Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов

Отдел биофотоники

Руководитель: Лукьянов Константин Анатольевич

Флуоресцентные белки, фотоактивируемые флуоресцентные белки, генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры, мечение живых клеток, генетически кодируемые фотосенсибилизаторы

Лаборатория работает над созданием новых флуоресцентных меток и методов флуоресцентного мечения биологических объектов. Особый интерес для нас представляют флуоресцентные белки семейства GFP (Green fluorescent protein) и другие методы неинвазивного флуоресцентного мечения, которые позволяют наблюдать структуры и процессы в живых клетках. Такие методы находят широкое применение в биомедицинских исследованиях, помогая расшифровать молекулярные механизмы разнообразных нормальных и патологических процессов и упрощая проведение доклинических испытаний лекарственных препаратов.

Лаборатория оснащена всем необходимым для проведения генно-инженерных работ, ведения культур клеток млекопитающих, флуоресцентной и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и оптической спектроскопии.

Лаборатория активно сотрудничает со многими лабораториями и группами Института: группой синтеза природных соединений ИБХ по изучению физико-химических свойств хромофоров флуоресцентных белков и созданию методов флуоресцентного мечения на основе их аналогов; с лабораторией молекулярных технологий ИБХ по разработке новых флуоресцентных сенсоров; с лабораторией рентгеноструктурного анализа ИБХ по анализу пространственной структуры флуоресцентных белков и направленному изменению их спектральных свойств; с лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ по применению флуоресцентных инструментов для изучения индивидуального развития.

Кроме того, Лаборатория работает над исследованиями совместно с Научно-исследовательским институтом биомедицинских технологий Нижегородской государственной медицинской академии по развитию методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, а также по применению флуоресцентного мечения в мышиных моделях опухолеобразования; с лабораторией физической биохимии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН по развитию методов время-разрешенной микроскопии для анализа биологических объектов; с Кириллом Солнцевым (Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA) по время-разрешенной спектроскопии флуоресцентных белков и хромофоров; с лабораторией Анны Крыловой (University of Southern California, Los Angeles, CA) по изучению физико-химических процессов во флуоресцентных белках; с лабораторией Владислава Верхуши (Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY) по созданию новых флуоресцентных белков; с лабораторией Jens Meiler (Vanderbilt University, Nashville, TN) по компьютерному моделированию флуоресцентных белков.

Лаборатория была образована в 2009 году (с 2009 по март 2020 носила название лаборатории биофотоники) путем выделения из лаборатории молекулярных технологий для биологии и медицины под руководством Сергея Анатольевича Лукьянова. Коллектив работает с флуоресцентными белками с 1999 года.

Новые флуоресцентные белки

GFP и другие флуоресцентные белки широко применяются как генетически кодируемые метки для визуализации белков и клеточных популяций в живых системах. Мы используем направленный и случайный мутагенез для создания новых вариантов флуоресцентных белков. Такой подход позволяет получать белки с необычными спектральными свойствами, определяемыми новыми хромофорными группами или аминокислотным окружением хромофора. Кроме того, мы работаем над улучшением таких характеристик, как яркость и фотостабильность, важных для практического применения  флуоресцентных белков. 

Chudakov DM, et al. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 2010, 90, 1103-63.

Pletnev VZ, et al. Structure of the red fluorescent protein from a lancelet (Branchiostoma lanceolatum): a novel GYG chromophore covalently bound to a nearby tyrosine. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013, 69, 1850-60.

Sarkisyan KS, et al. Green fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophys J. 2015, 109, 380-9.

Mishin AS, et al. Novel uses of fluorescent proteins. Curr Opin Chem Biol. 2015, 27, 1-9.

Sarkisyan KS, et al. Local fitness landscape of the green fluorescent protein. Nature. 2016, 533, 397-401.

Bozhanova NG, et al. Yellow and Orange Fluorescent Proteins with Tryptophan-based Chromophores. ACS Chem Biol. 2017 Jul 21;12(7):1867-1873.

Povarova NV, et al. Functioning of Fluorescent Proteins in Aggregates in Anthozoa Species and in Recombinant Artificial Models. Int J Mol Sci. 2017 Jul 12;18(7). pii: E1503. doi: 10.3390/ijms18071503.

