Лаборатория белков гормональной регуляции

Отдел пептидно-белковых технологий

Руководитель: Липкин Валерий Михайлович, чл.-корр. РАН
vmlipkin@ibch.ru+7(495)336-61-66

Белки, пептиды, дифференцировка, апоптоз, болезнь Альцгеймера, ишемия, миопия

Лаборатория исследует белки, включенные в процессы трансмембранной передачи сигналов, дифференцировки и апоптоза клеток, и новые белки и пептиды, связанные с патогенезом социально-значимых заболеваний. По результатам исследований разрабатываются новые подходы для лечения и диагностики этих заболеваний. Кроме того, Лаборатория разрабатывает методики генотипирования, применяемые в сельском хозяйстве.

Сотрудники Лаборатории открыли и изучили новый фактор дифференцировки клеток крови (HLDF), который подавляет пролиферацию промиелоцитарных лейкемических клеточных линий. В составе фактора был идентифицирован шестичленный пептид HLDF-6 (TGENHR), обладающий ноотропной и нейропротективной активностью. В процессе успешных доклинических испытаний на экспериментальных моделях клинической патологии (болезни Альцгеймера и ишемического инсульта) группа  Анны Пайзеновны Богачук показала, что защищенная амидированием по С-концевой карбоксильной группе форма пептида (HLDF-6-NH2) значительно превышает активность исходной формы пептида, практически полностью восстанавливает нарушенные когнитивные функции, не вызывает токсических эффектов и может быть рекомендована для проведения дальнейших клинических исследований.

Внимание исследователей привлек и другой нейротропный фактор – PEDF (Pigment Epithelium Derived Factor), который при близорукости накапливается и способствует образованию амилоидоподобных фибриллярных структур. Это знание открывает новые подходы к лечению данного широко распространенного заболевания глаз.

Сотрудники проводят исследования впервые выделенного в Лаборатории белка EIF1AD (гапонина), который регулирует процессы в организме, связанные с окислительным стрессом (ОС). EIF1AD локализован в ядре и контролирует транскрипционную активность белка р53, вызываемую активными формами кислорода. Подавление экспрессии EIF1AD с помощью кшРНК ингибирует апоптоз, вызываемый ОС, и способствует выживаемости клеток, например, при ультрафиолете, гамма-облучении или при воспалении.

Группа Татьяны Маратовны Шуваевой разрабатывает методики для генотипирования крупного рогатого скота для идентификации генетических болезней и дальнейшего улучшения породности стада.

Лаборатория сотрудничает с лабораториями Института, а также с Институтом нормальной физиологии им. П.К. Анохина, Институтом фармакологии им. В.В. Закусова, Институтом биофизики клетки РАН, Институтом молекулярной генетики РАН, Московским НИИ глазных болезней им. Гельмгольца Минздрава России, Российским Университетом дружбы народов, Кубанским государственным аграрным университетом имени И.Т. Трубилина, Отделом Медицинской биохимии и биофизики Университета Умеа Швеция и др.

Лаборатория образована в 1986 году на базе группы Отдела химии белка, который возглавлял Юрий Анатольевич Овчинников.

  1. Физико-химическая биология.
  2. Исследования структуры и механизма функционирования белков, включенных в процессы трансмембранной передачи сигналов, дифференцировки и апоптоза клеток.
  3. Идентификация и структурно-функциональные исследования новых белков и пептидов, связанных с патогенезом социально-значимых заболеваний, и разработка на их основе новых подходов для лечения и диагностики этих заболеваний.

1986—1997 гг. Установлена первичная структура всех субъединиц фоторецепторной фосфодиэстеразы цГМФ быка и человека. С использованием иммунохимических методов и направленного мутагенеза в фоторецепторной фосфодиэстеразе цГМФ локализованы функционально значимые аминокислотные остатки и выяснены механизмы фотоактивации и ингибирования фермента. Работе присуждена премия РАН имени Ю. А. Овчинникова.

