«Разработка и промышленное освоение биокаталитической технологии производства L-аспарагиновой кислоты и инновационных лекарственных препаратов на основе её солей»

Федеральное государственное унитарное предприятие 
Государственный научно-исследовательский институт 
генетики и селекции промышленных микроорганизмов
(ФГУП ГосНИИгенетика)

Дебабов В. Г., Яненко А. С., Воронин С. П.,
Синолицкий М. К., Кыгина О. Ю., Полунина Е. Е., Иежица И. Н.,
Петров В. И., Спасов А. А., Черницов А. И.

Магний и калий являются важнейшими элементами, универсальными регуляторами физиологических и биохимических процессов у человека. Дефицит в организме этих элементов возникает при сердечно-сосудистых заболеваниях, сахарном диабете II типа, тяжелых формах диареи и рвоты, что обуславливает широкое применение в медицине препаратов магния и калия. В большинстве случаев эти дефициты возникают одновременно.
Единственный отечественный препарат – сульфат магния не отвечает современным требованиям вследствие низкой биодоступности магния и многочисленных побочных эффектов. Потребности здравоохранения в Российской Федерации в препаратах калия и магния удовлетворяются, в основном, за счет импорта калиево-магниевых солей аспарагиновой кислоты (препараты - панангин, АКМ; «аспаркам» паматон  и др.). Особенностью всех вышеперечисленных препаратов является использование в качестве субстанции рацемической (DL) аспарагиновой кислоты, полученной химическим синтезом. Вместе с тем, известно, что в организме человека усваиваются и вовлекаются в биохимические процессы только L-изомеры аминокислот.
Авторами работы была выдвинута гипотеза и получены строгие доказательства, что оптическая изомерия аспарагинатов оказывает значительное  влияние на кинетику устранения дефицита K+ и Mg2+ в организме, что явилось основанием для создания новых препаратов калия и магния на основе L-аспарагиновой кислоты
В представленном реферате кратко суммируются результаты всех этапов создания лекарственных препаратов, включая результаты исследования биологической активности препаратов на основе L-аспарагиновой кислоты,  разработку биокаталитической технологии получения L-аспарагиновой кислоты, создание субстанции и готовых лекарственных средств на основе L- аспарагиновой кислоты, организацию и промышленное производство L-аспарагиновой кислоты и готовых лекарственных форм на ее основе.
 
1. Биологическая активность препаратов на основе L-аспарагиновой кислоты
	
	В Государственном общеобразовательном учреждении Высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО ВолГМУ) при оценке сравнительной биодоступности неорганических и органических солей магния, включая стереоизомеры аспарагиновой и глутаминовой кислот, было обнаружено, что  K,Mg L-аспарагинат приводит к более быстрой компенсации дефицита магния и калия в организме на моделях лекарственной интоксикации (дигоксиновой и фуросемидной) и восполнению магния в эритроцитах на модели алиментарной гипомагнезиемии по сравнению с DL- и D-стереоизомерами K,Mg аспарагината. Рассчитанные методом регрессионного анализа, сроки полной компенсации дефицита магния в плазме для группы Mg L-аспарагината, приходились на 7-е сутки введения препарата, для групп Mg D-аспарагината – на 10-е сутки, Mg DL-аспарагината – на 11-е сутки, Mg L-, DL-глутамата – на 13-е сутки. 
Исследование противоаритмической активности стереоизомеров калий, магний аспарагинатов при внутривенном введении показало, что K,Mg L-аспарагинат более эффективен, поскольку достоверно удлиняет время до начала развития нарушений ритма, уменьшает частоту возникновения фибрилляций и увеличивает продолжительность жизни животных, по сравнению с DL- и D-стереоизомерами K,Mg аспарагината.
K,Mg L-аспарагинат оказывал более выраженный эффект при изучении влияния препаратов на длительность биоэлектрической активности сердца мышей, вызванной асфиксией, поскольку достоверно увеличивал продолжительность жизни животных по сравнению с DL- и D-стереоизомерами.
Таким образом, на основании комплексного изучения биодоступности и антиаритмической активности K,Mg L-аспарагината в сравнении с его D- и DL-изомерами на различных экспериментальных моделях, авторы настоящего исследования пришли к однозначному заключению, что комплексы калия и магния с L-стереоизомером аспарагиновой кислоты обладают более высокой биодоступностью, чем комплексы с D-стереоизомерами. Использование в качестве хелатирующего агента L-аспарагиновой кислоты, а не ее рацемата, способствует лучшему проникновению ионов калия и магния во внутриклеточное пространство и, как следствие, более эффективному устранению внутриклеточного дефицита этих катионов и, связанных с ним, нарушений сердечного ритма.
Полученные результаты по биологической активности солей калия и магния на основе L-стериоизомера  аспарагиновой кислоты явилось основанием для создания новых более эффективных препаратов для устранения дефицита  калия и магния при сердечно-сосудистых заболеваниях.

