Раннее выявление маркеров различных заболеваний человека способно повысить качество их диагностики, а также позволить вовремя назначить адекватное лечение. Решение данной проблемы требует разработки методов, позволяющих специфично выявлять антигены и антитела, находящиеся в тканях и жидкостях организма в сверхмалых количествах. Использование стандартных методов анализа не позволяет диагностировать заболевание на ранней стадии и определить его характер. Создание новых высокочувствительных методов определения в тканях организма антигенов и антител, ассоциированных с различными заболеваниями, является актуальной задачей медицины и молекулярной биологии. Проект планируется осуществить на двух модельных системах: детекции анти-гликановых антител, ассоциированных с развитием опухолей (в частности анти-LeC IgM антител) и детекции IgG4, IgE, IgA1 и IgA2 антител человека в жидкостях организма при аллергии на клещей домашней пыли, грибы Alternaria alternata и Aspergillus fumigatus. Подходы на основе метода иммуно-ПЦР (иПЦР), разработанные в ходе выполнения работ по проекту, можно будет применять для детекции и идентификации биологически важных молекул, которые присутствуют в тканях организма в предельно низких концентрациях. Аллергическими заболеваниями первого типа (IgE-зависимыми) страдает до 30% населения развитых стран: у 10% детей формируется аллергическая астма, что значительно ухудшает качество жизни не только детей, но и их семей. Дети с аллергическими заболеваниями чаще болеют, хуже учатся, не могут заниматься спортом. Аллергия имеет тенденцию к прогрессированию (атопический марш) в тяжелые формы (астма, атопический дерматит). Диагностика аллергии затруднена из-за низкой аффинности IgE антител. В России нет отечественных диагностикумов для определения аллерген-специфичных IgE в сыворотке крови. При этом единственным патогенетическим методом лечения аллергии является специфическая иммунотерапия, в основе которой лежит введение в кровь пациента низких доз целевого аллергена. Выявление целевого аллергена является определяющим для эффективности терапии. Ранняя диагностика и ранняя профилактика позволят остановить прогрессирование аллергического заболевания в тяжелые формы, такие как астма и атопический дерматит. Процессы изменения гликозилирования белков при патологии, появление углеводных структур, выступающих в качестве онкомаркеров, с одной стороны, и изменение спектра антител с другой, связаны между собой. Исследование этих процессов и их возможных корреляций между собой требует развития новых подходов диагностики, обладающих высокой чувствительностью и позволяющих проводить количественное определение уровня целевых молекул. Антитела к дисахариду Lec (Lewis C, Galβ1—3GlcNAc) входят в состав репертуара естественных анти-гликановых антител человека. Их относят к консервативным антителам, которые встречаются практически у всех здоровых людей и незначительно варьируют по эпитопной специфичности и авидности. В качестве естественных антител они неспособны взаимодействовать с нормальными углеводными структурами, содержащими Lec. Однако, при патологии, например, в процессе малигнизации клеток, часто происходит нарушение гликозилирования и “проявление” ранее скрытых эпитопов. Так, характерной чертой рака молочной железы (РМЖ) является повышенная экспрессия аномально гликозилированного муцина MUC1. Показано, что моноклональные антитела способны узнавать Lec в составе опухолевого гликопротеина, а фракции анти-Lec антител, выделенные из крови пациентов с диагнозом РМЖ, узнают опухолевые клетки. Также показано снижение титра анти-Lec IgM антител при развитии опухоли (Тупицын и др., 2009). При этом чувствительности классического ИФА недостаточно для количественного определения уровня антигликановых антител (Huflejt et al., 2009). В рамках настоящего проекта предполагается разработка инновационных методов, способных обеспечить новые пределы детекции антигенов и антител (превышение чувствительности по сравнению с ИФА более чем в 100 раз). Метод иПЦР по своей сути аналогичен иммуноферментному анализу (ИФА), и включает те же основные этапы, однако отличается от ИФА типом детектируемой метки, которой