1994—2011 гг. Открыт и изучен новый фактор дифференцировки клеток крови (HLDF). Фактор подавляет пролиферацию промиелоцитарных лейкемических клеточных линий и вызывает их дифференцировку. В HLDF локализованы активные центры белка и установлено, что шестичленный пептид HLDF-6 (TGENHR) полностью воспроизводит дифференцирующую активность фактора. Пептид HLDF-6 обладает широким спектром ноотропной и нейропротективной активностей. Исследования на различных видах животных показали, что при введении HLDF-6 наблюдается улучшение формирования и сохранения долговременной памяти. На экспериментальных моделях клинической патологии - болезни Альцгеймера (БА) и ишемического инсульта пептид HLDF-6 снимает выраженный когнитивный дефицит и способствует восстановлению нарушенной памяти.

1999-2012. Показано, что пептид HLDF-6 снижает динамику опухолевой прогрессии и развития метастазов, потенцирует активность химиотерапевтических препаратов и поддерживает качество жизни пациента. В экспериментах in vitro на первичных культурах клеток лимфосаркомы LS и лимфолейкоза P-388 пептид обладает прямым ингибирующим действием на опухолевые клетки, сравнимым с эффектом сарколизина или алкерана. В исследованиях in vivo на животных противоопухолевый эффект пептида проявлялся в ингибировании роста первичной опухоли (при лимфолейкозе Р-388), потенцировании цитостатического эффекта циклофосфана (при лимфосаркоме LS и лимфолейкозе Р-388) и ослаблении процесса метастазирования (при карциноме легких Льюис). На экспериментальных моделях солидных и асцитной опухолей инъекции пептида приводят к полному распаду опухолевой ткани, купированию развития опухоли без возникновения рецидива, повышению выживаемости животных, увеличению времени жизни и улучшению ее качества.

Серии статей, посвященных исследованию HLDF, присуждена Премия МАИК НАУКА.

1996—2014 гг. Из обонятельного эпителия крысы выделено два новых секреторных белка с молекулярной массой 28 и 45 кДа. Установлены их полные аминокислотные последовательности. Белок 28 кДа идентифицирован как пероксиредоксин VI. Показано, что он играет роль антиоксиданта и может быть использован в качестве нового лекарственного препарата, способствующего регенерации поврежденных тканей и органов человека (совместно с Институтом биофизики клетки РАН). Разработан безплазмидный штамм-продуцент пероксиредоксина VI человека и на его основе создан опытный образец лекарственной формы импортозамещаемого препарата «Постеризан», характеризующийся синергизмом лечебного действия лекарства «Постеризан» и ранозаживляющими эффектами пероксиредоксина VI.

В структуре белка 45 кДа (Sec14L3) найден липид-связывающий домен. Установлено, что белок принадлежит к классу липид-переносящих, а его специфическим лигандом является фосфатидилинозит-(3,4,5)-трифосфат. В условиях острого воспалительного процесса идет резкое накопление Sec14L3, сопровождающееся появлением в тканях двух новых хитиназоподобных белков — белка rYM1olf и укороченной формы AMCase - sAMCase (365 а.к.). При этом в условиях воспаления повышается не только уровень Sec14L3, но и обоих хитиназоподобных белков. Установлена аминокислотная последовательность этих белков. Выяснено, что sAMCase образуется в результате альтернативного сплайсинга гена полноразмерного белка fAMCase – ChhA. Показана четкая зависимость уровня экспрессии сплайсированного продукта гена АМСаse от стадии заболевания.  Высказано предположение, что укороченная форма АМС-азы может служить маркером ранней стадии течения воспалительного процесса, а потенциальная хронизация болезни и возможность рецидивирующего течения может быть ассоциирована с накоплением только полноразмерной формы АМС-азы.     

