Пресс-центр / новости / Наука /

Научные достижения ИБХ РАН в 2014 году

На заседании Ученого Совета ИБХ РАН 28 января 2015 г. были представлены результаты научной деятельности подразделений Института за 2014 год. Ниже приведены краткие аннотации научных достижений, представленные руководителями подразделений (все материалы приведены в авторской редакции).

достижения ИБХ, отчёт

Григоров Артем

Лаборатория биомолекулярной ЯМР спектроскопии, Отдел биоинженерии - Структурно-функциональное исследование трансмембранного домена рецептора VEGFR-2

Рецеторная тирозинкиназа VEGFR-2 из семейства рецепторов васкулярных эндотелиальных ростовых факторов регулирует процессы ангиогенеза и является одной из ключевых мишеней для противоопухолевых препаратов. В рамках проекта было проведено структурно-функциональное исследования роли трансмембранного (ТМ) домена рецептора в процессах его активации. Были найдены мутации в ТМ домене, способные вызывать лиганд-независимую активацию VEGFR-2, а также VEGFR-2 с делегированным внеклеточным доменом. Были определены пространственные структуры димера ТМ домена VEGFR-2 дикого типа, тримера ТМ домена VEGFR-2 V769E, а также димера ТМ домена VEGFR-2 G770E/F778E. Для проведения детального сравнения полученных структур была разработана методика для измерения свободной энергии ассоциации ТМ спиралей в мицеллярных средах методами ЯМР спектроскопии высокого разрешения, что позволило для всех трех объектов измерить величины свободной энергии димеризации, и, где возможно, тримеризации.  На основании данных мутагенеза, ЯМР-спектроскопии и полученных пространственных структур был предложен механизм активации VEGFR-2, подразумевающий существование неактивного димерного состояния рецептора.

  1. Mineev K.S., Lesovoy D.M., Usmanova D.R., Goncharuk S.A., Shulepko M.A., Lyukmanova E.N., Kirpichnikov M.P., Bocharov E.V., Arseniev AS. NMR-based approach to measure the free energy of transmembrane helix-helix interactions. Biochim. Biophys. Acta. 1838 (2014), 164-172.
  2. Manni S., Mineev K.S., Usmanova D.R., Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Kirpichnikov M.P., Winter J., Matkovic M., Deupi X., Arseniev A.S., Ballmer-Hofer K. Structural and functional characterization of alternative transmembrane domain conformations in VEGF receptor 2 activation. Structure 22 (2014), 1077-1089.

Лаборатория оксилипинов, Лаборатория биологических испытаний - Новые гибридные соединения на основе простагландинов с сочетанным нейрозащитным и противовоспалительным действием

Впервые синтезированы гибридные биологически активные соединения, в структурах которых соединены молекулы простамида E2, его аналога с гамма-аминомасляной кислотой, а также природного простагландина E2 и дофамина. В отличие от простагландина E2 эти соединения обладают выраженным противовоспалительным эфф ектом in vitro и in vivo и оказывают нейрозащитное действие на клеточных моделях. Дофаминамид простагландина E2 проявляет также анальгезирующее действие, способность увеличивать локальный мозговой кровоток и уменьшать зону поражения головного мозга крыс в модели ишемического инсульта. Это вещество – перспективный кандидат для создания нового противоишемического препарата.

Лаборатория биокатализа

Установлено, что МВР принадлежит к крайне малочисленной группе белков, способных подвергаться протеолизу 26S протеасомой в отсутствии молекул убиквитина

Рассеянный склероз (РС) – это системное аутоиммунное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы человека, характеризующееся множественными повреждениями белого вещества. Среди главных аутоантигенов при РС выделяют несколько белков миелиновой оболочки, в том числе оснóвный белок миелина (MBP), в значительных количествах присутствующий в мембране олигодендроцитов. В процессе метаболизма внутриклеточный протеолиз MBP может происходить под действием различных протеаз, а также мультикаталитического протеиназного комплекса – протеасомы. Абсолютное большинство белков разрушаются 26S протеасомой по убиквитин-зависимому пути. Нами было установлено, что МВР принадлежит к крайне малочисленной группе белков, способных подвергаться протеолизу 26S протеасомой в отсутствии молекул убиквитина. Полученные данные могут иметь значительный физиологический смысл как в норме, так и при протекании нейродегенеративных процессов в ЦНС.

  1. Belogurov et al., JBC, 2014; Kuzina et al., BioMed Res. Int., 2014.

На примере каталитического антитела А17, гидролизующего фосфорорганические соединения, показано, что направленные изменения в структуре могут повлиять на каталитическую активность антитела

Направленный дизайн каталитических антител с заданной функцией требует глубокого понимания их структурной организации. На примере каталитического антитела А17, гидролизующего фосфорорганические соединения, было показано, что направленные изменения в структуре могут повлиять на каталитическую активность антитела Данный вывод был сделан на основе кристаллических структур и ряда биохимических исследований антитела А17 с константными доменами легкой цепи κ (A17κ) и λ (A17λ).

  1. Ponomarenko et al., Acta Cryst. D., 2014.

Группа биологии активных форм кислорода - Красный флуоресцентный генетически кодируемый индикатор пероксида водорода

Активные формы кислорода (АФК) являются консервативными регуляторами множества клеточных функций. Большинство известных сейчас сенсоров для детекции АФК характеризуются зеленым спектром эмиссии. Расширение спектрального диапазона флуоресцентных сенсоров сделает возможным использование мультипараметрической микроскопии с использованием в одном эксперименте нескольких флуоресцентных сенсоров. Нами был создан первый красный флуоресцентный генетически-кодируемый сенсор для детекции пероксида водорода – HyPerRed. Сенсор успешно применен для детекции низких концентраций внутриклеточного пероксида водорода при различных воздействиях на клетки.

 

  1. ErmakovaYG, BilanDS, MatlashovME, MishinaNM, MarkvichevaKN, SubachOM, SubachFV, BogeskiI, HothM, EnikolopovG, BelousovVV. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications, 2014 Oct 21, 5:5222.