Bozhanova NG, et al. Protein labeling for live cell fluorescence microscopy with a highly photostable renewable signal. Chem. Sci., 2017, 8, 7138-7142.

 

Новые генетически кодируемые сенсоры

Мы ведем работу по созданию новых сенсоров на различные регуляторные активности на основе флуоресцентных белков, которые позволяют проводить количественную визуализацию целевых процессов в живых клетках. Например, недавно нами был разработан сенсор активности каскада нонсенс-опосредованной деградации мРНК (nonsense-mediated mRNA decay, NMD), а также дальнекрасный сенсор активности каспазы-3.

Gurskaya NG, et al. Analysis of alternative splicing of cassette exons at single-cell level using two fluorescent proteins. Nucleic Acids Res. 2012, 40, e57.

Pereverzev AP, et al. Method for quantitative analysis of nonsense-mediated mRNA decay at the single cell level. Sci Rep. 2015, 5, 7729.

Zlobovskaya OA, et al. Genetically encoded far-red fluorescent sensors for caspase-3 activity. Biotechniques. 2016, 60, 62-8.

Sergeeva TF, et al. Relationship between intracellular pH, metabolic co-factors and caspase-3 activation in cancer cells during apoptosis. Biochim Biophys Acta. 2017, 1864(3):604-611.

Kost LA, Nikitin ES, Ivanova VO, Sung U, Putintseva EV, Chudakov DM, Balaban PM, Lukyanov KA, Bogdanov AM. Insertion of the voltage-sensitive domain into circularly permuted red fluorescent protein as a design for genetically encoded voltage sensor. PLoS One. 2017 Sep 1;12(9):e0184225.

 

Фотоконверсии флуоресцентных белков

Фотоактивируемые флуоресцентные белки (ФАФБ) широко используются для слежения за движением белков, органелл и клеток в живых системах, а также во флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Ранее нашим коллективом были получены одни из первых ФАФБ, такие как KFP1, PS-CFP и Dendra. В настоящее время мы продолжаем работы по получению новых ФАФБ, а также созданию новых методов их применения.

В 2009 г нами была открыта окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков, основанная на передаче электронов от хромофора на молекулу внешнего акцептора электронов. Мы продолжаем исследование механизмов данного явления и разработку методов его практического использования (например, для увеличения фотостабильн ости флуоресцентных белков).

В сотрудничестве с Нижегородской медицинской академией мы работаем над новыми метками и методами флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения на основе детекции единичных молекул (локализационная микроскопия единичных молекул PALM/STORM).

Chudakov DM, et al. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat Biotechnol. 2003, 21, 191-4. 

Gurskaya NG, et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 2006, 24, 461-5.

Bogdanov AM, et al. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nat Chem Biol. 2009, 5, 459-61.

Bogdanov AM, et al. Cell culture medium affects GFP photostability: a solution. Nat Methods. 2009, 6, 859-60.

Mamontova AV, et al. Influence of cell growth conditions and medium composition on EGFP photostability in live cells. Biotechniques. 2015, 58, 258-61.

Bogdanov AM, et al. Turning On and Off Photoinduced Electron Transfer in Fluorescent Proteins by π-Stacking, Halide Binding, and Tyr145 Mutations. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 4807-4817.

Acharya A, et al. Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing? Chem Rev. 2017 Jan 25;117(2):758-795.

Klementieva NV, et al. Green-to-red primed conversion of Dendra2 using blue and red lasers. Chem Commun (Camb). 2016 Nov 18;52(89):13144-13146.

Klementieva NV, et al. Intrinsic blinking of red fluorescent proteins for super-resolution microscopy. Chem Commun (Camb). 2017 Jan 10;53(5):949-951.

 

Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы

Фототоксичные флуоресцентные белки, первый из которых – KillerRed – был создан нами в 2006 году, продуцируют активные формы кислорода (АФК) при облучении светом. Мы продолжаем развитие данной оптогенетической технологии, которая дает возможность создавать окислительный стресс в целевых клеточных компартментах, инактивировать белки и вызывать клеточную гибель специфических клеточных популяций с помощью света.

