Пресс-центр / новости / Наука /

Информация о ходе выполнения научных работ по Соглашению №14-50-00131 с РНФ

Информация о ходе выполнения научных работ по Соглашению №14-50-00131 с Российским научным фондом по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Реализация комплексных научных программ, предусматривающих развитие научных организаций и образовательных организаций высшего образования в целях укрепления кадрового потенциала науки, проведения научных исследований и разработок мирового уровня, создания наукоемкой продукции» Тема проекта: «Белки и пептиды в постгеномную эру. Структурно- функциональные исследования для решения фундаментальных задач и направленного конструирования инновационных лекарственных средств»

14-50-00131, отчёт, РНФ

Гончарук Сергей

За отчетный период 2017 года в рамках выполнения соглашения были проведены нижеследующие следующие работы.

По направлению «Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции»

На основе данных гетероядерной ЯМР-спектроскопии и молекулярного моделирования конформационных перестроек и межмолекулярных взаимодействий описаны молекулярные механизмы активации рецепторов эпидермальных факторов роста (EGFR) и рецепторов факторов роста фибробластов (FGFR3) из организма человека с учетом роли липидного окружения, как одного из главных компонентов самосогласованной сигнальной системы. В рамках разработанного липид-опосредованного механизма передачи сигнала через мембрану клетки предложены альтернативные последовательности структурных перестановок, наблюдаемых при активации рецептора FGFR3 при связывании кислого fgf1 и основного fgf2 лигандов с существенно различными электрическими зарядами. 

Продолжены работы по изучению структуры и механизма активации рецепторной тирозинкиназы ИРР, являющейся клеточным рН-сенсором при помощи криоэлектронной микроскопии и малоуглового рентгеновского рассеяния. Определены изменения конформации эктодомена ИРР при повышении рН среды. Параллельно разрабатывалась методика экспрессии и выделения полноразмерного таггированного рецептора ИРР для следующего этапа анализа механизма рН-зависимой активации данной тирозинкиназы в нанодисках.

В ходе работы по проекту различными методами подтверждено взаимодействие белка Noggin4 с секретируемым белком - Wnt11. Показано, что данное взаимодействие необходимо для регенерации  у модельного объекта - шпорцевой лягушки.  Методом ЯМР проведено исследование структуры рецептора Tfp4. С использованием данных транскриптомного секвенирования изучены сигнальные каскады, регулируемые белком Ag1 и его роль в раннем развитии мозга и при регенерации. Аналогично, сравнительный анализ масштабного секвенирования транскриптомов почек мышей дикого типа и нокаутных по гену ИРР был использован для выявления учaстников сигнальных путей данной рецепторной тирозинкиназы. Также изучены сигнальные каскады эндогенного рецептора ИРР в клетках инсулиномы, способных секретировать инсулин.

Подобран оптимальный флуоресцентный рН-чувствительный белок для экспериментов in vivo. Получена конструкция и начаты эксперименты по получению трансгенных животных, экспрессирующих данный рН-сенсор на поверхности клеток.

По направлению «Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы»

Рак часто рассматривают как проблему биологии развития. Эмбриональное развитие человека - это строго регулируемый процесс образования упорядоченных структур – тканей и органов. А рак, напротив, - это процесс дерегуляции, ведущий к разрушению этих структур.

Нашей лабораторией и другими авторами неоднократно отмечалось, что при развитии раковой опухоли наблюдается реактивация некоторых эмбриональных генов, и наоборот, ряд генов, характерных для взрослого организма, теряют свою активность. Мы выдвинули гипотезу, что ключевые для эмбрионального развития того или иного органа гены, так называемые мастер гены, являются также ключевыми для возникновения и развития раковой опухоли этого органа и последующего возникновения метастазов в других органах». Исследование таких мастер генов, их подавление или активация, могло бы открыть возможность возвращения раковых клеток к нормальному исходному состоянию, или найти связанные с ними другие гены, которые можно использовать как мишени терапевтического воздействия.