2006—2014 гг. В процессе изучения функциональной роли нейротропного фактора из пигментного эпителия PEDF (Pigment Epithelium Derived Factor) при возникновении миопии было показано, что в норме фактор PEDF, секретируемый фибробластами склеры, подвергается ограниченному протеолизу по связи 382Leu-383Тhr, в результате чего происходит отщепление C-концевого фрагмента. При близорукости этот процесс нарушается, что приводит к накоплению в околоклеточном пространстве полноразмерного PEDF, сопровождающегося образованием амилоидоподобных фибриллярных структур. Патологическое фибриллообразование является причиной ослабления опорной функции склеры, и, как следствие, патологического растяжения и дистрофии сосудистой оболочки и сетчатки миопического глаза. Обнаружение того факта, что близорукость сопровождается образованием патологических фибрилл, открывает новые подходы к лечению данного широко распространенного заболевания глаз. Мы предполагаем, что использование соединений, препятствующих образованию фибрилл, позволит остановить прогрессию миопии.

2006-2015 гг. В клетках линии промиелоцитарного лейкоза человека HL-60 обнаружен новый белок с молекулярной массой 19,2 кДа – EIF1AD («гапонин», haponin – HLDF-alike protein) и определена его аминокислотная последовательность. C помощью созданной панели генетически модифицированных клеточных линий человека с изменёнными уровнями экспрессии EIF1AD было установлено, что EIF1AD является ядерным белком, регулирующим клеточный ответ на окислительный стресс (ОС). Установлено взаимодействие EIF1AD с глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназой (GAPDH) и активируемыми ОС транскрипционными факторами р53 и STAT1, а также показана зависимость транскрипционной активности последних от уровня экспрессии EIF1AD в клетке в норме и при стрессовых и митогенных воздействиях.

2012-2015. Проведены доклинические исследования пептида HLDF-6  с целью разработки лекарственного средства для профилактики и лечения нейродегенеративных (болезнь Альцгеймера) и цереброваскулярных (ишемический инсульт) заболеваний. Идентифицирована наиболее активная форма пептида HLDF-6, обладающая нейропротекторной и ноотропной активностью. При сравнительном изучении активности  исходного пептида и пептида, защищенного от действия протеаз с С-конца амидной группой, установлено, что защищенная форма пептида во всех исследованных животных моделях болезни Альцгеймера и ишемического инсульта практически полностью восстанавливает нарушенные когнитивные функции, превышая эффективность исходного пептида. Проведено изучение острой, субхронической и хронической токсичности, аллергенности, мутагенности и механизма действия амидной формы пептида.

На основании проведенного исследования было сделано заключение о том, что лекарственное средство на основе амидной формы пептида HLDF-6 при многократном интраназальном введении самцам и самкам крыс не вызывает токсических эффектов и является безопасным. Лекарственное средство (ЛС) на основе амидной формы пептида HLDF-6 при дозе 5000 мг/кг не вызывает токсических эффектов, соответствует требованиям самого низкого 4 класса опасности «вещества малоопасные» и может быть рекомендовано для проведения дальнейших исследований. Преимущества нашего препарата перед другими существующими лекарственными средствами определяются по совокупности таких лечебных свойств как: оригинальность, выраженность терапевтического действия, высокий уровень и широкий спектр комбинированной ноотропной и нейропротекторной активности (эффективное влияние на оба заболевания – БА и ишемический инсульт), высокая эффективность в малых и сверхмалых дозах, отсутствие нежелательных побочных эффектов.

Патент Российской Федерации № 2557003. Богачук АП, Сторожева ЗИ, Золотарев ЮА, Ковалев ГИ, Азев ВН, Липкин ВМ. Пептид, обладающий нейропротекторной и ноотропной активностью, и фармацевтическая композиция на его основе. Дата регистрации 22.06.2015.

Лаборатория белков гормональной регуляции.Сидят (слева направо): м. н. с. Минкевич Н. И., студ. Богатова О. В., с. н. с., к. х. н. Артамонов И. Д., член-корр. РАН Липкин В., н. с. Сурина Е. А. Стоят (слева направо): с. н. с., к. х. н. Ракитина Т. В., студ. Родионова А. С., н. с., к. б. н. Радченко В. В., м. н. с., к. б. н. Ванина В. И., с. н. с., к. х. н. Костанян И. А., в. н. с., д. х. н. Шуваева Т. М., инж. Смирнова И. В., с. н. с., к. х. н. Богачук А. П.. студ. Соколова Н. С., м. н. с. Гарковенко А. В., н. с. Какуев Д. Л.