Лаборатория углеводовМотильность раковых клеток регулируется как содержанием гликосфинголипида  Р1 (на уровне его биосинтеза), так и естественными антителами к гликановому эпитопу - трисахариду Р1(совместно с GynecologicalRes.Group, Dept.Biomedicine, Univ.HospitalBasel, Switzerland)

Трисахарид Gala1-4Galb1-4GlcNAc (Р1) является специфическим сайтом гликолипида, который входит в состав некоторых клеток человека. Обнаружено, что у всех людей в крови есть естественные антитела (еАТ) к трисахариду, роль этих еАТ была неясна.

В клетках рака яичника наблюдалось увеличенное содержание Р1 по сравнению с нормальными клетками; по содержанию гликолипида Р1 клетки резко делятся на две группы, клетки  с высоким содержанием обладают значительно более высокой способностью к миграции. Мы предполагаем, что еАт против Р1играют надзорную роль за появлением и миграцией раковых клеток.

  1. F.Jacob et al. The glycosphingolipid P1 is an ovarian cancer-associated carbohydrate antigen involved in migration.BrJCancer.,111, 1634-45 (2014). doi: 10.1038/bjc.2014.455. 

Лаборатория биотехнологии растений ФИБХПолучение трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам

Исследованы трансформированные растения, экспрессирующие искусственный ген зрелой формы антимикробного пептида бомбинина (bom). Трансгенные растения обладали повышенной устойчивостью к тестированным бактериальным и грибным фитопатогенам. Показана повышенная устойчивость bom-растений к окислительному стрессу и  ультрафиолету. Полученные данные свидетельствуют о возможности включения гетерологичных генов антимикробных пептидов в интегральную антистрессовую защитную систему растений.

 

  1. Захарченко Н.С., Локтюшов Е.В., Рукавцова Е.Б., Шевчук Т.В., Дьяченко О.В., Бурьянов Я.И. Получение трансгенных растений, экспрессирующих ген антимикробного пептида бомбинина // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2013. Вып. 3. С. 287-296.

Лаборатория химии липидов, Лаборатория углеводовВзаимодействие противоопухолевых липосом, несущих углеводный лиганд селектинов, с эндотелиальными клетками сосудов крови

Исследован механизм взаимодействия 100-нанометровых липосом, полученных из природных фосфолипидов и липофильного пролекарства мелфалана и оснащенных углеводным лигандом селектинов сиалил Льюис Х (SiaLeX), с эндотелиальными клетками сосудов крови. Ранее, на модели карциномы легких Льюис in vivo показан специфический антиваскулярный эффект SiaLeX-липосом, который приводил к усилению торможения роста опухоли, по сравнению с лечением липосомами без лиганда [1]. В данной работе установлено, что SiaLeХ-липосомы селективно связываются и быстро поглощаются клетками, активированными фактором некроза опухоли альфa (TNFα). Процесс сопровождается дестабилизацией мембраны липосом — первым этапом высвобождения пролекарства. Напротив,неактивированные клетки связывают лишь незначительное количество SiaLeX-липосом, причем липосомы остаются интактными длительное время (не менее 90 мин).

 

  1. N.R. Kuznetsova, E.V. Stepanova, N.M. Peretolchina, D.A. Khochenkov, I.A. Boldyrev, N.V. Bovin, E.L. Vodovozova. Targeting liposomes loaded with melphalan prodrug to tumour vasculature via the sialyl Lewis X selectin ligand. J. Drug Targeting 2014, 22(3), 242–250.

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторовНовые полипептидные токсины: изучен транскриптом паука Dolomedes fimbriatus, предсказано 163 новых, не имеющих опубликованных аналогов, полипептидных структуры

Для выяснения основных принципов экспрессии токсинов в ядах пауков был изучен транскриптом паука Dolomedes fimbriatus, обитающего на юге России. Для поиска кодированных в транскриптоме полипептидных последовательностей токсинов были использованы мотивы первичной структуры, ранее найденные при анализе многочисленных токсинов пауков. На их основе было разработано 9 новых мотивов, которые позволили отобрать 7169 сиквенсов предполагаемых токсинов. В соответствии с ранее разработанным алгоритмом было предсказано 163 индивидуальных зрелых последовательностей токсинов, которые были распределены в 16 групп гомологов,  19 остались одиночными. Предсказанные зрелые белки являлись продуктами созревания 451 белка предшественника, которые в свою очередь имели 795 вариантов нуклеотидных последовательностей по транскриптому. Все найденные последовательности преимущественно кодировали полипептидные токсины с типом пространственной укладки ICK или «цистеиновый узел» (147 из общего количества в 163). Кроме этого были найдено 10 цистеинсодержащих полипептидов с другим типом укладки, а также  6 линейных молекул. Все молекулы не имеют опубликованных ранее аналогов в литературе, но часть из них имеет до 90% гомологии с выведенными полипептидами из транскриптома родственного паука Dolomedes mizhoanus.

 

  1. Kozlov S.A., Lazarev V.N., Kostryukova E.S., Selezneva O.V., Ospanova E.A., Alexeev D.G., Govorun V.M., Grishin E.V. Comprehensive analysis of the venom gland transcriptome of the spider Dolomedes fimbriatus. Scientific Data, 2014, 1:140023.

Отдел молекулярной нейробиологии, Отдел структурной биологииПроектирование белков с заданной функцией: предложен удобный «минималистичный» структурный каркас для «скаффолд-инженерии»

Белковые структуры (типы укладки) различаются по размерам и сложности и, следовательно, по удобству их использования в биоинженерии. Для открытого нами семейства защитных пептидов растений, называемых α-гарпининами, характерна простая укладка. Она состоит из двух коротких α-спиралей, скрепленных двумя дисульфидными мостиками. Подобная структура характерна для некоторых токсинов моллюсков-конусов и скорпионов – ингибиторов калиевых каналов. Мы пересадили функционально важные аминокислотные остатки из токсина в защитный пептид и получили химерную молекулу, полностью воспроизводящую функции токсина. α-Гарпининовая укладка представляется простым и удобным структурным мотивом для белковой инженерии и может быть использована для рационального дизайна лекарственных средств.