Наши исследования посвящены молекулярно-генетическим особенностям аденокарциномы поджелудочной железы (АПЖ), одной из самых трудно поддающихся лечению опухолей человека. В структуре смертности от онкологических заболеваний АПЖ занимает четвертое место и существует острая потребность в новых подходах к ее терапии. Однако поджелудочная железа очень сложна по своему строению и, хотя ее изучению и изучению ее патологий посвящены горы научной литературы, пока точно не известны мастер-регулирующие гены и белки, которые являются ключевыми для ее развития и для развития АПЖ и могли бы быть мишенью при терапии. Нашей задачей является выявление таких мастер-регуляторных генов, исследование этих генов в норме и их изменений в процессе канцерогенеза, а также исследование возможностей их использования в качестве мишеней для терапии АПЖ.

В прошлом году мы получили, на мой взгляд, значимый фундаментальный результат – мы идентифицировали группу мастер регуляторов развития поджелудочной железы, которые координированно выключаются в клетках АПЖ. В этом году эти исследования продолжались. Мы двигались по двум принципиальным направлениям. Во-первых, исследовали вопрос, что произойдет с клетками АПЖ, если в них ввести и заставить работать идентифицированные мастер гены, которые выключились при образовании опухоли, и наоборот, что будет, если подавить работу генов которые включились при ее образовании. Для этих целей мы создали специальные генетические конструкции, которые, при введении в раковую клетку выполняют вышеуказанные задачи, ввели их в раковые клетки и в настоящее время анализируем, как изменяются их различные свойства. При этом мы сделали важный принципиальный шаг. До недавних пор все усилия исследователей, стремящихся найти способы лечения рака, были направлены на собственно раковые клетки. Однако, в последние годы стало отчетливо ясно, что раковые клетки успешно развиваются только благодаря своему окружению, так называемой строме. При этом раковые клетки очень пластичны и могут превращаться в компоненты стромы, подвергаясь так называемому эпителиально-мезенхимальномы переходу. Думают, что этот переход важен для способности метастазировать - рассеивать опухоль по организму. В этом переходе также участвуют мастер гены. Мы в нашей работе исследуем способы воздействия на мастер гены, работающие как в раковых, так и в стромальных клетках. Сегодня мы еще далеки от окончательных заключений, но уже ясно, что подавление или, наоборот, активация определенных мастер генов и в раковых клетках и в строме существенно меняет работу целого ряда других генов, каким-то образом влияя на их регуляцию. Мы даже попробовали посмотреть, какие элементы генома ответственны за это изменение и выявили ряд таких регуляторов – энхансеров и промоторов.

Полученные результаты создают базу для обоснованного перехода на другой более высокий уровень исследований. Если до этого вся работа выполнялась на клетках, то далее она будет развиваться на модельных организмах - мышах. При этом будут анализироваться те гены, которые мы идентифицировали на уровне клеток.

По направлению «Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета»

Исследованы цитотоксические свойства аналогов пептида мечехвоста Tachypleus tridentatus, обладающих высокой селективностью антибактериального действия в отношении нормальных клеток человека – астроцитов и фибробластов. Показано, что аналоги TachY8S и TachI11S обладают сравнительно невысокой цитотоксичностью при концентрациях вплоть до 50 мкМ, что позволяет рассматривать их как перспективные соединения для разработки антибиотиков с широким спектром действия.

Исследована способность ряда антимикробных пептидов, относящихся к различным структурным классам (ареницина-2, апидецина 1b, TachI, PRP7(1-22), PRP7(1-16), ChBac3.4, тритрптицина), к ингибированию процесса бактериальной трансляции. Показано отсутствие данного типа активности у ареницина-2, TachI и тритрптицина. Пептид PRP7(1-22), продемонстрировавший высокую эффективность ингибирования рибосомального биосинтеза белка, был подвергнут сканированию аланином, что позволило выявить ключевые аминокислотные остатки, необходимые для осуществления биологической функции пептида.