в данном случае является последовательность ДНК. Детекция сигнала производится с помощью метода количественной ПЦР (кПЦР, также ПЦР «в реальном времени») с праймерами, специфичными к маркерной последовательности. кПЦР характеризуется сверхвысокой чувствительностью (предел обнаружения около 10 молекул в реакционной пробирке), что делает его комбинацию с ИФА перспективной в качестве основы для создания эффективных тест-систем для обнаружения биологически важных молекул. Специфичность и чувствительность метода иПЦР в целом определяется, прежде всего, аффинностью используемых антител. Предел обнаружения может достигать десятков фг/мл антигена. В работе планируется адаптация метода иПЦР для детекции биомаркеров в двух модельных системах, представляющих важное медицинское и общебиологическое значение (аллергии и опухолевой трансформации клеток). Для повышения качества диагностики этих заболеваний необходимо серьёзное увеличение чувствительности и воспроизводимости существующих методов Оптимизация метода иПЦР будет включать в себя несколько этапов. Прежде всего, будет выбран способ конъюгирования ДНК и антитела. В первую очередь планируется опробовать уже хорошо зарекомендовавший себя универсальный метод, основанный на использовании супрамолекулярных комплексов, образованных фрагментами ДНК, биотинилированными с 5'- и 3'-концов, стрептавидином, и биотинилированными антителами. Также планируется синтезировать ковалентные конъюгаты ДНК-антитело и сравнить их эффективность с супрамолекулярными комплексами. Кроме того, будет проведена оптимизация метода иПЦР с точки зрения уровня положительного сигнала и его превышения над фоновым уровнем. Поскольку уровень фона определяется, главным образом, неспецифической сорбцией реагента, содержащего ДНК-метку, процесс оптимизации метода должен быть направлен, прежде всего, на снижение уровня неспецифичной сорбции антител, и ДНК-метки. Для этого необходимо оптимизировать условия иммунохимической реакции (протестировать и отобрать реагенты для блокировки вакантных сайтов сорбции, подобрать концентрации антител и условия инкубации), подобрать концентрации конъюгата ДНК-антитело, условия промывок, и условия проведения количественной ПЦР. В рутинной работе для детекции сигнала (или анализа результатов реакции?) наиболее целесообразно использовать кПЦР, так как только этот подход позволяет проводить количественную оценку содержания ДНК в пробе и упрощает проведение анализа. Таким образом, конечной стадией проведения анализа является кПЦР с использованием флуоресцентно-меченных зондов. Мы планируем изучить флуорогенные свойства ДНК-зондов с комбинированной системой красителей – с двумя флуорофорами и/или двумя тушителями. Планируется совершенствование дизайна гидролизуемых зондов (TaqMan) и молекулярных маячков (Molecular Beacon) с использованием новых реагентов для модификации олигонуклеотидов. На основе полученных результатов будут разработаны основанные на иПЦР диагностикумы для определения в сыворотке крови антител к гликану LeC и антител к основным аллергенам, позволяющие повысить эффективность диагностики и специфической терапии аллергии и РМЖ. Фундаментальными аспектами представленного проекта являются исследования по выявлению корреляции между уровнем антител к LeC и подверженностью человека РМЖ и определение роли IgA2 субкласса антител, ассоциированных с формированием IgE антител, в крови, слюне и слезной жидкости. Предположительно, это позволит разработать неинвазивный метод диагностики аллергии, что особенно важно для постановки диагноза у детей, чаще всего страдающих аллергическими заболеваниями, а также онкологических заболеваний. Таким образом, подход на основе иПЦР, эффективность которого будет продемонстрирована на заявленных в проекте модельных системах, может в дальнейшем применяться для обнаружения различных молекул-биомаркеров. Использование предложенного метода позволит как усовершенствовать раннюю диагностику заболеваний, и, как следствие, дать возможность назначать своевременное эффективное лечение, так и помочь в изучении процессов, регулируемых молекулами, встречающимися в биологических системах в предельно низких концентрациях.