Пресс-центр / новости / Наука /

Достижения подразделений Института при выполнении НИР в 2010 году

16 Декабря 2010 г. в Институте состоялось заседание Ученого совета, на котором были рассмотрены итоги выполнения НИР в уходящем году. Ниже приведены краткие аннотации научных достижений, представленные руководителями подразделений (все материалы приведены в авторской редакции).

Чугунов А.О.

Научно-исследовательский отдел «Научно-образовательный центр». Новый двухкомпонентный антибиотик лихеницидин

Из термофильной бактерии Bacillus licheniformis VK21 выделен новый двухкомпонентный пептидный антибиотик лихеницидин, включающий два неизвестных ранее антимикробных пептида — Lch-α (3249,51 Да) и Lch-β (3019,36 Да). Показано, что оба компонента лихеницидина обладают выраженной антимикробной активностью. Установлено синергическое действие Lch-α и Lch-β (в соотношении 1:1) против грам-положительных бактерий в наномолярном диапазоне концентраций. Совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР-спектроскопии установлена химическая и пространственная структура выделенных пептидов. На сегодняшний день лихеницидин — третий двухкомпонентный лантибиотик (наряду с лактицином и галодурацином) с установленной химической структурой зрелых пептидов из шести известных в мире двухкомпонентных систем. Lch-α проявляет черты структурной гомологии с мерсацидин-подобными лантибиотиками и низином А в участках, ответственных за связывание с липидом II клеточной стенки бактерий, что позволяет высказать предположение об аналогичном механизме антимикробного действия лихеницидина.

Лаборатория рентгеноструктурного анализа и группа химии хромопротеинов

На основании данных рентгеноструктурного анализа исследованы молекулярные механизмы формирования хромофорных центров в зеленых флуоресцентных белках (ФБ) группы aceGFP — флуоресцентном белке aceGFP, его нефлуоресцентном варианте aceGFP с точечной заменой G222E (aceGFP_G222E) и фотоконвертированном аналоге aceGFP_G222E, подвергнутом облучению в УФ-области. С атомным разрешением установлены факторы, определяющие спектральные характеристики указанных GFP-белков в процессе их созревания. В кристаллической структуре бесцветного нефлуоресцентного aceGFP-G222E при разрешении 1.14 Å была установлена промежуточная форма биосинтеза хромофора зеленых ФБ. Эта впервые экспериментально наблюдаемая структура незрелого хромофора характеризуется некопланарным расположением имидазолонового и фенольного циклов. Полученные данные важны для последующего рационального конструирования новых биомаркеров с заранее заданными фотофизическими характеристиками для практических целей.



Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов. Новые антимикробные пептиды и токсины, действующие на натриевые каналы насекомых

Методами ЯМР в растворе определена (совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН) пространственная структура антимикробного пептида семян пшеницы Triticum kiharae WAMP-1а. Структура пептида представляет собой четыре антипараллельных β-тяжа и два спиральных поворота. Боковые цепочки остатков Ser-36 и Tyr-31 сближены и, вероятно, наряду с другими остатками образуют так называемый хитинсвязывающий домен. Полученные результаты важны как для понимания молекулярных механизмов иммунной системы растений, так и для повышения устойчивости сельскохозяйственных растений к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды.

Из яда паука Agelena orientalis выделены 7 пептидов, получившие название β/δ-агатоксины. Пептиды содержат 36–38 аминокислотных остатков и характеризуются высокой степенью сходства друг с другом (45–97% идентичных остатков). Показано, что β/δ-агатоксины обладают высочайшей специфичностью в отношении натриевых каналов насекомых, будучи абсолютно неэффективными на каналах млекопитающих. Все пептиды в концентрациях 0.1–1 мкМ оказывали модулирующее действие на потенциал-зависимые натриевые каналы плодовой мушки Drosophila melanogaster (DmNav1/tipE), экспрессированные в ооцитах Xenopus laevis. Они вызывали ингибирование инактивации каналов (α-эффект) и сдвиг порога активации каналов в область более отрицательных значений мембранного потенциала (β-эффект), а также индуцировали устойчивый неинактивирующийся натриевый ток. Подобный «тройной» эффект действия полипептидных токсинов на натриевые каналы обнаружен впервые и является уникальным фармакологическим признаком выделенных пептидов — новых инструментов исследования структуры и функции натриевых каналов насекомых.

Лаборатория протеомики. Новый гибридный материал: квантовая точка/пурпурная мембрана

Создан новый гибридный материал: квантовая точка/пурпурная мембрана. Использование Ферстеровского резонансного переноса энергии от квантовой точки (донор) на хромофор бактериородопсина (БР) ретиналь (акцептор) позволило расширить спектральный диапазон света, используемого для выполнения природной функции бактериородопсина — переноса протона через мембрану. Продемонстрировано увеличение эффективности использования световой энергии в гибридной системе по сравнению с природным бактериородопсином. Новый гибридный материал может стать основой новых элементов для электроники или для преобразователей энергии.

Новые подходы к использованию природных и модифицированных биологических молекул в различных устройствах (например, электронных или фотонных) является одним из направлений нанобиотехнологии. На этом пути перспективным является развитие гибридных наносистем, основанных на использовании комбинации биологическая молекула — квантовая точка (КТ), физический объект с уникальными свойствами. Результатом настоящего исследования явилось объединение свойств двух уникальных объектов: фотохромного белка БР, изменяющего свои спектральные свойства под воздействием света и/или электрического поля и КТ — полупроводниковых нанокристаллов, длина волны флуоресценции которых зависит от их размеров и может с высокой точностью быть подстроена под длину волны поглощения БР. Таким образом, была сформирована пара донор-акцептор с высокой эффективностью передачи энергии.