Получены лабораторные образцы липид-транспортирующих белков гороха посевного Pisum sativum Ps-LTP1, меченного стабильными изотопами 13C, 15N, и амброзии полынолистной Ambrosia artemisiifolia Amb a 6. Для этого были выбраны родительские штаммы E. coli и получены штаммы-продуценты. Проведена оптимизация условий для экспрессии гибридных белков в клетках E. coli. Целевые рекомбинантные 13C,15N-Ps-LTP1 и Amb a 6 были получены с использованием аффинной хроматографии, реакции расщепления гибридных белков бромцианом и ОФ-ВЭЖХ. Полученные 13C,15N-Ps-LTP1 и Amb a 6 были охарактеризованы методами SDS-электрофореза в ПААГ, времяпролётной масс-спектрометрии МАЛДИ, КД-спектроскопии и автоматического N-концевого микросеквенирования по методу Эдмана. Степень включения изотопных меток 13C и 15N в структуру молекулы Ps-LTP1 гороха была установлена методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии.

Проведен пептидомный анализ сорного злака – ежовника обыкновенного Echinochloa crusgalli L. Идентифицированы новые молекулы, гомологичные антимикробным пептидам альфа-харпининам с уникальным 4-цистеиновым мотивом, установлены их молекулярные массы и частичные аминокислотные последовательности. Оптимизирована и упрощена методика выделения и очистки комплекса защитных полипептидов из семян ежовника, включающая в себя две основных стадии фракционирования методами жидкостной хроматографии высокого и среднего давления. Получены количественные данные об усилении антимикробной активности при действии комплекса альфа-харпининов семян ежовника из группы EcAMP, что выражалось в подавлении роста мицелия грибов.

Кровь является соединительной тканью, состав которой изменяется в зависимости от процессов, происходящих в организме. Благодаря своему сравнительно небольшому размеру пептиды легче белков преодолевают клеточные мембраны и эпителиальные барьеры. Среди пептидов, обнаруживаемых в крови, есть как фрагменты секретируемых различными тканями белков, выполняющие свои функции в плазме, так и лиганды рецепторов: гормоны, цитокины и медиаторы клеточного ответа. В небольших количествах в крови могут присутствовать пептидные маркеры различных заболеваний (к примеру, онкомаркеры) и даже чужеродные пептиды, относящиеся к патогенным организмам и инфекционным агентам. Чтобы получить представление о составе пептидома крови в норме, мы провели LC-MS/MS анализ 20 образцов сыворотки и плазмы крови здоровых доноров на масс-спектрометре TripleTOF 5600+. Образцы были подготовлены по ранее разработанным нами протоколам десорбции пептидов с поверхности представленных белков плазмы крови с последующими стадиями хроматографической очистки.

Геномы содержат миллионы коротких (<100 кодонов) открытых рамок чтения (sORF), которые обычно отбрасываются при аннотации генов. Тем не менее, пептиды, кодируемые sORFS, могут играть важную биологическую роль, и их влияние на клеточные процессы недооценено. Функциональный анализ одного из таких пептидов, кодируемого длинной некодирующей РНК, показал, что он участвует в регуляции роста и дифференциации мха. Высокая эволюционная скорость и распространённость sORFs позволяют предположить, что они могут служить резервом потенциально активных пептидов и играть важную роль в эволюции генов. Помимо пептидов, кодируемых sORFs, растительная клетка содержит большое количество фрагментов белков, образующихся при протеолитической деградации, но до сих пор не известно, являются ли эти пептиды побочными продуктами деградации белка или важными биологически активными компонентами клетки. В нашем исследовании мы получили доказательства активной регуляции как внутриклеточными, так и внеклеточными пептидными пулами, влиянии на эти процессы фитогормонов и продемонстрировали биологическую активность ряда пептидов.

По направлению «Белок и гликан-опосредованные клеточные взаимодействия в динамических условиях»

Изучено взаимодействие антител (IgM) к антигену группы крови А, иммобилизованных на SPR-чипе, с А-эритроцитами (которые имеют в своем составе как гликолипиды, так и гликопротеины с А-антигенностью), а также «упрощенными» эритроцитами, содержащими только один из этих компонентов. Первые получали путем встраивания гликолипида GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAc-spacer-DOPE в эритроциты группы крови О, а вторые – путем ковалентного присоединения тетрасахарида к периферическим белкам гликокаликса. Такой подход позволил изучить не только кинетику взаимодействия эритроцитов с поверхностью в динамических условиях, но и перенос гликолипидов с клетки на поверхность.

Проведено молекулярно-динамическое симулирование природного гликолипида Gb3 и его синтетического аналога Pk-DOPE в составе плоского мембранного бислоя и в мицелле, априори имеющей высокую кривизну. Предполагалось, что благодаря кривизне, в мицелле будет более доступным для узнавания естественными анти-Pk антителами внутренняя часть трисахарида, которая принципиальна для узнавания антигена этими антителами (они узнают синтетический аналог, но не взаимодействуют с природным гликолипиом). Эксперимент показал, что внутренний остаток Glcβ в мицеллярных кластерах действительно становится более доступным для растворителя, и, соответственно для взаимодействия с антителами.

Синтезированы удобные для иммобилизации на SPR-чипе сиалоолигосахариды: Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc (рецептор для человеческих вирусов) и Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc (рецептор для птичьих вирусов), последний в качестве отрицательного контроля для экспериментов с человеческими вирусами гриппа. Их взаимодействие с сиалорецептором на чипе происходит независимо от скорости потока, более того, оно оказывается необратимым – вирус не удается элюировать с чипа даже в жестких условиях; причина необратимости будет выясняться. Моделирование углевод-белкового взаимодействия в гликокаликсе клетки проводилось таким образом: в мембрану эритроцитов встраивались синтетические гликолипиды, имеющие в качестве полярной «головы» тетрасахарид GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAc, всего пять вариантов, отличающиеся расстоянием между липидом и гликаном, а также архитектурой гликолипида. Взаимодействие с антителами против данного гликана выявили следующую закономерность: только те варианты, которые не заглублены в гликокаликс, способны связывать антитела (IgG) к гликану, независимо от скорости потока жидкости, в которой находятся антитела, и от времени инкубации.

Проводилось измерение кинетики переноса гликолипида в следующих трёх системах: клетка HUVEC → бактерия; бактерия → клетка HUVEC; бактерия → бактерия. Первый процесс является очень медленным и малоэффективным. Перенос с бактерии на бактерию является самым быстрым. Перенос с клетки млекопитающих на бактерию идет медленнее - заметно проходит уже за минуты, а на максимум выходит за десятки минут. Мы объясняем однонаправленность переноса в системе клетка-бактерия наличием у клетки HUVEC мощного гликокаликса, который «выпускает» наружу гликолипиды в виде отдельных молекул или небольших везикул, но не «впускает» внешние липиды внутрь. В дальнейшем предполагается повторить эксперименты на эритроцитах, у которых толщина гликокаликса на порядок ниже, чем у HUVEC, изучить зависимость процесса переноса от скорости потока одного объекта относительно другого.

Синтетический липид biot-CMG2-DOPE был изучен методами AFM, TEM, динамического светорассеяния и малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) в сочетании с молекулярно-динамической симуляцией. Оказалось, что на ровной поверхности он формирует монослой, где почти все молекулы имеют одну и ту же стабильную конформацию, в которой полярный фрагмент CMG2 сложен пополам в своей шарнирной средней части, а остаток биотина утоплен в неполярном монослое DOPE. Несмотря на маскированность биотина, монослой без каких-либо затруднений взаимодействовал со стрептавидином. Молекулярно-динамическая симуляция показала, что события «выхода» остатков биотина на поверхность монослоя имеют низкую, но конечную вероятность. Таким образом, процесс взаимодействия монослоя со стрептавидином является белок-индуцированным. По-видимому, аналогичные явления происходят и в природе на клеточной мембране; изученный нами монослой является удобной экспериментальной системой для их моделирования.