 

Ф.И.О.ДолжностьКонтакты
Липкин Валерий Михайлович, чл.-корр. РАНрук. подр.vmlipkin@ibch.ru+7(495)336-61-66
Шуваева Татьяна Маратовна, д. х. н.в.н.с.shuvaeva@mx.ibch.ru+7(495)336-51-11
Богачук Анна Пайзеновна, к. х. н.с.н.с.apbogachouk@gmail.com+7(495)336-51-11
Ракитина Татьяна Владимировна, к. х. н.с.н.с.taniarakitina@yahoo.com+7(495)330-63-47
Какуев Дмитрий Леонидовичн.с.dkakuev@mail.ru+7(495)330-63-47
Радченко Виталий Владиславович, к. б. н.н.с.vitalyradchenko@yandex.ru+7(495)336-55-11
Сурина Елена Анатольевнан.с.surinae@mx.ibch.ru+7(495)336-55-11
Смирнова Евгения Владимировна, к. б. н.н.с.smirnova.evgeniya@gmail.com+7(495)330-63-47
Ильницкая Елена Вячеславовна, к. х. н.м.н.с.nevrilemma@yandex.ru+7(495)335-26-00
Гарковенко Алексей Вячеславовичм.н.с.garkovenko@gmail.com+7(495)330-63-47
Минкевич Наталья Игоревна, к. б. н.м.н.с.ni-minkevich@gmail.com+7(495)336-55-11
Воробьева Елена Евгеньевнаасп.e-elena777@yandex.ru
Фролова Анастасия Юрьевнатех.-лаб.
Смирнова Ирина Валентиновнаинж.-иссл.smirnova@mx.ibch.ru+7(495)336-55-11

Ранее здесь работали:

Артамонов Игорь Дмитриевич, к. х. н.с.н.с.
Костанян Ирина Александровна, к. х. н.с.н.с.

Избранные публикации

  1. Ilnitskaya E.V., Radchenko V.V., Rodionova A.S., Kosyreva A.M., Shuvaeva T.M., Lipkin V.M. (2013). Cloning and sequence analysis of cDNA encoding a new short form of rat acid chitinase. Dokl. Biochem. Biophys. 452 (1), 241–4 ID:1052
  2. Minkevich N.I., Rakitina T.V., Bogachuk A.P., Radchenko V.V., Surina E.A., MorozovaRoche L.A., Yanamandra K., Iomdina E.N., Babichenko I.I., Kostanian I.A., Lipkin V.M. (2012). [Amyloid-like fibrils forming and fibroblasts destruction in Tenon's capsule in progressive myopia as a result of pigment epithelium derived factor resistance to restricted proteolysis]. Bioorg. Khim. 38 (6), 683–90 [+]

    We have shown previously the presence of full length (50 kD) and truncated proteolytic form (45 kD) of pigment epithelium derived factor (PEDF) in the eye Tenon's capsule in progressive myopia. The full length PEDF is prevalent in myopia that correlates with breach in collagen fibrils forming. Immunohistochemical analysis of Tenon's capsule with polyclonal antibodies to PEDF revealed PEDF in control group being exclusively inside fibroblasts, whereas in myopia, PEDF was distributed extracellularly as halo around blasted fibroblasts. By means of atomic force microscopy and immunodot analysis with anti amyloid fibrils antibodies the ability was studied of recombinant PEDF fragments to form fibrils. Only full length PEDF was shown to form amyloid like fibril structures, but not the truncated form. Accumulation offibrils results in fibroblasts destruction and might be the cause of changes in biochemical and morphological structure of Tenon's capsule observed in myopia.

    ID:1053
  3. Smirnova E.V., Rakitina T.V., Bogatova O.V., Ivanova D.L., Vorobyeva E.E., Lipkin A.V., Kostanyan I.A., Lipkin V.M. (2011). Novel protein haponin regulates cellular response to oxidative stress. Dokl. Biochem. Biophys. 440, 225–7 ID:1054
  4. Kostanyan I.A., Storozheva Z.I., Semenova N.A., Lipkin V.M. (2009). Postischemic administration of HLDF-6 peptide ameliorates cognitive dysfunction and brain damage induced by chronic cerebral ischemia in rats. Dokl. Biol. Sci. 428, 418–22 ID:1056
  5. Merkulova M., Huynh H., Radchenko V., Saito K., Lipkin V., Shuvaeva T., Mustelin T. (2005). Secretion of the mammalian Sec14p-like phosphoinositide-binding p45 protein. FEBS J. 272 (21), 5595–605 [+]

    Protein-lipid interactions are important for protein targeting, signal transduction, lipid transport, and the maintenance of cellular compartments and membranes. Specific lipid-binding protein domains, such as PH, FYVE, PX, PHD, C2 and SEC14 homology domains, mediate interactions between proteins and specific phospholipids. We recently cloned a 45-kDa protein from rat olfactory epithelium, which is homologous to the yeast Sec14p phosphatidylinositol (PtdIns) transfer protein and we report here that this protein binds to PtdIns(3,4,5)P3 and far weaker to less phosphorylated derivatives of PtdIns. Expression of the p45 protein in COS-1 cells resulted in accumulation of the protein in secretory vesicles and in the extracellular space. The secreted material contained PtdIns(3,4,5)P3. Our findings are the first report of a Sec14p-like protein involved in transport out of a cell and, to the best of our knowledge, inositol-containing phospholipids have not previously been detected in the extracellular space. Our findings suggest that p45 and phosphoinositides may participate in the formation of the protective mucus on nasal epithelium.

    ID:1055
  6. Rzhevsky D.I., Zhokhov S.S., Babichenko I.I., Goleva A.V., Goncharenko E.N., Baizhumanov A.A., Murashev A.N., Lipkin V.M., Kostanyan I.A. (2005). HLDF-6 peptide affects behavioral reactions and organism functions dependent on androgen hormones in normal and castrated male mice. Regul. Pept. 127 (1-3), 111–21 [+]

    The hexapeptide Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg (HLDF-6), which was first identified as an active fragment of the human leukemia differentiation factor (HLDF) molecule, displays differentiation-inducing, neuroprotective and anti-drug abuse activities. Most of its in vivo effects were revealed only on male animals. We have studied HLDF-6 effects on a variety of organism functions and behavioral reactions, which are known to be dependent on androgen steroid hormones, both on castrated and normal (sham-operated) animals. Male NMRI mice were castrated or sham-operated at the age of 55 days (after puberty). After that, HLDF-6 peptide was injected daily during 3 weeks, followed by behavioral, morphological and biochemical testing. HLDF-6 increased testosterone level (1.5- to 2-fold) both in sham-operated and castrated animals. Sexual activity and pain sensitivity, which are strongly reduced in castrates, were completely or partially recovered by HLDF-6. At the same time, the peptide caused some effects similar to castration in sham-operated animals: aggression and locomotor activity were decreased; oral grooming was prolonged. Morphological studies of accessory sex glands showed that HLDF-6 partially normalizes the morphology and functional activity of seminal vesicles in castrates, but it does not prevent castration-induced apoptosis of prostate epithelial cells. Based on these observations, we can assume that HLDF-6 peptide displays at least two effects on androgen hormones metabolism in males: it stimulates testosterone biosynthesis by both testes and adrenals and simultaneously inhibits its conversion to dihydrotestosterone (DHT), most probably by diminution of 5alpha-reductase isoform 1 mRNA expression.