Фоточувствительный белок бактериородопсин (БР) не способен использовать энергию УФ фотонов и не поглощает их. Подход, основанный на использовании КТ в качестве антенн-конвертеров, позволяет использовать свет, который не был бы поглощен БР (от глубокого УФ к синей области оптического спектра), преобразовать эту энергию к фотонам с длинами волн, которые могут поглощаться БР, эффективно передать эту энергию БР и использовать эту энергию для улучшения его биологической функции.

Полученный результат является важным шагом на пути создания функциональных БР-КТ элементов, работающих во FRET-режиме, перспективных в плане применения в области молекулярной электроники и фотогальванических элементов с преимуществами в размерах, в эффективности свето- и электро- управляемых функций, с устойчивой структурой и стабильностью.

Лаборатория клеточных взаимодействий

Разработана наноразмерная система для доставки противоопухолевого препарата доксорубицина. Работа выполнено совместно с лабораторией полимеров для биологии ИБХ РАН. На основе модифицированного хитозана разработана наноразмерная система для доставки противоопухолевого препарата доксорубицина. Для формирования наночастиц использовали хитозан с молекулярным весом 25 кДа, модифицированный сукцинильными группами и остатками каприловой кислоты, что обеспечило растворимость при физиологическом значении рН и спонтанное сворачивание в частицы в водных растворах. Доксорубицин присоединяли ковалентно. В процессе работы оптимизировали соотношение сукцинильных и жирнокислых остатков, а также групп доксорубицина для получения монодисперсной эмульсии с размером наночастиц около 100–150 нм, что определяли методами светорассеяния и конфокальной микроскопии. Примерная структура наночастиц показана на рисунках А и Б. МТТ-тест показал, что доксорубицин активен в составе частиц, а анализ с помощью конфокальной микроскопии (рис. В) подтвердил, что доксорубицин сохраняет свой основной механизм действия и за один час попадает в ядра клеток.

Стресс-индуцированный экзоцитоз БТШ70 в популяции нейтрофилов связан с высвобождением конститутивной формы этого белка в межклеточное пространство в составе секреторных эндолизосом. Способность клеток иммунной системы синтезировать белки теплового шока в неблагоприятных условиях является важным показателем их функционального состояния. При анализе изменения содержания БТШ70 в нейтрофилах человека в ответ на тепловой шок было обнаружено быстрое увеличение внутриклеточной концентрации этого протеина сразу после тепловой обработки и ее последующее снижение через 15 мин после завершения термического воздействия, что, вероятнее всего, обусловлено выбросом БТШ70 во внеклеточное пространство. Большинство исследователей связывают феномен стресс-индуцированного экзоцитоза БТШ70 с высвобождением в окружающую среду индуцируемой, но не конститутивной формы этого протеина. Однако мы обнаружили, что обработка клеток ингибитором ABC-транспортеров, блокирующего секрецию внутриклеточных протеинов в составе эндолизосом, приводила к исчезновению фазы снижения содержания БТШ70 в нейтрофилах за счет сохранения во внутриклеточном пространстве конститутивной формы этого белка. Полученные данные свидетельствуют о функционировании в нейтрофилах пути стресс-индуцируемого высвобождения конститутивной формы БТШ70 в секреторных эндолизосомах.

Лаборатория синтетических вакцин

Для изучения механизма иммунопротективного действия синтетического фрагмента 173–183 α-7 субъединицы ацетилхолинового рецептора при болезни Альцгеймера получены сыворотки, содержащие антитела к пептиду 173–183 и выделены аффинно-очищенные противопептидные антитела. Показано, что пассивная иммунизация животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера сывороткой, содержащей противопептидные антитела, а также аффинно-очищенными антителами приводит к восстановлению их пространственной памяти.

Лаборатория биокатализа. Антитело-антидот, полученное селекцией фаг-дисплейной библиотеки иммунглобулинов человека

На основании анализа данных рентгеноструктурного анализа созданы трехмерные модели модифицированного и немодифицированного абзима с разрешением 1,5 и 1,36 Å, соответственно. Установлено, что антитело-антидот обладает глубоким активным центром, сравнимым с активным центром ацетилхолинэстеразы, и эффективно нейтрализует фосфорорганические отравляющие вещества и пестициды.

Группа флуоресцентных инструментов для иммунологии и нейробиологии

Впервые с использованием метода массированного секвенирования проведен сравнительный анализ репертуаров Т-клеточных рецепторов больного аутоиммунным заболеванием в периоды до, после и спустя 10 месяцев после проведения высокодозной химиотерапии в сочетании с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (АГСК).

Мы оптимизировали технологию равномерной амплификации вариабельных фрагментов β-цепей Т-клеточных рецепторов (ТКР) и впервые применили метод пиросеквенирования для глубокого сравнительного анализа репертуаров ТКР больного аутоиммунным заболеванием до и после проведения высокодозной химиотерапии в сочетании с АГСК (операция проведена в клинике гематологии Национального медико-хирургического центра им. Н. И. Пирогова).

Было впервые напрямую показано, что терапия приводит к следующим изменениям в клональных популяциях Т-лимфоцитов:

  • Падает общее разнообразие ТКР, а также равномерность представленности клонов Т-лимфоцитов и равномерность распределения длин гипервариабельных CDR3 участков ТКР.
  • Появляется ряд гипер-амплифицированных клонов Т-лимфоцитов.
  • Множество клонов Т-лимфоцитов переживают терапию, и ряд выживших клонов немедленно и выраженно амплифицируется и обеспечивает антиген-специфичную иммунную защиту. В частности, с использованием специфичных флуоресцентно-меченных MHC-тетрамеров был идентифицирован клон CMV-специфичных Т-лифоцитов, переживший терапию и многократно умножившийся в последующие месяцы.

