования этих рецепторов нацелены на выяснении структурных различий между их разными представителями и подтипами и анализе влияния этих различий на фармакологические свойства. При этом часто используются два подхода – применение гомологов рецепторов и поиск или создание новых активных и селективных лигандов. Мы использовали в работе такой известный структурный гомолог нАХР как ацетилхолин-связывающий белок (АХБ), а также оценили лиганд-связывающие возможности модифицированного фрагмента петли С рецептора (high affinity peptide). Кристаллическая структура АХБ в комплексе с α-конотоксином GIC (токсическим пептидом из яда Conus geographus, высоко селективным ингибитором α3β2 нАХР) позволила предложить аминокислотные остатки данного рецептора, определяющие его высокое сродство к этому лиганду. Синтез серии аналогов α-конотоксина GIC и исследование их активности на α3β2 нАХР подтвердили эти предположения. Конструирование аналогов другого α-конотоксина PnIA, направленное на создание мощных и селективных лигандов для α7 нАХР, было проведено с использованием расчетного метода PST (protein surface topography). Три аналога с [A9R]-мутацией показали высокое сродство к α7 нАХР, а радиоактивная форма одного из них связывалась с α7 нАХР с Kd = 1.3 нM и может использоваться как маркер этого рецептора. Хорошие перспективы для практического применения показал блокатор мышечных нАХР – пептид аземиопсин, открытый нами недавно в яде бирманской гадюки. Как таковой, он сейчас проходит стадию доклинических испытаний в качестве миорелаксанта местного применения, а его модифицированный фрагмент уже прошел успешную апробацию как агент для уменьшения мимических морщин. Клинический потенциал могут иметь и некоторые алкалоиды из морских беспозвоночных, которые также показали способность взаимодействовать с определенными подтипами нАХР (например, выявленный нами новый агонист α7 нАХР – 6-бромогипафорин).

 

Моделирование температурной активации ионного канала TRPV1 методом молекулярной динамики (англ.)

А.О. Чугунов, Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Жарочувствительный ионный канал TRPV1 — один из наиболее изученных эукариотических белков, отвечающих за температурное чувство. При нагревании больше 43 °C, он быстро, но обратимо открывает пору, проницаемую для ионов Ca2+, что приводит к деполяризации нейронов и запускает распространение потенциалов действия. Лежащие в основе этого молекулярные механизмы и конформационная перестройка пóрового домена канала представляют несомненный теоретический и прикладной интерес, поскольку дают возможность влиять на терморегуляцию всего организма. Несмотря на то, что структуры открытого (О) и закрытого (З) состояния канала были недавно получены методом криоэлектронной микроскопии, тонкие детали перехода между этими состояниями остаются непонятыми. В этой работе мы используем молекулярную динамику центральной части канала TRPV1 (без N-концевых анкириновых повторов и C-концевого цитоплазматического участка) в явно заданной липидной мембране, чтобы изучить конформационные особенности О- и З-состояний, а также переходов между ними, которые наблюдаются в рассчитанных траекториях МД благодаря длительному времени расчета (в сумме около 10 мкс), а также нескольким повторным расчетам при разных температурах (как ниже, так и выше температуры активации). Обнаружилось, что поровый домен и близлежащие петли претерпевают существенную перестройку в зависимости от температуры, причем эффект асимметричный — его можно приписать главным образом одной субъединице канала из четырех, что слегка отличается от общепринятой модели «диафрагмы» открывания ионных каналов. Анализ структурных, динамических и гидрофобных параметров поры канала в процессе активации показал рост конформационной энтропии, что находится в соответствии с современными идеями температурной чувствительности белков.

 

Структурные исследования потенциалчувствительных доменов катионных каналов: от взаимодействия с лигандами до термодинамики фолдинга мембранных белков in vitro (англ.)

З.О. Шенкарев, Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Потенциалозависимые К+ и Na+ каналы (Kv и Nav) играют важную роль в функционировании сердечно-сосудистой, нервной и мышечной систем организма, в частности, отвечая за проведение нервного импульса. Нарушение работы этих каналов приводит к развитию ряда заболеваний, например, судорожных расстройств, периодического паралича, миотонии, атаксии, аритмий, мигрени и хронической боли. Потенциалозависимые каналы имеют гомологичное модульное строение и состоят из четырех одинаковых субъединиц (Kv) или четырех псевдо-субъединиц в составе слитной полипептидной цепи (Nav), окружающих ионную пору. Каждая из (псевдо-)субъединиц включает в себя потенциалочувствительный (рецепторный) домен (ПЧД, ~150 а.о.), сформированный четырьмя трансмембранными спиралями (S1-S4), и фрагмент (S5-S6), участвующий в формировании поры. На ПЧД локализованы сайты связывания природных и синтетических соединений, влияющих на потенциалозависимую активацию, например, «вольт-сенсорных» токсинов. ПЧД рассматриваются как перспективные мишени для биомедицинских препаратов, селективно модулирующих работу отдельных каналов. Модульная организация Kv и Nav каналов позволяет предположить, что в некоторых случаях задачи их изучения могут быть упрощены и сведены к исследованию фрагментов, содержащих изолированные ПЧД. В докладе приводятся результаты структурных исследований ПЧД каналов KvAP, Kv2.1 и Nav1.4 методом 1H,13C,15N-ЯМР спектроскопии. Полученные результаты позволили охарактеризовать пространственную структуру доменов в различных мембраноподобных средах, а также описать характерные модели внутримолекулярной подвижности свойственной этим белкам на двух временных диапазонах (пс-нс и мкс-мс). ЯМР исследования позволили описать молекулярные механизмы взаимодействия мембраноактивных «вольт-сенсорных» токсинов пауков с ПЧД. Изучение термодинамики фолдинга ПЧД-KvAP в средах на основе мицелл детергентов позволило впервые детально охарактеризовать процесс холодовой денатурации для спирального мембранного белка. Ранее «парадоксальный» процесс холодовой денатурации был описан только для глобулярных (водорастворимых) белков.

15 февраля