 

  1. Berkut A.A., Usmanova D.R., Peigneur S., Oparin P.B., Mineev K.S., Odintsova T.I., Tytgat J., Arseniev A.S., Grishin E.V., Vassilevski A.A. (2014) Structural similarity between defense peptide from wheat and scorpion neurotoxin permits rational functional design. J. Biol. Chem. 289, 14331-14340.

Лаборатория молекулярной иммунологии, Лаборатория биофотоники Института общей физики РАН и МФТИ, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского - Созданы биокомпьютерные нано- и микрочастицы, способные реализовывать любую логическую функцию исходя из анализа присутствия/отсутствия в окружающей среде каких-либо двух молекул, а затем взаимодействовать с биологической мишенью в зависимости от результатов вычисления

Впервые в мире созданы биокомпьютерные нано- и микрочастицы, способные реализовывать любую логическую функцию исходя из анализа присутствия/отсутствия в окружающей среде каких-либо двух молекул, а затем взаимодействовать с биологической мишенью в зависимости от результатов вычисления. Реализация логической функции производится за счет специально подобранного по составу внешнего слоя наночастиц, который по-разному трансформируется при воздействии различных комбинаций молекулярных «входов». Эффективность созданных конструкций продемонстрирована на примере мультиплексного иммуноанализа, а также адресной доставки магнитных наночастиц к раковым клеткам. Разработанная биохимическая вычислительная система может быть положена в основу создания медицинских нанороботов, в том числе, умных сенсоров и агентов для тераностики опухолевых заболеваний.

  1. NikitinM.P., ShipunovaV.O., DeyevS.M., NikitinP.I. Biocomputing based on particle disassembly. Nature Nanotechnology. 2014. V. 9. № 9. P.716-722. Impact factor 33.265. doi: 10.1038/nnano.2014.156.  

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем, Лаборатория химии липидовМолекулярная динамика объясняет уникальность физико-химических свойств мембран архей

Археи в основном являются экстремофилами: их среда обитания — это высокие температура, давление, соленость и кислотность. Возможно, «особый путь» архей был определен необычными свойствами их мембран, существенно отличающихся по составу от «обычных» фосфолипидных бислоев у бактерий и эукариот. В Лаборатории моделирования биомолекулярных систем провели компьютерное исследование архейных мембран, объяснив взаимосвязь между химической структурой липидов и физическими свойствами мембран. В расчетах молекулярной динамики показано, что ключевой особенностью химического строения архейных липидов, определяющей исключительные физические свойства мембран на их основе, является изопреноидная природа гидрофобных фрагментов этих липидов (боковые метильные группы у каждого четвертого атома углерода «хвоста»). Полученный результат свидетельствует о том, что такая ветвящаяся изопреновая структура позволяет архейной мембране в широком диапазоне температур находиться в жидкокристаллическом состоянии, оставаясь при этом очень плотно упакованной, практически водонепроницаемой и прочной.

 

  1. Chugunov A.O., Volynsky P.E., Krylov N.A., Boldyrev I.A., Efremov R.G. Liquid but Durable: Molecular Dynamics Simulations Explain the Unique Properties of Archaeal-Like Membranes. (2014). Scientific Reports v. 4, 7462.

Лаборатория молекулярных основ эмбриогенезаНовый сигнальный механизм регуляции раннего развития головного мозга

На модели эмбрионов шпорцевой лягушки впервые выявлен механизм регуляции раннего развития головного мозга, основанный на обмене сигналами между клетками переднего края нервной пластинки (будущего зачатка переднего мозга) и клетками прилежащей головной эктодермы. Показано, что  сигнал, передаваемый клетками переднего края нервной пластинки с помощью Fgf8 (фактор роста фибробластов 8),  индуцирует, при посредстве малой ГТФазы Ras-dva1, экспрессию Ag1 и Agr2, а также Ras-dva1, в клетках головной эктодермы. В свою очередь, факторы Ag1 и Agr2 стимулируют в клетках переднего края нервной пластинки экспрессию регулятора раннего развития переднего мозга - транскрипционного фактора FoxG1, а также самого Fgf8. Нарушения выявленной сигнальной петли обратной связи приводят к аномальному развитию переднего мозга.

 

  1. Tereshina M.B., Ermakova G.V., Ivanova A.S., Zaraisky A.G. Ras-dva1 small GTPase regulates telencephalon development in Xenopus laevis embryos by controlling Fgf8 and Agr signaling at the anterior border of the neural plate. Biology Open, 2014, 3:192-203.

Лаборатории структурной биохимииАнализ состава «ядрышек» в предовуляторных ооцитах млекопитающих c помощью инновационных цитохимических и иммуноцитохимических подходов

Разработаны подходы для анализа состава «ядрышек» (nucleolus-like bodies, NLBs) предовуляторных (germinal vesicle, GV) ооцитов млекопитающих после окраски клеток белок-связывающим красителем FITC (ФИТЦ) или умеренной обработки протеиназой К. Впервые показано, что NLBs  ооцитов не только характеризуются высокой локальной концентрацией белков, но и содержат все ключевые белки нормальных ядрышек, которые необходимы для образования рибосом. До выполнения настоящей работы ни один из белков внутри NLBs, согласно данным литературы, описан не был.

 

  1. Shishova KV, Lavrentyeva EA, Dobrucki JW, Zatsepina OV (2015). Nucleolus-like bodies of fully-grown mouse oocytes contain key nucleolar proteins but are impoverished for rRNA. Dev Biol 397 (2), 267–281

Отдел пептидно-белковых технологийЛаборатория протеомикиГруппа мембранных биоэнергетических системПротеомно-метаболомное профилирование злокачественных асцитов как среды для межклеточной коммуникации (совместно с ФМБА НИИ физико-химической медицины, МФТИ, СПБГУ, Ресурсным центром молекулярных и клеточных технологий, ФГБУН Ботанический институт им. В. Л. Комарова РАН, Лабораторией аналитической фитохимии, химическим факультетом МГУ имени М.В. Ломоносова, ФГБУ Российским научным центром рентгенорадиологии и Казанским федеральным университетом)

Асциты, образующиеся при раке яичников, являются нативной средой опухолевых клеток, что позволяет изучать секретом клеток рака яичников, а также представляют интерес для исследователей как перспективный источник потенциальных биомаркёров. Цель нашего исследования заключалась в выявлении специфических особенностей метаболома и протеома злокачественных асцитов. В результате метаболомного анализабыл выявлено около 40 метаболитов, содержание которых значимо отличалось между злокачественными и циррозными асцитами. В результате протеомного анализа было выявлено 2096 и 1855 белков в асцитах при раке яичников и при циррозе, соответственно. Кроме того, мы продемонстрировали, что некоторые малые ядерные РНК сплайсосомы присутствовали исключительно в злокачественных асцитах, где, вероятно, существуют в виде комплексов с белками. Идентификация белков и РНК сплайсосомы во внеклеточной среде представляет особый интерес, поскольку они могут играть важную роль в коммуникации между опухолевыми клетками.

Асцит при раке яичников как среда для межклеточной коммуникации: в результате данного исследования было обнаружено большое количество компонентов, участвующих в процессе межклеточной коммуникации. Среди них были идентифицированы опухоль специфичные низко-молекулярные метаболиты, которые могут действовать как важные сигнальные молекулы сами по себе, так и быть предшественниками различных гормонов и факторов роста. Злокачественные асциты отличались повышенным количеством экзосом, а также в опухолевых асцитах были идентифицированы РНК-связывающие белки, ответственные за транспорт микроРНК во внеклеточную среду. Кроме того были обнаружены различные компоненты сплайсосом (65 белков сплайсосом и все типы малых ядерных РНК сплайсосом) во внеклеточной среде, которые подобно экспорту микроРНК могут переносить важную информацию между различными клетками.

  1. ShenderV.O., PavlyukovM.S., ZiganshinR.H., ArapidiG.P., KovalchukS.I., AnikanovN.A., AltukhovI.A., AlexeevD.G., ButenkoI.O., ShavardaA.L., KhomyakovaE.B., EvtushenkoE., AshrafyanL.A., AntonovaI.B., KuznetcovI.N., GorbachevA.Y., ShakhparonovM.I., GovorunV.M. Proteome-metabolome profiling of ovarian cancer ascites reveals novel components involved in intercellular communication // MolCellProteomics. 2014 Dec;13(12):3558-71.

 

Отдел пептидно-белковых технологий, Лаборатория белков гормональной регуляцииЛаборатория биологических испытаний ФИБХ РАНГруппа химии пептидов ФИБХ РАНЛаборатория химии белка ФИБХ РАНПроведен полный цикл доклинических исследований лекарственного средства на основе амидной формы пептида HLDF-6

Проведен полный цикл доклинических исследований лекарственного средства на основе амидной формы (АФ) пептида HLDF-6 (Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg- NH2). Изучены: специфическая активность, механизм действия, общая токсичность и специфическая токсичность, фармакокинетика, фармакодинамики и токсикокинетика. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что препарат на основе АФ пептида HLDF-6 после проведения клинических исследований с большой степенью вероятности может быть использован для лечения болезни Альцгеймера и ишемического инсульта.

Вывод: Препарат на основе амидной формы пептида после проведения клинических исследований с большой степенью вероятности может быть использован для лечения болезни Альцгеймера и ишемического инсульта.

  1. Заявка на патент Российской Федерации № 2014130894. Богачук АП, Сторожева ЗИ, Золотарев ЮА, Ковалев ГИ, Азев ВН, Липкин ВМ. Пептид, обладающий нейропротекторной и ноотропной активностью, и фармацевтическая композиция на его основе. Дата регистрации 25.07.2014.

Отдел биоинженерии - Нейромодулятор человека SLURP-1: структура, функция, взаимодействие с рецептором (совместно с Отделом молекулярных основ нейросигнализации  ИБХ РАН и  Отделом структурной биологии)

Определена пространственная структура белка SLURP-1, – уникального трехпетельного нейромодулятора человека, действующего на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР), построена модель комплекса SLURP-1 с рецептором, и показано, что ключевую роль в формировании комплекса играет вторая петля нейромодулятора. На ооцитах X. laevis показано, что SLURP-1 ингибирует ток через канал альфа7-нАХР, однако при этом нет конкуренции с 125I-альфа-бунгаротоксином за связывание с рецептором. Это свидетельствует о существенном отличии сайта связывания SLURP-1 с альфа7-нАХР от «классического» сайта связывания агонистов и антагонистов рецептора. Установлено, что SLURP-1 обладает антипролиферативным эффектом на клетках аденокарциномы человека НТ-29, экспрессирующих нАХР только альфа7 типа.

 

  1. Е. Н. Люкманова, М. А. Шулепко, М. Л. Бычков, З. О. Шенкарев, А. С. Парамонов, А. О. Чугунов, A. С. Арсеньев, Д. А. Долгих, М. П. Кирпичников. Белки человека SLURP-1 и SLURP-2, действующие на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, замедляют пролиферацию клеток колоректальной аденокарциномы HT-29. (2014), Acta Naturae, 6(4): 58-65.
  2. M.A. Shulepko, Z.O. Shenkarev, A.S. Paramonov, K.S. Mineev, D.S. Kudryavtsev, I.E. Kasheverov, M.S. Thomsen, A.S. Arseniev, D.A. Dolgikh, V.I. Tsetlin, M.P. Kirpichnikov, E.N. Lyukmanova. Endogenous Human Neuromodulators Lynx1 and Slurp1: Structure, Function and Mechanism of Action. 39th FEBS Congress (30 August-4 September 2014, Paris, France); FEBS Journal 281 (Suppl. 1) P.279
  3. М.А. Шулепко, Е.Н. Люкманова, А.С. Парамонов, А.А. Лобас, З.О. Шенкарев, И.Е. Кашеверов, В.И. Цетлин, Д.A. Долгих, A.С. Арсеньев, М.П. Кирпичников "Нейромодулятор SLURP-1 человека: бактериальная продукция, взаимодействие с мышечным никотиновым ацетилхолиновым рецептором, структура и конформационная гетерогенность в растворе" (2013) Биохимия, Т. 78(2): 276-285.
  4. Шулепко М.А., Люкманова Е.Н., Лобас А.А., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET22b(+)/Сларп-1, кодирующая белок Сларп-1 человека, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/Сларп-1 – продуцент белка Сларп-1 человека. Патент РФ № 2453602 от 20.06.2012.

Лаборатория сравнительной и функциональной геномикиОпределена динамика репертуаров Т-лимфоцитов у пациентов с аутоиммунными патологиями после терапевтической трансплантации гемопоэтических стволовых клеток

Впервые получены данные о клональной динамике Т-клеточного репертуара больных АС после аутологичной ТГСК с глубиной анализа 1,2 х 105 выявленных клонотипов. Показано, что степень сходства клональных репертуаров у пациентов до и после трансплантации существенно выше, чем сходство, выявляемое при сравнении репертуаров генетически идентичных индивидов (монозиготных близнецов). Выявлены значительные по размерам группы клонотипов, противоположные по направлению изменения представленности в репертуаре после ТГСК и в ходе восстановительного периода. Сравнение данных групп клонотипов по распределению V и J сегментов позволяет предполагать наличие достоверных отличий по исследованному параметру, что может быть связано с различными функциональными свойствами Т-лимфоцитарных клонов из различных групп.

Отдел геномики и постгеномных технологий, Лаборатория геномики адаптивного иммунитета, Лаборатория сравнительной и функциональной геномикиНовый подход к анализу данных массированного секвенирования с использованием молекулярного баркодирования

Новый метод позволяет анализировать репертуары Т-клеточных рецепторов без ошибок и без потерь реального разнообразия в образце.  Прочитанные последовательности, несущие один и тот же молекулярный идентификатор, объединяются в одну группу. Наличие идентичного молекулярного баркода показывает, что данные прочитанные последовательности были наработаны с одной и той же стартовой молекулы кДНК. Кластеризация данных секвенирования по уникальному баркоду позволяет установить исходную нуклеотидную последовательность по доминирующей последовательности в каждой группе. Затем производится дополнительная очистка данных по высоко-частотным ошибкам ПЦР, идентифицируемым через анализ тех же групп последовательностей, что впервые позволило выйти на действительно безошибочное секвенирование.

 

  1. Shugay M, Britanova OV, Merzlyak EM, Turchaninova MA, Mamedov IZ, Tuganbaev TR, Bolotin DA, Staroverov DB, Putintseva EV, Plevova K, Linnemann C, Shagin D, Pospisilova S, Lukyanov S, Schumacher TN, Chudakov DM. Towards error-free profiling of immune repertoires. Nature Methods, 2014; 11(6):653-655.

 

Группа химии хромопротеиновГруппа флуоресцентных красителей для биотехнологииЛаборатория рентгеноструктурного анализаВлияние хромофор – белковых взаимодействий на спектральные свойства желтого флуоресцентного белка

Совместно с лабораторией рентгеноструктурного анализа определена кристаллическая структура желтого флуоресцентного белка из Phialidium sp.. На основании полученной пространственной структуры проведен направленный мутагенез аминокислотных остатков в окружении хромофора. Идентифицированы структурные детерминанты, ответственные за желтую флуоресценцию белка.

Лаборатория биотехнологии

Новый химико-ферментативный способ получения противоопухолевогор препарата клофарабина

Разработана уникальная технология получения важнейшего для клинической практики противоопухолевого препарата клофарабина, основанная на получении в три стадии без промежуточных очисток  1-фосфата 2-фторарабинозы с последующей конденсацией с 2-хлораденином, осуществляемой генно-инженерным ферментом пуриннуклеозидфосфо-рилазой E. coli. Проведение синтеза клофарабина по реакции ферментативного гликозилиро-вания позволяет избежать образования нежелательного α-аномера клофарабина и  упростить хроматографическую очистку целевого препарата.

 

  1. Fateev, I.V.; Antonov, K.V.; Konstantinova, I.D.; Muravyova, T.I.; Seela, F.; Esipov, R.S.; Miroshnikov, A.I.; Mikhailopulo, I.A. The chemoenzymatic synthesis of clofarabineandrelated 2′-deoxyfluoroarabinosylnucleosides: the electronic and stereochemical factors determining substraterecognition by E. coli nucleoside phosphorylases // Beilstein J. Org. Chem. 2014, 10, pp. 1657-1669.

Разработка эффективных интеин-опосредованных биотехнологий получения полипептидов медицинского назначения

Разработаны уникальные биотехнологии основанные на явлении белкового сплайсинга для получения полипептидов медицинского назначения, таких как анофелин, вариегин, гирудин, эпидермальный фактор роста человека, глюкагон, оксинтомодулин, пуротоксин-1 и ряд других. Использование в разработанных биотехнологиях мини-интеинов в качестве белков носителей решило несколько важных технологических задач – увеличило продуктивность и позволило отказаться от использования сайт специфических протеаз.

 

  1. Roman S. Esipov, Maria A. Kostromina. Comparative analysis of the effectiveness of C-terminal cleavage constructs based on different mini-inteins in producing a recombinant analog of anophelin, an anticoagulant from Anopheles albimanus. Appl Biochem Biotechnol. 2014 Dec 13.

  2. Есипов Р.С., Степаненко В.Н., Бейрахова К.А., Мирошников А.И., Автушенко С.С., Сурков К.Г., Романов В.Д., Генкин Д.Д. Оксинтомодулин человека, его применение. Лекарственный препарат на его основе и способ применения препарата для лечения и профилактики гипергликемии. Патент РФ на изобретение № 2524204 от 27.07.2014

  3. Esipov R.S., Stepanenko V.N., Kostromina M.A., Makarov D.A., abramchikYu.A., Muravyova T.I., Chupova L.A., Miroshnikov A.I. Pilot-scale intein-based biotechnologies for production therapeutic proteins. Abstracts of  International conference on bioorganic chemistry, biotechnology and bionanotechnology dedicated to 55-th Anniversary of the M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RussianAcademy of Science and 80th Annivarsary of Prof. Yuri Ovchinnikov. (Moscow September 15-19, 2014). Special issual №1 ActaNaturae, р. 21.