Сравнительный анализ образцов полученных 4 и 10 месяцев после терапии показал, что новый «перекошенный» репертуар ТКР закрепляется и дальнейших существенных изменений не происходит. Те же клоны выживают в последующие месяцы, те же клоны остаются гипер-представленными, те же семейства β-цепей генов ТКР остаются представлены, и наблюдается примерно то же распределение длин гипервариабельных CDR3 участков ТКР. Таким образом, можно заключить что новый баланс установившийся между клонами Т-лимфоцитов исключительно стабилен, и что восстановление разнообразия ТКР и равномерности представленности клонов Т-лимфоцитов, вероятно займет многие месяцы и даже годы.

  1. Shcherbo D, Shemiakina II, Ryabova AV, Luker KE, Schmidt BT, Souslova EA, Gorodnicheva TV, Strukova L, Shidlovskiy KM, Britanova OV, Zaraisky AG, Lukyanov KA, Loschenov VB, Luker GD, Chudakov DM. (2010). Near-infrared fluorescent proteins. Nat. Methods 7(10), 827–829.

Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза Впервые показана способность цитоскелетного белка Zyxin ингибировать сигнальный каскад, активируемый секретируемыми белками семейства Hedgehog.

Впервые показана способность цитоскелетного белка Zyxin ингибировать сигнальный каскад, активируемый секретируемыми белками семейства Hedgehog. Полученные данные важны, т. к. они впервые демонстрируют связь между одним из цитоскелетных белков-регуляторов морфогенетических движений клеток и важным сигнальным каскадом, управляющим дифференцировкой клеток в зачатке центральной нервной системы.

Zyxin является компонентом механизма, отвечающего за морфогенетические движения клеток. Основная функция Zyxin — сборка актинового цитоскелета в местах формирования клеточных контактов. Сигнальный каскад Hedgehog регулирует множество процессов в эмбриогенезе, в частности, разметку дифференцировки клеток в зачатке центральной нервной системы — нервной трубке. Различные по механизму нарушения функционирования данного каскада служат причиной многих болезней, включая отдельные типы рака. Полученные нами данные представляют значительный интерес, т. к. они впервые демонстрируют связь между одним из цитоскелетных белков-регуляторов морфогенетических движений клеток и важным сигнальным каскадом, управляющим дифференцировкой клеток в нейральном зачатке. Выявление подобных связей и дальнейшее изучение их функций важно для понимания механизмов координации двух основных составляющих процесса эмбрионального развития — клеточной дифференцировки и морфогенеза.

  1. Ermolina L.V., Martynova N.Yu., Zaraisky A.G. The cytoskeletal protein Zyxin can modulate Hedgehog signaling during neurulation in Xenopus laevis. Submitted.
  2. Ермолина Л. В., Мартынова Н. Ю., Зарайский А. Г. «Цитоскелетный белок зиксин взаимодействует с участниками Hedgehog-каскада в раннем развитии шпорцевой лягушки Xenopus laevis» // Труды международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», 126 стр. / Украина, Ялта-Гурзуф, 31 мая-10 июня 2010 г.

Лаборатория молекулярной иммунологии. Многофункциональные нано- и микроструктуры на основе белковой пары барназа–барстар

На основе молекулярного белкового конструктора барназа–барстар разработана универсальная платформа для создания мультифункциональных наноструктур. На ее основе впервые в мире сконструированы трифункциональные нано- и микрочастицы, обладающие одновременно магнитными и флуоресцентными свойствами и способные специфически связываться с раковыми клетками.

Впервые в мире разработан универсальный метод сборки наноразмерных суперструктур из компонентов различной природы, например, магнитных частиц, квантовых точек и антител. Основой предложенного молекулярного конструктора является адапторный модуль, состоящий из двух белков, барназы и барстара, которые связывают компоненты суперструктур друг с другом. Показано, что силы взаимодействия двух белков, барназы и барстара достаточно для объединения и удерживания как нано, так и микрочастиц в единой суперструктуре. Широкие возможности метода показаны на примере конструирования трифункциональных нано- и микрочастиц, обладающих одновременно магнитными и флуоресцентными свойствами и способных специфически связываться с раковыми клетками. Полученные мультифункциональные суперструктуры перспективны в качестве средств терагностики, зарождающейся области медицины, в которой один препарат используется и для диагностики, и для терапии заболевания, а также могут рассматриваться в качестве основы для индивидуализированной медицины.

  1. Nikitin M.P., Zdobnova T.A., Lukash S.V., Stremovskiy O.A., Deyev S.M. (2010). Protein-assisted self-assembly of multifunctional nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5827–5832.
  2. Sekatskii S.K., Favre M., Dietler G., Mikhailov A.G., Klinov D.V., Lukash S.V., Deyev S.M. (2010). Force spectroscopy of barnase-barstar single molecule interaction. J. Mol. Recognit. 23, 583–558.
  3. Никитин М. П., Здобнова Т. А., Стремовский О. А., Лукаш С. В., Деев С. М., Структура на основе белковой пары барназа-барстар и способ ее получения. Заявка на патент, рег. № 2010137746 от 13.09.10.

Лаборатория механизмов генной экспрессии

В качестве партнёра специфической субъединицы РНК-полимеразы II человека hRPB11ba обнаружена особая (укороченная) изоформа одной из субъединиц фактора инициации трансляции EIF3 — eIF3m-b, имеющая предпочтительно ядерную локализацию. Установлено, что изоформа hRPB11ba, в отличие от основной субъединицы РНК-полимеразы II человека hRPB11a, взаимодействует in vivo и in vitro также с двумя другими компонентами этого фактора инициации трансляции: субъединицами eIF3a и eIF3i, что свидетельствует о существовании ядерных субкомплексов фактора инициации трансляции EIF3, участвующих в созревании и транспорте определённого набора мРНК человека.

С помощью генетического (дрожжевая двухгибридная система [YTH]) и биохимического (соосаждения белков из клеточных лизатов) подходов осуществлён полномасштабный поиск белков-партнёров специфических изоформ субъединицы РНК-полимеразы II человека hRPB11 — hRPB11ba и hRPB11ca — в протеоме человека (эмбриональный мозг).

В результате, определён весь спектр белковых партнёров этих специфических для человека изоформ субъединицы РНК-полимеразы II. Обнаруженные белки-партнёры изоформ hRPB11ba и hRPB11ca указывают на то, что эти близкородственные (отличаются одним аминокислотным остатком) изоформы, подобно основной (обычной) субъединице hRPB11a, являются незаменимыми компонентами транскрипционного комплекса (взаимодействуют с субъединицами РНК-полимеразы II hRPB3 и hRPB6, двумя субъединицами медиаторного комплекса, специфическими факторами транскрипции ATF4 и ART-27), участвующими не только в транскрипции специфических ДНК-матриц, но и вовлечённым в более поздние стадии биогенеза мРНК (контактирует с двумя компонентами сплайсеосомы, а также с рядом субъединиц фактора инициации трансляции hEIF3 — eIF3a, eIF3i, eIF3m, а также с новой, укороченной, ранее неописанной формой eIF3m — eIF3m-b, имеющей предпочтительно ядерную локализацию). Интересно, что в проведённом нами поиске обнаружено много новых изоформ белков протеома человека, синтезирующихся в результате трансляции редких мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. Всё это указывает на существование в протеоме человека особых, до сих пор не охарактеризованных комплексов генной экспрессии. В частности, обнаруженные белки-партнёры изоформ hRPB11ba и hRPB11ca характеризуют эти близкородственные субъединицы как компоненты особых транскрипционных комплексов, важные практически на всех этапах биогенеза мРНК (синтез, процессинг, транспорт из ядра к транслирующим полисомам).

  1. Шематорова Е. К., Шпаковский Д. Г., Шпаковский Г. В. (2010). Семейства генов PMS2 и POLR2J как молекулярные маркеры эволюции высших приматов. Генетика 46, 1254–1257. [Russian J. Genet. 46, 1112–1114 (2010).]
  2. Шпаковский Г. В., Шематорова Е. К., Прошкин С. А., Прошкина Г. М., Шпаковский Д. Г. (2010). Новые белковые комплексы, участвующие в созревании и транспорте мРНК человека: кооперация компонентов аппаратов транскрипции и трансляции. Цитология 52, 692–693.

Лаборатория химии липидов и лаборатория углеводов

совместно с Российским онкологическим научным центром им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

В рамках изучения механизма противоопухолевого действия показано in vivo (на модели карциномы легких Льюис), что 100-нм липосомы, сконструированные на основе природных фосфолипидов, образующих жидкий липидный бислой, и нагруженные липофильным пролекарством — диглицеридным производным противоопухолевого алкилирующего агента мелфалана (Mlph-DG), — при оснащении в качестве молекулярного адреса диглицеридным конъюгатом тетрасахаридного лиганда селектинов сиалил Льюис X (SiaLeX) ассоциируют с эндотелием опухолевых кровеносных сосудов и оказывают антиваскулярный и/или антиангиогенный эффект.

Дисперсии липосом вводили системно, в хвостовую вену мышей на 3 и 7 дни после трансплантации опухоли. Иммуногистохимическое исследование срезов опухолей проводили на 4 день эксперимента после однократного введения препаратов (по 3 животных каждой группы) и по окончании эксперимента (3 недели). Параллельно проводили эксперименты с липосомами, меченными флуоресцентным BODIPY-фосфатидилхолином.

Лечение Mlph-DG-липосомами, модифицированными SiaLeX, приводило к снижению количества сосудов в опухоли по сравнению с остальными группами (контроль, мелфалан, Mlph-DG-липосомы без SiaLeX). На следующий день после введения липосом наблюдалось специфическое повреждение опухолевых сосудов: дилатация (расширение просвета) и некроз. При введении флуоресцентномеченых препаратов наблюдалась колокализация Mlph-DG-SiaLeX-липосом и маркера сосудистого эндотелия CD31, тогда как Mlph-DG-липосомы накапливались во внеклеточном пространстве около опухолевых сосудов после экстравазации в опухоль.

Таким образом, показано, что в отсутствие адресного лиганда лекарственные липосомы накапливаются во внеклеточном пространстве опухолевой ткани за счет пассивного транспорта, в то время как введение SiaLeX-конъюгата в состав липосом обеспечивает их активный транспорт к эндотелию опухолевых сосудов.

Лаборатория органического синтеза. Найден новый класс модифицированных нуклеозидов, обладающих высокой активностью в отношении оболочечных вирусов

Среди обнаруженного нами ранее (Биоорган. химия, 29 (3), 289–294 (2003), Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 24 (5/7), 923–926 (2005), Tetrahedron, 62 (6), 1279–1287 (2006), Вопросы вирусологии, 2006 (1), 34–38, Org. Biomol. Chem., 4 (6), 1091–1096 (2006)) класса противовирусных соединений выявлена группа веществ с высокой активностью в отношении оболочечных вирусов. В частности, IC50 5-(перилен-3-ил)этинил-2’-дезоксиуридина составляет 50 нмоль/л для вируса простого герпеса типа 1 и 180 нмоль/л для вируса гепатита C. Характерной особенностью структуры активных нуклеозидов является присутствие остатка пентациклического ароматического углеводорода перилена, жестко присоединенного к нуклеиновому основанию с помощью тройной связи. Высказано предположение, что уникальная структура полученных соединений обусловливает их встраивание в оболочку вириона, в результате чего слияние вириона с клеткой (инфицирование) становится весьма невыгодным процессом (рисунок). Новые соединения практически не цитотоксичны.

  1. St.Vincent M.R., Colpitts C.C., Ustinov A.V., Muqadas M., Joyce M.A., Barsby N.L., Epand R.F., Epand R.M., Khramyshev S.A., Valueva O.A., Korshun V.A., Tyrrell D.L.J., Schang L.M. (2010). Rigid amphipathic fusion inhibitors, small molecule antiviral compounds against enveloped viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 107, 17339–17344.

Лаборатория структурной биохимии

Совместно с лабораторией синтетических вакцин получены не имеющие коммерческих аналогов антитела к олигомерной и мономерной формам белка В23/нуклеофозмину. С их помощью доказано, что олигомерная форма белка располагается, преимущественно, в ядрышках, а мономерная — в ядрах клеток млекопитающих (рис. 1). Впервые получены моноклональные антитела к белку ядрышка SURF-6 и установлено, что функцией SURF-6 у млекопитающих является участие в биогенезе рибосом и стабилизации внутригенных транскрибируемых спейсеров пре-рРНК (рис. 2). Впервые показано, что белки В23/нуклеофозмин и фибрилларин являются специфическими мишенями окислительного стресса у млекопитающих.

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

. «Мозаичная» природа гидрофобных/гидрофильных свойств поверхностей биомембран и ее роль во взаимодействии с пептидами и белками

Выполнен комплекс работ по моделированию взаимодействий антимикробных пептидов (АМП) со смешанными липидными бислоями, имитирующими бактериальные мембраны. С помощью расчетов молекулярной динамики в микросекундном диапазоне с использованием «крупнозернистого» (coarse-grained) приближения изучен характер кластеризации липидов в смеси фосфатидилэтаноламин/фосфатидилглицерол (ФЭ/ФГ) в «чистых» бислоях (без пептидов) и в присутствии АМП. Впервые показано, что связывание АМП с поверхностью бислоя вызывает увеличение характерных размеров кластеров ФГ на фоне заметного снижения их подвижности, что приводит к выраженному разделению микрофаз. Таким образом, АМП могут существенно изменять свойства бактериальной мембраны, не нарушая при этом ее целостности.

  1. Polyansky A.A., Ramaswamy R., Volynsky P.E., Sbalzarini I.F., Marrink S.J., Efremov R.G. (2010). Antimicrobial Peptides Induce Growth of Phosphatidylglycerol Domains in a Model Bacterial Membrane. J. Phys. Chem. Lett. 1, 3108–3111.
  2. Pyrkova D.V., Tarasova N.K., Pyrkov T.V., Krylov N.A., Efremov R.G. (2011). Atomic-scale lateral heterogeneity and dynamics of two-component lipid bilayers composed of saturated and unsaturated phosphatidylcholines. Soft Matter.

Лаборатория белков гормональной регуляции

Показано, что гапонин повышает ферментативную активность GAPDH в клетках, делая их более чувствительными к воздействию окислительного стресса. Снижение экспрессии гапонина в клетках, несущих siРНК к гапонину, увеличивает устойчивость клеток к окислительному стрессу. С другой стороны, сверхэкспрессия гапонина увеличивает чувствительность клеток к окислительному стрессу. По-видимому, гапонин, взаимодействуя с GAPDH, усиливает проапоптическую активность фермента.

Белок гапонин был обнаружен в лаборатории в 2007 году (в ходе структурно-функциональных исследований фактора дифференцировки HLDF).

Поиск потенциальных клеточных партнёров гапонина проводили в лизате клеток линии CHO-K1 (клетки яичников китайского хомячка) и MCF7 (рак молочной железы человека) путём отбора белков, способных специфически связываться с 6хHis-гапонином, нековалентно иммобилизованном на Ni-сефарозе, но не проявляющих сродства к Ni-сефарозе. Белки, соосаждающиеся из клеточного лизата вместе с 6xHis-гапонином, были разделены с помощью ПААГ электрофореза и идентифицированы путём Maldi-TOF- масс-спектрометрии. В качестве вероятного партнера гапонина в обеих клеточных линиях была идентифицирована — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH).

Взаимодействие нативных гапонина и GAPDH в лизате клеток было подтверждено соосождением с Ni-сефарозой очищенных 6xHis-гапонина и GAPDH и перекрёстной иммунопреципитацией с использованием анти-гапонин и анти-GAPDH поликлональных антител.

GAPDH — ключевой фермент гликолиза, катализирующий реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-дифосфоглицерат с образованием NАDН. Основная масса GAPDH локализуется в цитоплазме. Полагают, что окислительный стресс вызывает изменение конформации GAPDH и его транслокацию в ядро, где он выполняет либо защитные, либо проапоптические функции.

Мы изучили влияние сверхэкспрессии гапонина, слитого с GFP, на активность GAPDH в клетках СНО и показали, что сверхэкспрессия гапонина повышала ферментативную активность GAPDH. Было исследовано также участие гапонина в клеточном ответе на окислительный стресс. В качестве агента, вызывающего окислительный стресс, использовали перекись водорода. Было показано, что снижение экспрессии гапонина в клетках HEK-293, несущих siРНК к гапонину, увеличивает устойчивость клеток к окислительному стрессу. С другой стороны сверхэкспрессия гапонина в клетках HEK-293, трансфицированных плазмидой кодирующей гапонин, увеличивает чувствительность клеток к окислительному стрессу. По-видимому, гапонин, взаимодействуя с GAPDH, усиливает проапоптическую активность фермента.

