Пресс-центр / новости / Наука /

Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению о предоставлении субсидии № 14.607.21.0156 от 3 октября 2016 г. по теме «Создание высокоаффинных Т-клеточных рецепторов на основе одноцепочечных антител для нацеленной иммунотерапии злокачественных новообразований».

Этап №2 (промежуточный) проекта Минобрнауки по соглашению о предоставлении субсидии № 14.607.21.0156 от 03.10.2016 г.

В ходе реализации проекта «Создание высокоаффинных Т-клеточных рецепторов на основе одноцепочечных антител для нацеленной иммунотерапии злокачественных новообразований» по Соглашению о предоставлении субсидии № 14.607.21.0156 от 03.10.2017 г. Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно- технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на 2 этапе работы в период с 1 января по 31 декабря 2017 года были выполнены следующие работы:

1. Подобраны оптимальные условия культивации и экспансии Т-лимфоцитов для проведения трансдукции экспрессионной кассеты с химерным рецептором и последующего получения противоопухолевой клеточной популяции

2. Разработан План исследований 

3. Протестированы варианты химерных рецепторов, отличающихся структурой активирующего эндодомена

4. Получена неимунная библиотека одноцепочечных фрагментов антител альпаки высокой сложности 

5. Поставлен рибосомный дисплей для проведения in vitro селекции и обогащения библиотек наиболее аффинными фрагментами VHH-антител на модельном антигене MUC1

6. Проведены раунды паннинга с контролем обогащения библиотек аффинными фрагментами, проведено секвенирование обогащенных пулов и отобраны наиболее перспективные последовательности VHH-фрагментов антител

7. Экспрессированы отобранные VHH-фрагменты в виде растворимых фрагментов, слитых с эпитопом Myc, очищены и протестированы на связывание с целевым антигеном

8. Протестированы полученные фрагменты антител на специфичность связывания с антигеном в составе CAR на панели клеточных линий рака молочной железы

9. Осуществлен биоинформатический анализ результатов секвенирования, идентификацированы потенциальные опухолевые антигены

10. Данные глубокого секвенирования подтверждены таргентным секвенированием, ПЦР и иммунохимическими методами

11. Созданы ДНК конструкции для рекомбинантной экспрессии идентифицированных антигенов

12. Протестированы способности трансгенных Т-лимфоцитов с введенным химерным рецептором подавлять рост опухолевых клеток in vitro, на модельном антигене ERBB2

13. Протестированы способности CAR-экспрессирующих Т-лимфоцитов подавлять рост опухоли in vivo, на мышиной модели, на модельном антигене ERBB2

14. Протестированы способности CAR-экспрессирующих Т-лимфоцитов служить носителями для доставки онколитических вирусов к опухолям на мышиной модели in vivo

15. Разработаны Программа и методика испытаний экспериментальных образцов (ЭО)

16. Проведены испытания ЭО по ПМ

17. Проведены дополнительные патентные исследования 

18. Проведено секвенирование экспрессионных конструктов

19. Осуществлен контроль сложности наивной библиотеки фрагментов VHH- антител путем глубокого секвенирования

20. Определена аффинность полученных фрагментов VHH-антител к антигену MUC1 методом поверхностного плазмонного резонанса

При этом были получены следующие основные результаты:

Подобраны оптимальные условия культивации и экспансии Т- лимфоцитов для проведения трансдукции экспрессионной кассеты с химерным рецептором и последующего получения противоопухолевой клеточной популяции. Для этого оценен уровень экспансии и жизнеспособности клеток в зависимости от питательной среды (RPMI1640, AIM-V, DMEM/F12) и наличия ростовых факторов, в частности, цитокинов IL-2 и IL-7. В результате, за оптимальные условия была принята культивация в среде AIM-V с добавлением IL-2 и IL-7 в конечной концентрации 5 и 10 нг/мл соответственно.  Для отработки трансдукции вектора, экспрессирующего химерный рецептор, созданы генетические конструкции, где экспрессия контролировалась промоторами разной силы.  Протестированы варианты химерных рецепторов, отличающихся структурой активирующего эндодомена, выбран вариант эндодомена, содержащий активирующие сигналы  CD3xeta, CD137 и CD28. Произведено секвенирование лентивирусных генетических конструкций, экспрессирующих химерный рецептор под промоторами различной силы. Все конструкции признаны корректными. Получена неимунная библиотека одноцепочечных фрагментов антител альпаки сложностью 3.5x10^8. На модельном антигене MUC1 поставлен рибосомный дисплей для проведения in vitro селекции. Проведено 6 раундов паннинга с контролем обогащения библиотек аффинными фрагментами VHH-антител, после чего секвенированы образцы из 3 последних раундов, по результатам отобраны наиболее перспективные последовательности. Методом плазмонного резонанса показана высокая аффинность фрагментов VHH-антител  к MUC1. VHH-фрагменты экспрессированы, очищены и протестированы на связывание с антигеном на клеточных линиях рака молочной железы. Проведено глубокое секвенирование наивной библиотеки фрагментов VHH- антител и оценена её сложность.  После биоинформатического анализа результатов секвенирования идентифицированы потенциальные опухолевые антигены, для экспрессии которых созданы ДНК-конструкции. На антигене ERBB2 показана способность трансгенных Т-лимфоцитов с введенным химерным рецептором подавлять рост опухолевых клеток in vitro. CAR- экспрессирующие Т-лимфоциты способны подавлять рост опухоли и служить носителями для доставки онколитических вирусов к опухолям in vivo на мышиной модели.   

Выполненные работы и полученные результаты полностью соответствуют требованиям Технического задания и Плана-графика Соглашения о предоставлении субсидии № 14.607.21.0156 от 03.10.2016 г.

9 января 2018 года

Прикрепленные файлы: