Пресс-центр / новости / Наука /
Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 14.607.21.0145 о предоставлении субсидии от 3 октября 2016 г. по теме «Создание универсальной микрофлюидной платформы для скрининга биоразнообразия микроорганизмов».
Промежуточный отчет по проекту Минобрнауки России по Соглашению № 14.607.21.0145 по теме «Создание универсальной микрофлюидной платформы для скрининга биоразнообразия микроорганизмов»
За отчетный период 2-го этапа в рамках выполнения соглашения были проведены следующие работы:
- разработана лабораторная методика скрининга антимикробной активности в каплях микрофлюидной двойной эмульсии;
- проведена оптимизация инкапсуляции бактериальных клеток в капли двойной эмульсии в модельной системе пары «таргет» - «модельный эффектор»;
- проведен пробный отбор, определены условия инкапсуляции, определены критерии отбора, получены количественные характеристики процесс;
- определен источник разнообразия микроорганизмов (микробиоты) и условия пробоподготовки клеток «реального эффектора»;
- проведена пробоподготовка клеток микробиоты. Проведен отбор из выбранного источника разнообразия микроорганизмов в системе пары «таргет» - «реальный эффектор». Проведен предварительный анализ отбора;
В результате выполнения работ второго этапа работ по Соглашению № 14.607.21.0145 о предоставлении субсидии получены нижеследующие основные результаты:
1) Разработана методика проведения ультравысокопроизводительного скрининга клеток «эффекторов» при использовании бактерий Staphylococcus aureus в качестве клеток «таргетов». В ходе исследований выбраны микрофлюидные чипы с размером сопла 20 мкм. Основными тапами методики являются: подготовка бактериальных клеток-эффекторов из образца микробиоты к компартментализации; подготовка бактериальных клеток-таргетов Staphylococcus aureus к компартментализации; микрофлюидная компартментализация и кокультивация клеток-таргетов и клеток-эффекторов в каплях; анализ двойной эмульсии, содержащей инкапсулированные клетки и процедура сортинга, с учетом выбранных гейтов. условия инкапсуляции. Для инкапсуляции клеток «таргетов» штаммов Staphylococcus aureus, модельного «эффектора» Streptomyces venezuelae и представителей микробиоты ротовой полости млекопитающих в качестве клеток «эффекторов» была выбрана среда YTP, имитирующая физиологические условия. Представлены условия проведения скрининга на приборе FACS Aria III и схема выбора гейтов для скрининга, подходящие для инкапсуляции как бактериальных клеток, так и лимфоцитов.
2) В результате оптимизации процедуры инкапсуляции бактериальных клеток в капли двойной эмульсии были определено, что для эффективной инкапсуляции необходимо проведение пробоподготовки клеток с учетом фильтрования образцов через клеточные сита с размером пор 40 мкм и фильтрацией через три, последовательно подключенных, колоночных фильтров с размером пор 20 мкм. Были подобраны параметры степени заполнения - λ и концентрации клеток эффекторов, установлено, что оптимальной концентрацией «таргетов» Staphylococcus aureus и модельных «эффекторов» Streptomyces venezuelae или Escherichia coli является 6×108 клеток/мл (λ = 5) и 1×107 клеток/мл (λ = 0.1), соответственно. Это позволило добиться того, что полученные в результате капли микрофлюидной W/O/W эмульсии несут избыток клеток «таргетов» по отношению к клеткам «эффекторам».
3) Проведен пробный отбор из модельной системы «таргет» - «эффектор» Staphylococcus aureus+Streptomyces venezuelae и пары «таргет» - «сожитель» Staphylococcus aureus+Escherichia coli, в результате которого было показано, что при селекции клеток «эффекторов» с использованием принципа, основанного на комбинации негативной и позитивной селекции в модельной системе «таргет» - «модельный эффектор», достигается высокая степень обогащения «эффекторов» как при высоком содержании бактерий «эффекторов» (9%), так и в случае более низкого содержания бактерий «эффекторов» (0.9%). Полученные значения степени обогащения клеток «эффекторов», равные 9 и 86, отличаются от теоретического предела в рамках погрешности измерения. Расчетная величина теоретического предела обогащения клеток «эффекторов» составляет при этом, соответственно, 10 и 100.
4) Был проанализирован спектр источников микробиоты и определено, что дикие животные вследствие значительного контакта с разнообразной микробиотой обладают высоким потенциалом в качестве источника природного разнообразия микробиоты. Поэтому видовой состав микробиоты диких животных имеет более широкий спектр ввиду отсутствия гигиены, санации ротовой полости, употребления антибиотиков и консервантов. Таким образом, представители всеядных, в том числе человек, представляют наибольший интерес. Был разработан и протестирован протокол пробоподготовки бактерий микробиоты ротовой полости и кишечной микрофлоры человека, который позволил сохранить более 90% живых клеток микробиоты (бактерий).
5) Для пробоподготовки клеток микробиоты была использована ротовая полость человека и дикого медведя. В результате проведения отбора клеток микробиоты ротовой полости человека было установлено, что представители родов Propionibacterium, Stenotrophomonas, Pseudomonas и Sphingomonas среди его микрофлоры представляют чрезвычайно высокий интерес, так как являются потенциальными продуцентами высокоактивных соединений (ингибиторов, «эффекторов») для патогенных бактерий Staphylococcus aureus. В случае использования в качестве источника природного разнообразия микробиоты ротовой полости дикого медведя наиболее яркими ингибирующими свойствами обладали бактерии рода Halomonas, Shewanella и Comamonadaceae, представители родов Enterobacteriaceae, Propionibacterium, Corynebacterium и Sphingomonas также проявляли ингибирующие свойства по отношению к патогенными бактериями Staphylococcus aureus.
6) выполнены дополнительные патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011- 96.
Все задачи второго этапа работ выполнены в установленные сроки в соответствии с планом-графиком исполнения обязательств и условиями технического задания Соглашения №14.607.21.0145 о предоставлении субсидии от 3 октября 2016 г.
9 января 2018 года