Лаборатория биотехнологии растений ФИБХ

Разработан способ создания безмаркерных трансгенных растений с повышенной биобезопасностью. Методология основана на прямой детекции синтезируемых целевых продуктов с помощью иммунологического анализа. Способ устраняет селективное стрессовое давление и повышает эффективность генетической трансформации растений. Получены растения картофеля, рапса и томата с ценными свойствами без селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам. По результатам работы получен патент РФ, опубликованы и сданы в печать статьи.

Лаборатория биотехнологии

Создана полиферментативная каскадная технология получения практически значимых модифицированных нуклеозидов. Технология используется в синтезе рибо-, 2-дезоксирибо- и арабино-нуклеозидов, в том числе противоопухолевых и противовирусных препаратов (Кладрибин, Видарабин, Флудара, Рибавирин, и др.)

Группа геномного анализа сигнальных систем клетки

Создан искусственный промоторный элемент, обеспечивающий высокую тканеспецифичную транскрипцию генов в клетках герминальных опухолей. На основе такого промотора, создана геннотерапевтическая цитотоксическая конструкция направленного действия, включающая ген рекомбинантной бифункциональной цитозиндезаминазы дрожжей.

На основе промотора человеческого гена домашнего хозяйства NDUFV1, нами была создана искусственная регуляторная последовательность, проявляющая свойства сильного промотора (по силе сравнимого с такими промоторами, как CMV u CAGGS и превосходящего ранний промотор SV40) строго тканеспецифически, только в клетках низкодифференцированных герминальных опухолей человека (модельные клеточные линии — Tera-1 u EP2102). Полученный искусственный промотор (названный mNUS) был использован для создания терапевтической конструкции, содержащей ген рекомбинантной цитозиндезаминазы дрожжей под контролем mNUS. В экспериментах in vitro было показано, что такая конструкция была способна селективно убивать клетки герминальных опухолей линий Tera-1 u EP2102, но при этом была безвредна для других типов клеток.

  1. Gogvadze E, Kholodenko R, Grzela DP, Mityaev M, Vinogradova T, Kopantzev E, Malakhova G, Suntsova M, Sokov D, Ivics Z, Buzdin A. (2010). Novel strong tissue specific promoter for gene expression in human germ cells. BMC Biotechnol. 10, 58.

Отдел молекулярных основ нейросигнализации

За последние 3 года в зарубежных лабораториях были установлены кристаллические структуры высокого разрешения для бактериальных лиганд-управляемых каналов, поэтому появилась возможность моделировать не только лиганд-связывающие домены Cys-петельных рецепторов человека и других млекопитающих (исходя из кристаллической структуры ацетилхолин-связывающего белка), но и внутри-мембранные домены. В совместной работе с немецкими учеными нами было впервые установлено (с помощью компьютерного моделирования, сайт-направленного мутагенеза и электрофизиологии), что взаимодействие трансмембранных фрагментов М1 и М3 с периферическим фрагментом М4 (в котором участвуют идентифицированные ароматические остатки) необходимо для формирования пространственной структуры мономерных субъединиц и их последующей олигомеризации в пентамерный комплекс функционально активного глицинового рецептора.

  1. Haeger S, Kuzmin D, Detro-Dassen S, Lang N, Kilb M, Tsetlin V, Betz H, Laube B, Schmalzing G. (2010). An intramembrane aromatic network determines pentameric assembly of Cys-loop receptors. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 90–98.

Лаборатория молекулярных технологий и Технопарк. Продемонстрирована строго локализованная продукция пероксида водорода при активации сигнальных каскадов в клетке

Уже более 10 лет назад было обнаружено, что пероксид водорода Н2О2 является внутриклеточным вторичным мессенджером. Продукция Н2О2 в клетке может быть эффективно детектирована с помощью разработанного нами генетически кодируемого сенсора HyPer. Однако, быстрая диффузия сенсора внутри клетки не позволяла детектировать локальные повышения Н2О2.

Нами был разработан метод, позволяющий существенно увеличить пространственное разрешение сигнала HyPer. Сенсор был иммобилизован в пределах нескольких суб-компартментов живой клетки, что позволило впервые визуализировать продукцию Н2О2 отдельными эндосомами и зафиксировать продукцию Н2О2 на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума при активации рецептора эпидермального фактора роста EGFR. Из работы следует фундаментальный вывод о том, что антиоксидантные системы внутри живой клетки способны ограничивать диффузию Н2О2 до дистанции, не превышающей 1 микрометр.

  1. Mishina N, Tyurin-Kuzmin P, Markvicheva K, Vorotnikov A, Tkachuk V, Laketa V, Schultz C, Lukyanov S, Belousov V. (2011). Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally? Antioxid. Redox Signal. 14, 1–7.

Лаборатория биофотоники

Разработан метод многократного измерения белок-белковых взаимодействий в живой клетке на основе нового обратимо фотоактивируемый белка rsTagRFP, фотоконверсия которого определяется изменением коэффициента экстинкции, а не квантового выхода.

  1. Subach FV, Zhang L, Gadella TW, Gurskaya NG, Lukyanov KA, Verkhusha VV. (2010). Red fluorescent protein with reversibly photoswitchable absorbance for photochromic FRET. Chem. Biol. 17, 745–755;

Лаборатория структуры и функции генов человека. Гены, существенные для опухолеобразования при раке пищевода

На примере пищевода человека подтверждена тенденция, описанная нами ранее для рака легких человека, что гены, меняющие профиль экспрессии (ПЭ) при развитии данного органа, меняют ПЭ на противоположный при раковой трансформации. Это может служить критерием отбора генов, существенных для опухолеобразования.

Из 4 пар образцов (опухолевая ткань и прилегающая к ней нормальная ткань), взятых у пациентов с диагнозом рак пищевода, выделяли РНК, синтезировали кДНК, проводили вычитающуюся гибридизацию. В результате анализа было идентифицировано 433 гена, дифференциально транскрибирующихся в нормальных и опухолевых тканях пищевода. Для дальнейшего анализа было отобрано 14 генов, для которых определяли уровень транскрипции в образцах тканей: 23 пары образцов опухоль/норма, 10 образцов нормальной ткани, 18 образцов тканей эмбрионального пищевода.

Для 10 генов показано, если при развитии от эмбриона к взрослому организму экспрессия увеличивается, то в опухолевых тканях по сравнению с нормальными она понижается, и наоборот. Таким образом, уровни экспрессии генов в эмбриональных и опухолевых тканях пищевода сравнимы и отличаются от уровня экспрессии в нормальных тканях пищевода взрослого человека.

  1. M. V. Zinovyeva, G. S. Monastyrskaya, E. P. Kopantzev, T. V. Vinogradova, M. B. Kostina, A. V. Sass, O. B. Filyukova, N. Y. Uspenskaya, G. T. Sukhikh, E. D. Sverdlov. (2010). Identification of some human genes oppositely regulated during esophagus squamous cell carcinoma formation and human esophagus embryonic development. Dis. Esophagus 23, 260–270.

Лаборатория оксилипинов. Новая модель оценки гидролитической стабильности пептидов терапевтического назначения с использованием фрагментов жеудочно-кишечного тракта животных.

В целях адекватной оценки стабильности пептидов терапевтического назначения при пероральном введении разработана новая модель и соответствующая методика. Данная модель основана на использовании фрагментов тканей желудочно-кишечного тракта (желудка и кишки) животных. Она позволяет более адекватно оценивать деградацию пептидов при введении в организм per os по сравнению с моделями, основанными на использовании очищенных ферментов, а также является более гибкой, простой в исполнении и дешевой по сравнению с известными моделями введения исследуемых пептидов через катетер интактным животным.

Лаборатория химии протеолитических ферментов

Впервые получен препарат рекомбинантной IgA1 протеазы, способной защищать животных от экспериментального заражения менингококком основных эпидемических серогрупп А и В.

В процессе исследования впервые установлена нуклеотидная последовательность фрагмента гена iga Neisseria meningitidis серогруппы В штамм H44/76, кодирующая секретируемую форму IgA1 специфической протеазы. Впервые создан экспрессионный штамм E. coli суперпродуцент IgA1 протеазы серогруппы В, выделен белок и осуществлен его рефолдинг, позволяющий получать растворимую форму фермента.

Фермент состоит из 963 аминокислотных остатков, не считая искусственно введенной в С-конец рекомбинантного белка гексагистидиновой метки. Протеаза обладает абсолютной ферментативной специфичностью, расщепляя только IgA1.

  1. Аллилуев А. П., Анохина И. В., Румш Л. Д., Котельникова О. В., Дрожжина Е. Ю. Жигис Л. С., Ягудаева Е. Ю., Разгуляева О. А., Зуева В. С., Козлов Л. В.,. Бичучер А. М., Аваков А. Э. Менингококковая поливакцина на основе очищенной IgA1 протеазы. // Вестник РУДН, сер. Медицина, 2010, № 1, с. 7–12.
  2. Ягудаева Е. Ю., Л. С. Жигис, В. С. Зуева, Э. Э. Мельников, В. П. Зубов, Л. В. Козлов, А. М. Бичучер, О. В. Котельникова, А. П. Аллилуев, Л. Д. Румш. Выделение и определение активности IgA1 — протеазы из культуры Neisseria meningitidis. // Биоорганическая химия, 2010, т. 36, № 1, с. 96–105.
  3. Аллилуев А. П., Ягудаева Е. Ю., Жигис Л. С., Козлов Л. В., Котельникова О., Зуева В. С., Разгуляева О. А., Мельников Э. Э., Бичучер А. М., Зубов В. П., Анохина И. В., Аваков А. Э., Румш Л. Д. Способ получения IgA1 протеазы из культуры Neisseria meningitidis серогруппы А и иммуногенный препарат на её основе. Положительное решение о выдаче патента на изобретение № 2009136634/10(051758) от 05.10.2009 г.
  4. Alliluev A.P., Yagudaeva E.Yu., Zhigis L.S., Kozlov L.V., Kotelnikova O.V., Zueva V.S., Razgulyaeva O.A., Melnikov E.E., Bichucher A.M., Zubov V.P., Anokhina I.V., Avakov A.E., Rumsh L.D. Method for obtaining of IgA1-protease from cultural fluid of N. meningitidis, serogroup A and vaccine preparation for the prophylaxis of bacterial infection induced by bacteria N. meningitidis, serogroup B. Международная патентная заявка № PCT/RU2010/000541 подана 30.09. 2010 г.
  5. Подготовлена заявка на оформление патента: «Способ получения рекомбинантной IgA1-протеазы Neisseria meningitidis серогруппы В, рекомбинантная плазмида pET-IgA1, штамм E. coli суперпродуцент IgA1-протеазы и вакцинный препарат на ее основе».

АТР-зависимые Lon-протеиназы — ключевые компоненты системы контроля качества белков, поддерживающей сохранность клеточного протеома. Lon-протеиназы относятся к суперсемейству ААА+-белков, которые обычно включают N-концевой домен и один или два АТР-азных модуля (ААА+-модули), образованных нуклеотид-связывающим (NB) и специфическим альфа-спирализованным (α или Н) доменами.

Впервые установлено, что Lon-протеиназы подсемейства А представляют уникальный тип ААА+-белков, АТР-азная составляющая которых включает три домена (рис.): нуклеотид-связывающий и два фланкирующих его альфа-спирализованных, один из которых подобен соответствующим доменам шаперонов-дезагрегаз семейства ClpB/Hsp104 и содержит вставочный субдомен со специфической coiled-coil конформацией. Полученные результаты свидетельствуют о тесном эволюционном родстве АТР-зависимых протеиназ и шаперонов ClpB/Hsp104 и могут служить основой для поиска новых биологических функций ферментов подсемейства LonА.