Bulina ME, et al. A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol. 2006, 24, 95-9.

Lukyanov KA, et al. Fluorescent proteins as light-inducible photochemical partners. Photochem Photobiol Sci. 2010, 9, 1301-6.

Serebrovskaya EO, et al. Phototoxic effects of lysosome-associated genetically encoded photosensitizer KillerRed. J Biomed Opt. 2014,19, 071403.

Sarkisyan KS, et al. KillerOrange, a Genetically Encoded Photosensitizer Activated by Blue and Green Light. PLoS One. 2015, 10, e0145287.

2002—2006. Создана панель фотоактивируемых флуоресцентных белков с различным типом свето-индуцируемых спектральных переходов: нефлуоресцентный→красный (KFP1), голубой→зеленый (PS-CFP) и зеленый→красный (Dendra). Продемонстрирована применимость KFP1, PS-CFP и Dendra для прицельного фотомечения клеток, внутриклеточных органелл и белков и последующего слежение за их перемещениями, а также для мониторинга деградации целевых белков на уровне отдельных клеток в реальном времени с помощью флуоресцентной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

2005—2006. Создан первый генетически кодируемый фотосенсибилизатор — фототоксичный красный флуоресцентный белок, названный KillerRed, который может быть использован для прицельного свето-индуцированного уничтожения клеток и белков.

2005—2007. Методами направленной молекулярной эволюции получены улучшенные флуоресцентные белки, адаптированные к практическому применению. В частности, получены красные и дальне-красные белки, превосходящие по яркости все известные аналогичные флуоресцентные белки, разработанные в других лабораториях мира. Яркие дальне-красные флуоресцентные белки открывают новые перспективы флуоресцентного мечения лабораторных животных на уровне целых организмов.

2005—2008. Впервые осуществлен синтез «красных» хромофоров природных GFP-подобных белков — asFP595, Kaede и их аналоги. Данная работа позволила выявить закономерности влияния различных заместителей на спектральные свойства хромофоров, а также предложить перспективные направления мутагенеза флуоресцентных белков с целью получения вариантов с новыми спектральными характеристиками.

ФИОДолжностьКонтакты
Лукьянов Константин Анатольевич, Чл.-корр. РАН, проф.РАН, д.б.н.в.н.с.kluk@ibch.ru
Гурская Н.Г., к.б.н.с.н.с.
Плетнёва Н.В., к.х.н.с.н.с.
Гильванов Айдар Римовичм.н.с.
Колесов Данила Вадимовичм.н.с.
Ручкин Дмитрий Алексеевичм.н.с.
Ибрагимов А.Э.тех.-лаб.
Шеберстова Елена Сергеевнатех.-лаб.
Крамарев И.О.инженер
Полиновская В.С.инженер
Путляева Л.В.н.с.
Симонян Т.Р.инженер
Соколинская Елена Леонидовнаинженерelena.sokolinskaya@gmail.com
Степанов А.И.инженер
Шуваева А.А.инженер

Ранее здесь работали

Богданов Алексей Михайлович, к.б.н.
Мишин Александр Сергеевич, к.б.н.
Саркисян Карен Сергеевич
Кост Любовь Александровна
Мамонтова Анастасия Вячеславовна
Мусаткина Е.А., к.б.н.
Серебровская Екатерина Олеговна, к.б.н.
Горбачев Дмитрий Андреевич
Злобовская Ольга Анатольевна
Мышкина (Маркина) Надежда Михайловна
Поварова Наталья Владимировна
Рюмина А.П.
Божанова Н.Г.
Белоусова А.А.
Беседовская З.А.
Гавриков А.С.
Коробов А.Ю.
Куркина Е.В.
Пашковская Т.А.
Таран Ю.А.
Шагин Д.А., к.б.н.
Гладкова Л.Н.
Горшкова А.А.
Горшкова А.А.
Евтушенко Н.А.
Мошарева М.А.
Юнусова В.А.
Загрузка...
Загрузка...

Лукьянов Константин Анатольевич

Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте

Загрузка...