Белки хвостовых шипов бактериофагов, деполимеризующие внеклеточные бактериальные полисахариды. Структура и механизм действия (совместно с Политехническим Университетом Лозанны, Швейцария и ИОХ РАН)

Некоторые бактериофаги в ходе инфекции способны преодолевать защитный слойкапсульных и внеклеточных полисахаридов, синтезируемый бактериями Acinetobacterbaumannii и Pseudomonasaeruginosa. Нами были получены рекомбинантные белки хвостовых шипов бактериофагов АР22 (Myoviridae) A. baumannii, phi297 (Siphoviridae) и LKA1 (Podoviridae) P. aeruginosa, и посредством рентгеноструктурного анализа определены их структуры. . Белки хвостовых шипов всех трех бактериофагов, вне зависимости от морфологии вирусов, представлены тримерными бета-спиралями, в состав которых входит домен связывания с полисахаридом и его ферментативного расщепления.

ЯМР-исследования экзополисахаридов штамма 1053A. baumannii, штамма РАО1 P. aeruginosa, и продуктов их ферментативной деградации показали, что белки хвостовых шипов бактериофагов деградируют связь по механизму бета-элиминирования и, таким образом, представляют собой специфические полисахарид-лиазы.

  1. SenchenkovaS.N., ShashkovA.S., ShneiderM.M, ArbatskyN.P, PopovaA.V, MiroshnikovК. A, VolozhantsevN.V, KnirelY.A “Structure of the capsular polysaccharide of Acineto bacterbaumannii ACICU containingdi-N-acetylpseudaminicacid’ Carbohydrateresearch (2014) V.391, P.89-92
  2. Miroshnikov K.A., Shneider M.M., Buth S.A., Shashkov A.S., Popova A.V., KnirelYu.A., Leiman P.G«Acinetobacter polysaccharide degradation by the tailspike protein of bacteriophage AP22» - пленарныйдокладIII EMBO conference «Viruses of Microbes/ Structure and function - from molecules to communities» 14-18 июля 2014, Цюрих, Швейцария.
  3. Мирошников К.А., Шнейдер М.М., Бут С.А., Шашков А.С., Книрель Ю.А., Лейман П.Г«Белки хвостовых шипов бактериофагов – деполимеразы внеклеточных бактериальных полисахаридов» симпозиальный докладIIнаучно-практическая конференция с международным участием «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» - 22-24 сентября 2014, Санкт-Петербург

Лаборатория Молекулярной биофизикиЭффект аномально высокой оптической активности растворов коллоидных плазмонных или флуоресцентны наночастиц в слабом магнитном поле (совместно с НИЯУ «МИФИ» и с Белорусским государственным университетом)

Обнаружен новый эффект аномально высокой оптической активности – магнитного кругового дихроизма (МКД) в растворах коллоидных наночастиц: плазмонных металлических (золото или серебро) и флуоресцентных полупроводниковых (квантовые точки CdSe/ZnS или CdTe) в слабом магнитном поле (до 0,5 Тл). Обнаруженный эффект важен и интересен как с точки зрения понимания механизмов магнитооптических процессов в наноструктурах, так и с точки зрения возможных приложений обнаруженного эффекта. В частности, особенностью эффекта является чувствительность параметров МКД к изменению поверхностных свойств наночастиц и, следовательно, возможность его использования в создании сенсоров, способных работать в мутных средах, что имеет принципиальное значение для использования таких систем в медицине.

 

  1. M. Artemyev, R. Krutokhvostov, D. Melnikau, V. Oleinikov, A. Sukhanova, I. Nabiev. Low-field magnetic circular dichroism in silver and gold colloidal nanoparticles of different sizes, shapes, and aggregation states. Plasmonics: Metallic Nanostructures and Their Optical Properties X, Proc. of SPIE Vol. 8457, 845729, doi: 10.1117/12.929860

Лаборатория клеточной биологии рецепторовМодель активации рецептора IRR

На основании полученных нами результатов по анализу активности химер и мутанов рецептора IRR, мы выдвинули модель активации рецептора IRR. В этой модели мы предполагаем, что в рецепторе IRR есть два сайта чувствительности к щелочному рН. Первый сайт находится между L1C доменами одной мономерной субъединицы и доменами FnIII-2 и FnIII-3 от второй мономерной субъединицы, тогда как второй расположен между L2 и FnIII-1 доменами. Причем первый сайт наиболее критичен, для активации рецептора IRR щелочным рН.

 

  1. I.E. Deyev, N.A. Chachina, D.M. Shayahmetova, O.V. Serova, A.G. Petrenko, Mapping of alkali-sensing sites of the insulin receptor-related receptor. The role of L2 and fibronectin domains. Biochimie, (2014).

Группа химии пептидов ФИБХ - Побочные реакции, протекающие при использовании реакции Дакина-Вэста в синтезе d-амино-g-кето-a-алкилвалерьяновых кислот, а также при трансформации полученных кислот в кетометиленовые псевдопептиды

Показано, что одним из продуктов реакции Дакина-Вэста является соединение 4, возникающее в результате конденсации Кновенагеля между кето-группой основного продукта 3 и метиленовой группой используемого в реакции 2-фенил-5-оксазолона 2. Найдены условия, в которых образование побочного продукта сведено к минимуму.

Показано, что при включении δ-амино-γ-кето-α-изобутилвалерьяновой кислоты 5 в пептидную цепь протекает нежелательное химическое превращение иного рада, которое представляет собой циклизацию с участием амидной группы пептидной цепи и кето-группы, приводящее к продукту 7. Строение  продуктов побочной реакции подтверждено данными физико-химических методов анализа. Проведена оценка скорости протекания побочной реакции.

 

  1. Азев В. Н., Молчанов M. В. Побочные Реакции, Протекающие при Использовании Реакции Дакина-Вэста в Синтезе d-Амино-g-кето-a-алкилвалерьяновых Кислот, а также при Трансформации Полученных Кислот в Кетометиленовые Псевдопептиды // Международная конференция по Биоорганической Химии, Биотехнологии и Бионанотехнологии : Тезисы докладов. ИБХ. М.: 2014. С. 13-13.