  1. Ротанова Т. В., Мельников Э. Э. АТР-Зависимые протеиназы и протеолитические комплексы внутриклеточной деградации белков. Биомед. химия, 54(5), 512–530 (2008). Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 2(3), 245–257 (2008).
  2. Мельников Э. Э., Ротанова Т. В. Молекулярные шапероны (обзор). Биоорган. химия, 36(1), 5–14 (2010).
  3. Ротанова Т. В., Мельников Э. Э. Новый взгляд на строение некаталитической N-концевой области АТР-зависимых LonА-протеиназ. Биомед. химия, 56(3), 412–419 (2010). Rotanova T.V., Melnikov E.E. A novel view on the architecture of the non-catalytic N-terminal region of ATP-dependent LonA proteases. Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 4(4), 404–408 (2010).
  4. Li M., Gustchina A., Rasulova F., Melnikov E.E., Maurizi M.R., Rotanova T.V., Dauter Z., Wlodawer A. Crystal structure of the N-terminal fragment of E. coli Lon protease. Acta Crystallogr., Sec. D, Biol. Crystallogr., 66 (Pt 8), 865–873 (2010).

Статистику по публикациям за 2010 год можно посмотреть в разделе «Документы» (доступно только сотрудникам Института).

Основные достижения Института, представленные в Президиум РАН

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов (Гришин Е. В.), Научно-исследовательский отдел «Научно-образовательный центр» (Овчинникова Т. В.)

Из природных источников впервые выделены новые полипептиды, обладающие уникальным спектром биологической активности:

  1. β/δ-агатоксины из яда паука Agelena orientalis — модуляторы потенциал-зависимых натриевых каналов насекомых;
  2. антимикробный пептид WAMP-1а из семян пшеницы Triticum kiharae, имеющий необычный тип укладки полипептидной цепи;
  3. двухкомпонентный пептидный антибиотик лихеницидин, включающий два неизвестных ранее и обладающих синергическим действием антимикробных пептида — Lch-α и Lch-β из термофильной бактерии Bacillus licheniformis VK21.

Для всех указанных пептидов определены аминокислотные последовательности и методами спектроскопии ЯМР установлены пространственные структуры в водном растворе. Полученные результаты создают надежную основу как для установления молекулярных механизмов действия полипептидов, так и для их использования в медицине (действие β/δ-агатоксинов на натриевые каналы насекомых и млекопитающих, антимикробная активность Lch-α / Lch-β в отношении широкого круга микроорганизмов) и в сельском хозяйстве (для повышения устойчивости сельскохозяйственных растений к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды).

Лаборатория рентгеноструктурного анализа, Лаборатория биофотоники, Лаборатория молекулярных технологий, группа химии хромопротеинов

На основании данных рентгеноструктурного анализа исследованы молекулярные механизмы формирования хромофорных центров в зеленых флуоресцентных белках (ФБ) группы aceGFP — флуоресцентном белке aceGFP, его нефлуоресцентном варианте aceGFP с точечной заменой G222E (aceGFP_G222E) и фотоконвертированном аналоге aceGFP_G222E, подвергнутом облучению в УФ-области. С атомным разрешением установлены факторы, определяющие спектральные характеристики указанных GFP-белков в процессе их созревания. В кристаллической структуре бесцветного нефлуоресцентного aceGFP-G222E при разрешении 1.14 Å была установлена промежуточная форма биосинтеза хромофора зеленых ФБ. Эта впервые экспериментально наблюдаемая структура незрелого хромофора характеризуется некопланарным расположением имидазолонового и фенольного циклов. Полученные данные важны для последующего рационального конструирования новых биомаркеров с заранее заданными фотофизическими характеристиками для практических целей.

  1. Subach FV, Zhang L, Gadella TW, Gurskaya NG, Lukyanov KA, Verkhusha VV. (2010). Red fluorescent protein with reversibly photoswitchable absorbance for photochromic FRET. Chem. Biol. 17, 745–755;
  2. Mishina N, Tyurin-Kuzmin P, Markvicheva K, Vorotnikov A, Tkachuk V, Laketa V, Schultz C, Lukyanov S, Belousov V. (2011). Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally? Antioxid. Redox Signal. 14, 1–7.

Группа иммунохимии ФИБХ. Создание высокоэффективной тест-системы для детекции энтеротоксинов стафилококков

Совместно с Институтом молекулярной биологии РАН и Институтом эпидемиологии и микробиологии РАМН на основе биочипа создана высокоэффективная тест-система для одновременной детекции в анализируемой пробе семи стафилококковых энтеротоксинов с чувствительностью 100–500 пг/мг и временем анализа 2 часа. Созданная тест-система не имеет зарубежных аналогов.

Энтеротоксины стафилококков являются одной из наиболее распространенных причин пищевых отравлений, они могут быть причиной аллергических реакций и ряда аутоиммунных заболеваний. Из более чем 20 известных энтеротоксинов наибольшую опасность представляют 9 токсинов. В ИБХ РАН совместно с Институтом молекулярной биологии РАН и Институтом эпидемиологии и микробиологии РАМН получены высокоспецифичные моноклональные антитела к семи рекомбинантным энтеротоксинам A, B, C1, D, E, G, I, на основе которых создан гидрогелевый биочип для одновременной детекции этих энтеротоксинов. Тест-система позволяет достоверно определять 100–500 пг/мл энтеротоксинов. Тест-система апробирована на биологических жидкостях и пищевых продуктах при этом показана хорошая воспроизводимость и надежность метода.

8 февраля 2011 года