Пресс-центр / новости / Наука /

Информация о ходе выполнения научных работ по Соглашению №14-50-00131 с Российским научным фондом

За отчетный период 2018 года в рамках выполнения соглашения были проведены нижеследующие следующие работы.

По направлению «Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции»

Проведено изучение рецепторных белков как ключевых компонентов сенсорных систем организма и участников межклеточных сигнальных взаимодействий, их структурно-функциональных особенностей и способов регуляции. 

На основе разработанных в ходе выполнения проекта новых технологиях и полученных фундаментальных знаниях о взаимосвязи структуры, динамики и функции разработаны молекулярные модели функционирования рецепторных тирозинкиназ, в том числе членов семейств эпидермальных факторов роста, факторов роста фибробластов и гормона роста соматотропина при взаимодействии с лигандами и адапторными белками в сигнальных платформах.

Были получены и охарактеризованы моноклональные антитела к внеклеточной части рецепторной тирозинкиназы ИРР, сенсора слабощелочной среды и регулятора кислотно-щелочного равновесия. Данные антитела представляют собой хороший инструмент для дальнейших структурно-функциональных исследований рецептора, а также потенциально могут буть использованы для создания лекарств, регулирующих функции почек, желудка и поджелудочной железы. Проведен сравнительный анализ транскриптомов почек мышей дикого типа и нокаутных по ИРР в условиях до и после щелочной нагрузки. Одним из генов, функционально связанных с ИРР явлется kcnk5, кодирующий рН-зависимый калиевый канал TASK-2, который является одним из главных медиаторов респираторной хемочувствительности. 

Проанализированы сигнальные каскады, регулируемые белком Ag1 при регенерации и в раннем развитии мозга лягушки. В результате был определен спектр генов-мишеней регуляторного Ag1-зависимого сигнального каскада. Было установлено, что в ходе нейруляции в зачатке головного мозга ген Ag1 ингибирует экспрессию генов группы POU, участвующих в регуляции клеточного цикла. 

Изучено взаимодействие не известного ранее трансмембранного белка с-Answer, ген которого исчез в эволюции у теплокровных, в том числе у человека, с рецепторами FGFR4 и P2Y1. c-Answer усиливает действие FGFR4 на активацию сигнального пути, связанного с киназой Erk., а также усиливает активацию пуринэргического рецептора P2Y1.

Проведен анализ белок-белковых взаимодействий CLN3, изменения в первичной структуре которого приводят к развитию болезни Баттена и предложены способы лечения этой болезни. 

Показано, что пептидные фрагменты RAGE (рецептора участвующего в патогенезе болезни Альцгеймера) обладают нейропротекторными свойствами.

 

 

По направлению «Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы»

Самым опасным свойством рака ПЖ является раннее метастазирование, которое часто происходит до выявления первичной опухоли. Рак ПЖ не поддается новейшим методам иммунотерапии, удостоенным Нобелевской премии 2018 г. и успешно работающим в других видах рака. В процессе развития рака включение и выключение ключевых генов часто происходит в порядке обратном тому, что наблюдается при эмбриогенезе. Это явление называется рекапитуляцией. Мы пытались применить этот принцип к раку ПЖ.

Проведены исследования экспрессии генов в хирургических образцах рака ПЖ и фетального материала и открыли отсутствие рекапитуляции при раке ПЖ, за исключением нескольких генов. Это совпало с появившимися литературными данными, что ПАПЖ (протоковая аденома ПЖ) может представлять многочисленные болезни с одинаковым внешним видом. Мы обратили также внимание, что в большинстве хирургических образцов понижено содержание одного из ключевых факторов эмбрионального развития – мастер регулятора PDX1. Самые плохие прогнозы имеют пациенты с низким уровнем этого регулятора в опухоли. Предполагалось, что мастер ген PDX1 возможно на последних этапах развития ПАПЖ может быть ингибитором метастазирования. Для проверки такой возможности мы привлекли коллег из ИМГ РАН с моделью рыбой зебра. Небольшие размеры, короткий жизненный цикл и иммунная система эмбрионов Danio, толерантная к чужеродным антигенам, позволяет использовать для анализа клетки человека. Мы сконструировали клетки ПАПЖ, экспрессирующие PDX1, вводили их в эмбрионы Danio и с помощью флуоресцентной метки показали, что экспрессия PDX1 действительно ингибирует миграцию клеток по телу рыбки. Таким образом, открылось новое поле для борьбы с ПАПЖ, которое мы собираемся развивать уже после завершения проекта, но которое является его порождением. Другим результатом является разработка альтернативной концепции терапии рака, особенно такого, как ПАПЖ. В отличие от стандартных подходов, рассчитанных на уничтожение собственно раковых клеток, эта концепция указывает на предпочтительность использования в качестве терапевтических мишеней контакты раковых клеток и окружающей стромы.