Лаборатория клеточных взаимодействийВзаимосвязь уровня экспрессии БТШ70 и продукции активных форм кислорода нейтрофилами человека зависит от возрастного статуса организма

Выявлены принципиальные возрастные различия взаимосвязей между уровнями экспрессии БТШ70 и продукции активных форм кислорода (АФК) нейтрофиламичеловека.В частности, у пожилых доноров (60-89 лет), в противоположность группам среднего возраста (20-59 лет) и долгожителей (90 и более лет), зарегистрирована достоверная положительная корреляция этих параметров (Табл.). Однонаправленность изменений уровня продукции АФК и экспрессии БТШ70 в этой группе может быть обусловленафункциями БТШ70, обеспечивающими усиление ослабленной продукции АФК нейтрофилами в ответ на патогены, наблюдаемой у лицпожилого возраста. Указанный характер взаимосвязи рассматриваемых параметров может являться одним из факторов, ограничивающих продолжительность жизни в пределах, не достигающих зоны долголетия.

 

  1. Kovalenko EI, Boyko AA, Semenkov VF, Lutsenko GV, Grechikhina MV, Kanevskiy LM, Azhikina TL, Telford WG, Sapozhnikov AM. ROS production, intracellular HSP70 levels and their relationship in human neutrophils: effects of age. Oncotarget, 2014 Dec 3 [Epub ahead of print], PMID: 25514461.

Лаборатория структуры и функций генов человекаПродемонстрирована повышенная активность в раковых клетках  (раковая специфичность) промоторов,  участвующих в процессах клеточной пролиферации 

Продемонстрирована повышенная активность в раковых клетках  (раковая специфичность) промоторов,  участвующих в процессах клеточной пролиферации.

Выдвинута гипотеза, согласно которой промоторы, участвующие в пролиферации клеток должны обладать повышенной активностью в раковых клетках по сравнению с нормальными. Промоторы генов CDC6, POLD1, CKS1B, MCM2 и PLK1, вовлеченных в клеточную пролиферацию, были клонированы и протестированы в разных раковых и нормальных клетках с помощью репортерных генов. Продемонстрирована повышенная активность  промоторов в раковых клетках. Показано, что наиболее важные для этой активности цис-регуляторные элементы находятся в коротких фрагментах промоторов,  проксимальных к регулируемым ими генам. Один из исследованных промоторов (CDC6, короткий вариант) оказался достаточно сильным и специфичным, что позволяет использовать его для целей генной терапии рака.

НПП «Питомник лабораторных животных»Разработка новых подходов в создании и криосохранении генномодифицированных животных-биомоделей в соответствии с требованиями AAALAC и ISO

  1. Успешно пройдена реаккредитация производства мелких лабораторных грызунов SPF-категории международной ассоциацией по аттестации и аккредитации содержания лабораторных животных AAALACi.
  2. По итогам надзорной проверки система менеджмента производства была оценена и сертифицирована как отвечающая требованиям ISO 9001:2008.
  3. В генетическую коллекцию криобанка НПП «Пиомник лабораторных животных» для длительного хранения добавлены ранние эмбрионы двух линии (755, MRL)  мышей в количестве 200 – 220 шт.

Проанализировав данные по жизнеспособности ранних эмбрионов 3 инбредных и 7 трансгенных линий мышей, подвергнутых процедуре быстрого замораживания-размораживания с использованием смеси проникающего (глицерин) и непроникающего (сахароза) криопротекторов, было показано, что существующие между данными линиями генетические различия существенно не влияют на выживаемость эмбрионов после криоконсервации. Установлено, что вне зависимости от генетического статуса, выживаемость ранних эмбрионов после процедуры быстрого замораживания-размораживания и последующего культивирования, находилось в диапазоне от 59 до 71 %, что сравнимо с мировым уровнем. Стоит также отметить, что при оценке качества эмбрионов, обнаруженные морфо-функциональные отклонения, вызванные замораживанием-оттаиванием не всегда приводили к гибели эмбрионов. Достаточно часто постимплантационное развитие таких эмбрионов проходило без отклонений от нормы, а полученное потомство оказывалось жизнеспособным, без фенотипических и генотипических отклонений.

  1. Фатеева Е.И., Чернов А.С.,  Телегин Г.Б. «Общие принципы анестезии и анальгезии лабораторных животных» // Международный вестник ветеринарии. 2014. №2, с. 97-102.
  2. Чернов А.С., Телегин Г.Б. «Создание криобанка доимплантационных эмбрионов мышй  SPF-категории в Питомнике лабораторных животных ФИБХ РАН» // Биофизика живой клетки. 2014. Т.10. С. 217-218.
  3. Chernov A.S., Telegin G.B. «Producing of genetically modified mice of SPF-category for scientific resrarchers and preclinical tests» // Инфекция и иммунитет. 2014, 34 стр.
  4. Chernov A.S., Telegin G.B. «Experience of production of gnotobiotic guinea pigs (Cavia porcellus L.) in animal breeding facility of BIBC RAS // Инфекция и иммунитет. 2014, 34 стр.

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекулЛаборатория биомолекулярной ЯМР спектроскопииДимеризация трансмембранных доменов  является активным элементом механизма передачи сигнала у тирозинкиназных эфриновых рецепторов EphА2

 

Установлено, что трансмембранные домены (ТМД) тирозинкиназных эфриновых рецепторов А2 (EphA2) формируют два отличающихся по структуре типа димеров, которые стабилизируют  активную или неактивную конформацию  рецептора. Высокая плотность рецепторов в мембране способствует активации EphA2 даже в отсутствии лиганда.  Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие, что переключение между двумя типами  димеров ТМД является активным  элементом механизма передачи сигнала у эфриновых рецепторов.

 

  1. G.V. Sharonov, E.V. Bocharov, P.M. Kolosov, M.V. Astapova, A.S. Arseniev, and A.V. Feofanov. Point mutations in dimerization motifs of transmembrane domain stabilize active or inactive state of the EphA2 receptor tyrosine kinase. J.Biol.Chem., 2014, 289(21):14955-14964.

