Пресс-центр / новости / Наука /

Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 14.616.21.0009 о предоставлении субсидии от 17 сентября 2014 г. по теме «Сочетание синхротронных излучателей с лазерами на свободных электронах для структурно-функционального изучения объектов молекулярной медицины как пример создания принципиально новых междисциплинарных синергий»

Итоговый отчет по проекту Минобрнауки России по теме «Сочетание синхротронных излучателей с лазерами на свободных электронах для структурно-функционального изучения объектов молекулярной медицины как пример создания принципиально новых междисциплинарных синергий».

За отчетный период 6-го этапа в рамках выполнения соглашения были проведены следующие работы:

изучена термодинамика взаимодействия каталитических антител с лигандами;

определен механизм взаимодействия каталитических антител с их лигандами методом быстрой кинетики;

проведен анализ нейтрализующей активности каталитических антител по отношению к фосфорорганическим соединениям;

проведены дополнительные патентные исследования;

проведен анализ адгезии раковых клеток человека в потоке жидкости с различными вариантами селектинов in vitro;

проведено обобщение и оценка результатов исследований;

работы по проекту, выполненные иностранным партнером:

разработан протокол обработки данных методом «On-The-Fly»;

проведено снижение размера пучка на лучевой линии P14;

проведен анализ кинетики взаимодействия рекомбинантных белков семейства иммуноглобулинов с лигандами методом фемта-секундной кристаллографии.

В результате выполнения работ шестого этапа работ по Соглашению № 14.616.21.0009 о предоставлении субсидии получены нижеследующие основные результаты.

1. Проведены исследования взаимодействия вариантов каталитического антитела А5 с каппа- и лямбда-изотипом константного домена легкой цепи с арил-фосфонатом в диапазоне температур от 10°С до 30°С. Определены термодинамические параметры процесса – энтальпия, энтропия, свободная энергия и энергия активации реакции.

2.       Для детализации механизма реакции антитела А5 с арил-фосфонатом созданы триптофановые мутанты L-R51W и H-F100W, как с каппа-, так и лямбда-изотипом константного домена легкой цепи. Установлено, что эффективность их взаимодействия с субстратом сравнима с антителом дикого типа. Методом быстрой кинетики определено, что реакция протекает по механизму индуцированного соответствия, рассчитаны кинетические параметры элементарных стадий процесса.

3.       Исследована нейтрализующая активность мутантного каталитического антитела L-S35R по отношению к пестициду параоксон при моделировании острого отравления в мышах линии BALB/c. Определены фармакокинетические параметры: время полураспределения и полувыведения препарата L-S35R, – установлено, что терапевтического эффекта недостаточно, чтобы устранить летальное действие параоксона. Отсутствие токсичности L-S35R свидетельствует о возможности нейтрализации параоксона при хронических отравлениях.

4. Проведены дополнительные патентные исследования по теме ингибиторы и клиническая значимость селектинов и Fra-2. Показано, что дальнейшие исследования и практические разработки в области определения структуры селектинов и Fra-2 являются своевременными и перспективными, а патентование их ингибиторов, способов их получения и методик измерения их биологической активности, а также использования селектинов в диагностических целях является целесообразным.

5. В ходе проведенных исследований было показано, что различные раковые клетки могут по-разному связываться с мышиными и человеческими селектинами, что необходимо учитывать и проверять при исследовании экстравазации человеческих раковых линий в ксенографтных мышиных моделях. Были исследованы раковые клеточные линии MDA-MB-231, MCF7, DU4475 и HT29, полученные данные об адгезии клеток соответствующих линий на Е- и Р-селектинах соответствуют данным, имеющимся в литературе.

6. В соответствии с п.3.1.17 требований к выполняемым работам ТЗ данного Соглашения проведено обобщение и оценка результатов исследований.

7. Иностранным партнером при проведены работы по оптимизации протокола обработки данных (“On-the-fly”) в связи с увеличением производительности системы. Была оптимизирована работа программного обеспечения DOZOR для оценки интенсивности дифракционного сигнала. В результате на вычислительных серверах, доступных на P14 была достигнута скорость обработки 500 кадров в секунду (4M ROI). Таким образом, в настоящее время весь 96-луночный планшет CrystalDirect можно сканировать в течении 1-2 минут, полученные данные интегрируются в тепловую карту через 1 минуту после завершения сканирования SSX.

8. Иностранным партнером получены следующие результаты по снижению пучка. Используя трансфокатор белого пучка с составными рефракционными линзами (CRL), были установлены новые стандартные условия микрофокусировки луча для проведения поточной (серийной) кристаллографии (SSX). Это позволило увеличить микрофокусированный поток на линии Р14 до максимального значения 1,5×10^13 фотонов в секунду. При этом были достигнуты размеры фокального пятна 6x10 мкм^2.

 

9. Иностранным партнером при проведении анализа кинетики взаимодействия рекомбинантных белков было установлено, что скорости каталитической реакции осуществляемые антителами A17, A5 и их мутантами, соответствуют анализу с применением поточной кристаллографии при насыщении кристаллов субстратом. Для перехода на источники X-FEL была разработана процедура получения микрокристаллов антитела А17. Разработанные в ходе исследования методики анализа применимы для изучение каталитических процессов как каталитическими антителами, так и ферментами.

Все задачи шестого этапа работ выполнены в установленные сроки и в соответствии с планом-графиком исполнения обязательств, условиями технического задания Соглашения № 14.616.21.0009 о предоставлении субсидии от 17 сентября 2014 г.

9 января 2018 года