    ID:51
  7. Merkulova M.I., Andreeva S.G., Shuvaeva T.M., Novoselov S.V., Peshenko I.V., Bystrova M.F., Novoselov V.I., Fesenko E.E., Lipkin V.M. (1999). A novel 45 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium: primary structure and localisation. FEBS Lett. 450 (1-2), 126–30 [+]

    cDNA clones encoding the 45 kDa protein were isolated from a rat olfactory epithelium cDNA library and their inserts were sequenced. The reconstructed protein sequence comprises 400 amino acids with a calculated molecular mass of 46,026 Da. A homology was revealed between the amino acid sequence of the 45 kDa protein and the proteins involved in the transfer of hydrophobic ligands. Using in situ hybridisation, the 45 kDa protein mRNA expression was detected in the layer of supportive cells of olfactory epithelium, apical region of trachea, surface layer of the ciliated bronchial epithelium in lung and in skin epidermis.

    ID:50
  8. Kostanyan I.A., Astapova M.V., Starovoytova E.V., Dranitsina S.M., Lipkin V.M. (1994). A new human leukemia cell 8.2 kDa differentiation factor: isolation and primary structure. FEBS Lett. 356 (2-3), 327–9 [+]

    A new 8.2 kDa differentiation factor has been purified to homogeneity from the cultural media of human myelogenous HL-60 leukemia cells induced by retinoic acid. cDNA clones encoding this factor were isolated from a cDNA library prepared from HL-60 differentiated cells and their nucleotide sequence has been determined. The deduced amino acid sequence of the differentiation factor molecule consists of 54 amino acid residues. The protein is shown to be glycosylated. It was shown by Northern blot experiments that the level of poly(A)+ RNA with a length of 450 nucleotides was higher in differentiated cells than in non-differentiated cells.

    ID:49
  9. Khramtsov N.V., Feshchenko E.A., Suslova V.A., Shmukler B.E., Terpugov B.E., Rakitina T.V., Atabekova N.V., Lipkin V.M. (1993). The human rod photoreceptor cGMP phosphodiesterase beta-subunit. Structural studies of its cDNA and gene. FEBS Lett. 327 (3), 275–8 [+]

    cDNA clones encoding the beta-subunit of the photoreceptor cGMP phosphodiesterase (PDE) were isolated from a human retina library and their sequence was determined. The encoded polypeptide consists of 854 amino acid residues with a calculated molecular mass of 98,416 Da. Alignment of the deduced amino acid sequence with the earlier analysed alpha-, beta- and alpha'-subunits of bovine and mouse PDEs demonstrates a high homology. Two overlapping recombinant lambda phage clones containing 26 kb of the human PDE beta-subunit gene were isolated from the genomic library. A total nucleotide sequence of exons 4-22 of the PDE beta-subunit gene was established which completely corresponded to the cDNA structure. According to sequence analysis no potential possibility for alternative splicing of the beta-subunit gene was observed between exons 20 and 21 which led to the formation of the beta'-subunit as described for mouse PDE. Polymerase chain reaction (PCR) experiments also confirm the absence of the PDE beta'-subunit in human retina.

    ID:48
  10. Lipkin V.M., Khramtsov N.V., Vasilevskaya I.A., Atabekova N.V., Muradov K.G., Gubanov V.V., Li T., Johnston J.P., Volpp K.J., Applebury M.L. (1990). Beta-subunit of bovine rod photoreceptor cGMP phosphodiesterase. Comparison with the phosphodiesterase family. J. Biol. Chem. 265 (22), 12955–9 [+]

    A group of cDNA clones encoding the beta-subunit of bovine rod photoreceptor cGMP phosphodiesterase were isolated for structural analysis. The encoded polypeptide has 853 residues with a calculated molecular mass of 98 kDa. The beta-subunit is 72% identical to the rod cGMP phosphodiesterase alpha-subunit. Like the alpha-subunit and the cone alpha'-subunit, the beta-subunit belongs to the family of phosphodiesterase genes. The beta- and alpha-subunits are more similar to each other than either is to the cone alpha'-subunit, suggesting either that the beta- and alpha-subunits diverged more recently or that their divergence was restrained by the rod functional environment.

    ID:47

Липкин Валерий Михайлович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. ФИБХ, комн. БОН/203
  • Тел.: +7(4967)79-39-71
  • Эл. почта: vmlipkin@ibch.ru