Исследовались функциональные внутриклеточные взаимосвязи двух важнейших мастер генов - PDX1 и важного, гена SOX9. Для этой цели в случае SOX9, которого много в клетках ПАПЖ, мы применяли специфическое подавление транскрипции гена и затем анализировали реакции других генов на это снижение концентрации. В результате нам удалось добавить к известным участникам сети взаимодействий SOX9 еще несколько дополнительных. В случае PDX1, которого в клетках ПАПЖ мало, наоборот, мы вводили в эти клетки экспрессирующийся ген. При этом реагировали только уже известные своими взаимосвязями с PDX1 гены. Был завершен анализ экспрессии для пяти потенциальных мастер генов (PDX1, PTF1a, SOX9, HNF1-beta, GATA4), ключевых для эмбриогенеза поджелудочной железы и гена ZEB1, важного для процесса метастазирования. Наконец, проводили анализ эпигенетического состояния промоторов отобранных мастер генов, главным образом упомянутого SOX9, поскольку известна большая роль эпигенетических процессов в регуляции их экспрессии в опухолевых и эмбриональных тканях ПЖ. Наибольшие изменения наблюдались для промоторов генов ZEB1, MDC1, SOX9 и GATA4, что указывает на вовлеченность этих промоторов в функционирование генов.

 

По направлению «Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета»

Методом проточной цитофлуориметрии исследовано действие пептида мечехвоста Tach, а также его модифицированных аналогов TachY8S и TachI11S в отношении штаммов бактерий Escherichia coli ML-35p и Staphylococcus aureus 209P и линии клеток человека HEK293. Показано, что точечные замены гидрофобных остатков на остаток серина в структуре пептида позволяют свести к минимуму его цитотоксичность при сохранении мембранотропного механизма действия и высокой антибактериальной активности.

Проведены исследования антимикробного действия двух пептидов – катионного защитного АМП мечехвоста (Tach) и пролин-богатого пептида PRP7(1-22) – совместно с шестью различными конвенциальными антибиотиками, относящимися к различным структурным классам и обладающими разными механизмами действия. Синергический эффект наблюдался для пептида Tach при совместном действии с эритромицином или рифампицином в отношении культуры E. coli и ванкомицином в отношении культуры S. aureus. Пептид PRP7(1-22) проявил синергический эффект совместно с рифампицином или эритромицином при действии в отношении культуры E. coli, и совместно с ампициллином, полимиксином B, ванкомицином, эритромицином или рифамицином при действии в отношении культуры S.aureus. Наиболее ярко синергизм проявлялся в паре PRP7(1-22) / рифапмицин. При этом, в данном сочетании не наблюдалось усиление гемолитического эффекта.

Проведен биоинформационный анализ транскрибируемых генов, кодирующих гомологи металл-ассоциированных протеаз из класса фунгализинов, синтезируемых и секретируемых наиболее экономически значимыми для сельского хозяйства грибами рода Fusarium. Отобрана структура, полученная путем трансляции нуклеотидной последовательности в аминокислотную, из вида F. graminearum, наиболее гомологичная охарактеризованному ранее ферменту фунгализину из вида F. verticillioides. Разработан способ получения рекомбинантного аналога фермента путем гетерологической экспрессии в эукариотической системе, подтверждено наличие целевой вставки и траскрипционная активность. Разработаны и оптимизированы схемы для экспрессии двух структурных типов хитиназ культурных злаков в прокариотической системе. Подтверждено наличие внутриклеточного биосинтеза целевого белка путем определения уровня хитиназной активности спетрофотометрическим методом. Проведен скрининг пула защитных пептидов растений из семейства альфа-харпининов с целью выявления ингибиторов протеолитической активности. Установлено наличие свойств ингибиторов трипсиноподобных протеаз у двух новых молекул, выделенных из зерна культурного и дикорастущего злака.