Разрабатывался микрочипный вариант иммуно-ПЦР на основе 3D-технологии ИМБ РАН, с тем расчетом, чтобы можно было отделять от стеклянной основы гелевые микроэлементы и каждый из них подвергать обычной процедуре иммуно-ПЦР в пробирке. При такой постановке чувствительность метода не превышала чувствительности флуоресцентного метода детекции тех же антител без стадии ПЦР (а методически была значительно сложнее). В 2018 г. будет апробирован вариант, основанный на 2D-чипе в сочетании с иной ПЦР-технологией.

По направлению «Белки биокаталитических систем»

Биолюминесценция, или способность тысячи видов морских и наземных живых организмов излучать видимый свет, - одно из самых удивительных явлений природы. В рамках выполнения проекта были установлены структуры люциферинов еще двух совершенно новых биолюминесцентных систем – почвенного червя Fridericia heliota и высших грибов. Плюс, развивая данный проект, был установлен точный химический механизм биолюминесценции Fridericia heliota, который, как это ни удивительно, очень схож с механизмом функционирования обычного светлячка. Работы по программе гранта позволили определить структуры ряда природных аналогов люциферина, выделенных из червей, – это приоткрыло завесу на пути к изучению биосинтеза молекулы. Люциферин Fridericia уникален – он нетоксичен, прост в получении, и при этом в отличие от всех остальных люциферинов исключительно стабилен – месяцами может храниться в сухом виде и в растворе.

Одной из главных задач проекта мы считаем создание новых катализаторов на основе существующих ферментов. Таким ферментом, например, является бутирилхолинэстераза. Биологические антидоты на ее основе способны нейтрализовать широкий спектр фосфорорганических токсинов (ФОТ). В рамках проекта РНФ удалось создать новый каталитический антидот. В рамках выполнения этапа была создана оптимизированная библиотека генов, содержащая до 1 миллиона различных вариантов фермента. Далее, применяя оригинальную, не имеющую аналогов в мире, технологию поиска биокаталитической активности мы провели отбор только тех вариантов фермента, которые были устойчивы к ингибированию флуоресцентными аналогами пестицида параоксон и боевого отравляющего вещества зомана. Были выбраны варианты фермента, обладающие устойчивостью к ингибированию соответствующими ФОТ, два из них гидролизовали пестицид параоксон. Таким образом, был сделан шаг к созданию эффективных каталитических антидотов на основе БуХЭ против отравлений ФОТ.

В направлении поиска новых ферментов-протеаз терапевтического и биотехнологического назначения был разработан новый метод позитивной селекции протеолитической активности ферментов на поверхности дрожжевых клеток. Метод успешно квалицирован на примере биотехнологического фермента – энтерокиназа. Изучены иммуногенность и протективность двух рекомбинантных белков, фрагментов IgA1 протеазы N. meningitidis, способных обеспечить защиту животных при заражении менингококками серогрупп А, В и С. В опытах по пассивной защите мышей с использованием сыворотки животных, иммунизированных этими белками, и с помощью адаптивного переноса лимфоцитов этих мышей интактным мышам-реципиентам показана важная роль клеточного и гуморального факторов в формировании иммунитета к менингококку серогруппы В.

Продолжены работы по исследованию мультиферментного каскада превращения D-пентоз в пуриновые нуклеотиды в «одной колбе» с применением рибокиназы, фосфорибозилпирофосфатсинтетазы и аденинфосфорибозилтрансферазы. На основании сравнения со структурами гомологичных белков (APRT термофильного штамма Thermus thermophilus HB8 и Homo sapiens APRT) локализовано положение активного центра фермента и ряда функционально важных аминокислотных остатков. (25-40°С).

14 декабря 2017 года

Прикрепленные файлы:

otchet_RNF.doc
doc, 71 Кб