Отдел молекулярных основ нейросигнализацииЛаборатории молекулярной токсинологиииУстановлено, что α7 нАХР в дорзальном ганглии ко-локализуются  с пептидом  CGRP, передатчиком болевых сигналов

Установлено, что в дорзальном ганглии α7 никотиновые рецепторы располагаются преимущественно на нейронах среднего размера,  в 85 % таких нейронов имеет место колокализация  с  CGRP, передатчиком болевых сигналов, а в 15% -с ноцицептивным TRPV1 рецептором. Эксперименты с нарушением нервов показали, что из  CGRP-ергических нейронов  α7 никотиновые рецепторы аксонально транспортируются в спинной мозг и на периферию.

 

  1. Shelukhina I, Paddenberg R, Kummer W, Tsetlin V. Functional expression and axonal transport of α7 nAChRs by peptidergic nociceptors of rat dorsal root ganglion. Brain Struct. Funct. 2014.

Отдел молекулярных основ нейросигнализацииЛаборатории молекулярной токсинологиииЛаборатория лиганд-рецепторных взаимодействийОткрыто взаимодействие фосфолипаз А2 с нейронными и мышечными никотиновыми холинорецепторами 

Впервые установлено, что фосфолипазы А2 из ядов змей различных родов, включая гадюк, кобр и крайтов, ингибируют токи, индуцируемые ацетилхолином или цитизином в холинорецепторах нейронов моллюска Lymnaea stagnalis, и конкурируют с радиоактивным α-бунгаротоксином за связывание с ацетилхолин-связывающими белками  L. stagnalis и Aplysia californica, а также с никотиновыми холинорецепторами мышечного и нейронного α7 типа.

 

  1. Vulfius CA, Kasheverov IE, Starkov VG, Osipov AV, Andreeva TV, Filkin SY, Gorbacheva EV, Astashev ME, Tsetlin VI, Utkin YN. Inhibition of nicotinic acetylcholine receptors, a novel facet in the pleiotropic activities of snake venom phospholipases A2. PLoS One. 2014 Dec 18;9(12):e115428.

Отдел молекулярных основ нейросигнализацииЛаборатория лиганд-рецепторных взаимодействийЛаборатории молекулярной токсинологиииВпервые показана способность  ряда низкомолекулярных соединений из губок и асцидий связываться с никотиновыми рецепторами

С помощью компьютерного моделирования проанализировано связывание с ацетилхолин-связывающим белком (АХСБ) серии низкомолекулярных соединений из губок и асцидий. Те из них, для которых была предсказана достаточно высокая энергия связывания, были исследованы на способность конкурировать с радиоактивным альфа-бунгаротоксином за связывание с АХСБ, а также с мышечным и альфа7 никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами (нАХР). Для двух последних мишеней функциональная активность  наиболее активных соединений подтверждена методом электрофизиологии.

 

  1. Kudryavtsev D., Makarieva T., Utkina N., Santalova E., Kryukova E., Methfessel C., Tsetlin V., Stonik V., Kasheverov I. Marine natural products acting on the acetylcholine-binding protein and nicotinic receptors: from computer modeling to binding studies and electrophysiology. Mar. Drugs, 2014, 12(4), 1859-1875.
  2. Kasheverov I., Kudryavtsev D., Zhmak M., Ivanov I., Stonik V., Utkin Y., Chugunov A., Efremov R. Novel natural and designed cholinergic ligands: the possibilities of fundamental and practical applications. Abstracts of “Nicotinic Acetylcholine Receptors 2014”, Cambridge, UK, 2014, Р22.

Группа лесной биотехнологии ФИБХ  - Растения осины и березы с геном bar, устойчивые к гербицидам на основе фосфинотрицина

Проведена оценка устойчивости к гербицидам трансгенных растений осины (Populus tremula L.) и березы (Betula pubescens Ehrh.) с геном bar, кодирующим фосфинотрицин ацетилтрансферазу. Этот фермент придает устойчивость к гербицидам, содержащим фосфинотрицин (глюфосинат аммония), мишенью которого является фермент глутамин синтетаза. В условиях открытой площадки трансгенные растения и контроль были обработаны гербицидом «Basta» в дозах, эквивалентным 2.5, 5 и 10 л/га. Трансгенные растения были устойчивы к обработке 4-кратной полевой дозой (10 л/га), тогда как контроль полностью погиб при обработке 1-кратной полевой дозой (2.5 л/га). Воздействие на глутамин синтетазу в контроле привело к возрастанию содержания аммония в 6-7 раз, тогда как у трансгенных растениях оно не изменилось.

Группа синтеза природных соединений, Лаборатория биофотоникиФлуоресцентные красители на основе хромофора GFP

Разработан метод синтеза нового класса синтетических флуорофоров на основе структуры хромофора GFP. Особенностями данных соединений является ограничение цис-транс изомеризации путем введения группы –BF2–, а также введение атома азота вместо ОН-группы хромофора GFP. Один из полученных хромофоров (соединение 1, Рис. 1А), проявлял сильное увеличение квантового выхода и сдвиг в синюю область флуоресценции в неполярных растворителях по сравнению с водными растворами. Эти свойства были использованы для мечения липидных структур в живых клетках. Были отмечены следующие преимущества хромофора 1: (i) немедленное мечение живых клеток млекопитающих при добавлении хромофора в среду (Рис. 1B); (ii) возможность оценивать степень полярности окрашиваемых внутриклеточных структур по максимуму эмиссии (Рис. 1C); (iii) очень высокая фотостабильность флуоресцентного сигнала (Рис. 1D), которая, очевидно, объясняется постоянным обменом красителя между клеткой и средой.

 

  1. BaranovMS, SolntsevKM, BaleevaNS, MishinAS, LukyanovSA, LukyanovKA, YampolskyIV. Red-shifted fluorescent aminated derivatives of a conformationally locked GFP chromophore.Chem. Eur. J.2014, 20, 13234-13241.

29 декабря 2014 года