Проведено сравнительное изучение роли различных растительных LTP в развитии аллергических реакций. Для этого на базе Центра молекулярной диагностики ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора были отобраны сыворотки пациентов из Московского региона с различными аллергическими реакциями на растительные пищевые продукты и пыльцу растений. Сыворотки были исследованы методом твердофазного иммуноферментного анализа с целью обнаружения в них специфических антител класса IgE к Pru p 3 персика – главному сенсибилизатору иммунной системы человека к аллергенам класса LTP. На основании содержания специфических антител IgE к Pru p 3 были отобраны 9 сывороток пациентов, сенсибилизованных к LTP. Количество иммуноглобулинов класса IgE в сыворотках пациентов из Московского региона с аллергией было определено с помощью набора Total IgE-HRP EIA (Dr. Fooke, Германия). Перекрёстная реактивность антител класса IgE в сыворотках пациентов с аллергическими реакциями на Pru p 3 персика и Len с 3 чечевицы, а также на Pis s 3 гороха (липид-транспортирующий белок гороха Pisum sativum – Ps-LTP1) была оценена с помощью метода иммуноферментного анализа. Методом иммуноблоттинга подтверждено присутствие специфических IgE к указанным аллергенам в сыворотках пациентов. Полученные данные свидетельствуют о клинически значимой роли аллергенов класса LTP в сенсибилизации пациентов из Московского региона.

Показана способность липид-транспортирующих белков из чечевицы (Lc-LTP2), укропа (Ag-LTP) и гороха (Ps-LTP1) переносить липиды in vitro. С помощью флуоресцентной спектроскопии детектировали перенос липидов между донорными липосомами из1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (РОРС), в состав которых были включены флуоресцентный зонд тетраметил-BODIPY-меченный фосфотидилхолин (TMB-PC) и гаситель флуоресценции (бис-циклогексил)-BODIPY-меченный фосфотидилхолин (BCHB-PC), и акцепторными липосомами из 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (DMPG) или 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DMPC). Показано, что анализируемые белки Lc-LTP2 из чечевицы, Ag-LTP из укропа и Ps-LTP1 из гороха способны переносить липидные молекулы между липосомами in vitro. Все три белка эффективнее переносят отрицательно заряженные DMPG по сравнению с DMPC. При этом эффективность переноса DMPG для Ps-LTP1 выше, чем для Lc-LTP2 и Ag-LTP. Вместе с тем, липид-транспортирующий белок из укропа Ag-LTP эффективнее других белков переносил DMPC.

Пептидный состав крови, являющейся соединительной тканью, постоянно изменяется в ходе процессов, происходящих в организме. Благодаря своему небольшому размеру пептиды легче белков преодолевают эпителиальные барьеры. Среди пептидов, обнаруживаемых в крови, есть как фрагменты белков, секретируемых различными тканями и выполняющие свои функции в плазме, так и лиганды рецепторов - гормоны, цитокины и медиаторы клеточного ответа. В крови можно обнаружить в небольших количествах пептидные маркеры различных заболеваний (к примеру, онкомаркеры), а также чужеродные пептиды, относящиеся к патогенным организмам. Чтобы получить представление о составе пептидома крови при раке, проведен LC-MS/MS анализ образцов плазмы и сыворотки крови 10 пациентов с колоректальным раком и 10 пациенток с раком яичников на масс-спектрометре TripleTOF 5600+. Образцы были подготовлены по ранее разработанным нами протоколам десорбции пептидов с поверхности основных белков плазмы крови с последующими стадиями хроматографической очистки. В результате сравнения представленности и вариабельности пептидов крови при раке и в норме обнаружено, что в образцах плазмы и сыворотки крови пациентов с колоректальным раком идентифицировано 536 уникальных пептидов, а в образцах от пациенток с раком яичников – 790 уникальных пептидов.