2. Разработка биокаталитической технологии получения L- аспарагиновой кислоты 

Традиционный химических синтез аспарагиновой кислоты из малеиновой кислоты и аммиака  приводит к получению рацемическая смесь D- и L– энантиомеров аспарагиновой кислоты. 
Альтернативным способом, позволяющим получать оптически чистую L-аспарагиновую кислоту, является биокаталитический синтез, в котором в качестве катализатора используется фермент аспартат-аммиак-лиаза (или аспартаза), катализирующий присоединение аммония к фумарату, согласно схеме:

-ООС-СН=СН-СОО-   +   NH4 +    =>      -ООС-СН(NH3+)-СН2-СОО-
Фумарат              Аммоний                  L-аспарагинат

Важным преимуществом этого процесса являются мягкие условия синтеза (водная среда, температура 30-370С, нормальное давление), высокая конверсия, не менее  96% и строгая стереоспецифичность. 
	В результате направленного изменения метаболизма клеток и оптимизации состава среды для культивирования в Федеральном государственном унитарном предприятии Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетика) создан новый высокоактивный штамм E.coli ВКПМ В-7188, продуцент аспартазы (с активностью свыше 10 000 ЕД/мл) и разработаны условия получения биомассы этого штамма в больших количествах. Этот уровень активности соответствует лучшим мировым достижениям.
Синтез L-аспарагиновой кислоты осуществляется в системе реакторов колонного типа, заполненных биокатализатором в виде иммобилизованных клеток, который изготовляется Закрытом Акционерном Обществе «Биоамид» (ЗАО «Биоамид»). Биокатализатор имеет высокую операционную стабильностью (не менее 120 суток при 300С), обеспечивает конверсию не менее 98% и получение растворов, содержащих 170-175 г/л L-аспарагиновой кислоты. 
Технические решения, касающиеся штамма-продуцента аспартазы и способа получения L-аспарагиновой кислоты  были защищены патентом РФ № 2174558.

3. Разработка субстанции и готовых лекарственных средств на основе L- аспарагиновой кислоты.

	На основе L-аспарагиновой кислоты, получаемой с помощью биокаталитической трансформации, создана субстанция, в полной мере соответствующая международным требованиям качества и безопасности.
На основе субстанции «L-аспарагиновая кислота» были разработаны две готовые формы лекарственных средств: Аспаркам-L - раствор для внутривенного введения и Аспаркам-L -раствор для инфузий. Эти препараты представляют собой стерильные растворы L-аспарагината калия и магния. Общая схема получения препаратов включает стадии последовательного взаимодействия окиси магния и аспарагиновой кислоты, а затем гидроокиси калия в воде для инъекций при нагревании до полного растворения всех компонентов. В растворы вводиться также осморегулятор – сорбит. После стерилизующей фильтрации и стерилизации растворы разливают в ампулы (для внутривенного введения) или флаконы (раствор для инфузий). Способ получения лекарственного средства Аспаркам-L и способы применения его в медицинской практики защищены патентом РФ №2229879.
Доклинические исследования и клинические испытания  позволили сделать следующие выводы:
1.	Аспаркам-L, при применении у пациентов с инфарктом миокарда (в составе комплексной терапии) способствует восстановлению и/или поддержанию нормального уровня К+ в сыворотке крови и Mg++ в сыворотке крови и эритроцитах (тканях). 
2.	Аспаркам-L при применении у пациентов с инфарктом миокарда (в составе комплексной терапии) улучшает клинический статус пациентов и переносимость физических нагрузок, значимо снижает частоту и тяжесть ангинозных приступов, способствует снижению  кратности аритмий.
3.	Аспаркам-L при применении у пациентов с инфарктом миокарда (в составе комплексной терапии) способствует улучшению Качества жизни пациентов.
4.	Аспаркам-L, при курсовом лечении в рекомендуемой дозировке, является безопасным препаратом с хорошей переносимостью.
5.	Аспаркам-L, производства ЗАО «Биоамид» (Россия) может быть рекомендован для применения в рекомендуемой дозировке у пациентов с ИБС и инфарктом миокарда.
6.	При комплексной сравнительной оценке эффективность и безопасность Аспаркама-L сопоставима с Панангином, а по динамике улучшения клинического статуса и профилактике развития рецидива острого инфаркта превосходит препарат сравнения.

4. Промышленное производство и реализация L-аспарагиновой кислоты и готовых лекарственных форм на ее основе.

Промышленное производство субстанции L-аспарагиновой кислоты и лекарственных форм – Аспаркам-L (раствор для инфузий и раствор для инъекций) организовано на предприятии Открытого Акционерного Общества «Биосинтез» ОАО «Биосинтез»   (г.  Пенза) и осуществляется, начиная с 2008 г.
С использованием описанной выше технологии, за период с февраля 2008 г. по февраль 2010 г. было наработано:
Аспаркам-L для инфузий - 17,448 тыс. бутылок по 200 мл и 18,024 тыс. бутылок по 400 мл.
Аспаркам-L для внутривенного введения -  133,2 тыс. упаковок по 5 мл №10 и 172,52 тыс. упаковок по 10 мл №10. 
Созданные мощности позволяют полностью удовлетворить потребности РФ в калий-магниевых препаратах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате комплексных междисциплинарных исследований и усилий генетиков, биотехнологов, медиков и производственников создано новое лекарственное средство «Аспаркам-L» на основе L-аспарагиновой кислоты, разработана технология его производства  и организован промышленный выпуск.  В  отличие от всех известных аналогов (Панангин, Аспаркам и др.), содержащих рацемическую смесь аспарагиновой кислоты, новые препараты Аспаркам-L содержат только один стериоизомер L-аспарагиновой кислоты, что обеспечило более высокую эффективность новых препаратов при устранении внутриклеточного дефицита ионов калия и магния и лечении, связанных с ним нарушений сердечного ритма.
Таким образом, создание и освоение производства готового средства Аспаркам- L - это не просто импортозамещение важного класса лекарств, но и инновационная разработка, значительно улучшавшая свойства калий, магниевых препаратов на базе использования оптически активной природной L-аспарагиновой кислоты.

АВТОРЫ РАБОТЫ

                                                     Дебабов В.Г.

                                                     Яненко А.С.

                                                      Воронин С.П. 

                                                      Синолицкий М.К. 

                                                      Клыгина О.Ю.

                                                      Полунина Е.Е. 

                                                      Иежица И.Н. 

                                                      Петров В.И.

                                                      Спасов А.А.

                                                      Черницов А.И.