Проведено исследование изменения пулов эндогенных пептидов мха Physcomitrella patens в ответ на воздействие стрессовых факторов. Выявлен ряд потенциально биологически активных пептидов, и для отдельных из них активность доказана экспериментально. Показано, что эндогенные пептиды могут быть как эффекторами, так и модуляторами ответа мха P. patens на стресс.

Обнаружено, что стрессовые фитогормоны (метилжасмонат и салициловая кислота) индуцирую образование новых эндогенных пептидов как в клетке, так и в секретоме. Показано, что в этих же условиях происходит активация убиквитин-протеасомной системы деградации белков в клетке, что может являться одним из путей биосинтеза обнаруженных пептидов. Выявленные изменения в доле посттрансляционно модифицированных пептидов, в частности, снижение количества пептидов, гидроксилированных по аминокислотному остатку пролина, могут также влиять на биологическую активность пептидома.

 

По направлению «Белок и гликан-опосредованные клеточные взаимодействия в динамических условиях»

Предложен метод деликатного биотинилирования живых клеток с помощью встраивания в них молекул biot-CMG-DOPE, тот же реагент в течение секунд биотинилирует практически любую поверхность. Чтобы лучше контролировать процессы биотинилирования, мы детально изучили супрамолекулярную структуру biot-CMG-DOPE. В случае адсорбции на поверхности обнаружилось следующее: остаток биотина нормально спрятан в слое, однако выходит на его поверхность под действием Str. Монослой бып изучен с помощью АСМ, найденная толщина слоя 14 нм соответствует той МД модели, в которой биотин полностью утоплен. Результаты метода grazing incidence (разновидность рентгеновского малоуглового рассеяния ) не противоречили АСМ. МД симуляция показывает, что молекула biot-CMG-DOPE в слое принимает сложенную конформацию, и только ~1% этих молекул динамически принимает развернутую конформацию с дотупным остатком биотина.

Разработана методология изучения гликокаликса клетки с помощью набора синтетических гликолипидов, которые отличаются природой липидной части, природой гликанов (кроме гликанов, это могут быть пептиды, фрагменты ДНК и др.), а также спейсерной группой. Спейсер сконструирован из карбоксиметилглицина, обладающего вытянутой конформацией и тем самым обеспечивает необходимое расстояние между мембраной и гликаном. Кроме того, этот спейсер благодаря отрицательному заряду не взаимодействует с белками и клетками крови, что важно для исследований ин виво. Мы также разработали метод химической модификации гликокаликса гликанами – исключительно по его поверхности, с возможностью вводить в него необходимое количество гликана. Сочетание физической (с помощью гликолипидов) и химической модификации эритроцитов дало возможность вводить гликан целенаправленно, в разные части гликокалиуса. С помощью этой методологии изучено взаимодействие антител к гликанам системы АВН с модифицированными эритроцитами, и было показано, что взаимодействие происходит преимущественно с периферийно локализованными гликанами, хотя антитела (даже IgM) способны проникать на самый нижний «этаж» гликокаликса.

Показано, что гликолипид, встроенный в эндотелиальные клетки, способен в течение 1-ч контакта с монослоем переноситься на бактерии E.coli. Перенос осуществляется только на <10% популяцию бактерий; причина избирательного переноса будет изучена в дальнейшем. Проведение аналогичных экспериментов в динамике (в потоке) почти не влияло на результат.

Исследовано взаимодействие целых вирионов вируса гриппа с гликановыми лигандами в составе гликочипа (400 гликанов, около 50 из которых сиалированы) с целью понять причины необратимости связывания вирионов с клеточной поверхностью, несмотря на ожидаемое их высвобождение из-за разрушения сиало-рецептора нейраминидазой вируса. Предлагаемый подход позволяет избавиться от неспецифических взаимодействий даже при длительном контакте вирионов с сиало-поверхностью. Данная методология выявила взаимодействие вирусов гриппа с гликанами, не имеющими в своем составе остатков сиаловой кислоты. Таким образом, у вируса гриппа есть потенциальные дополнительные клеточные лиганды, нерасщепляемые вирусной нейраминидазой, что объясняет необратимость связывания вириона с клеткой.

 

По направлению «Белки биокаталитических систем»

В 2018 году рентгеноструктурным анализом определена структура фрагмента АТР-зависимой Lon-протеазы из E. coli (Ес-Lon(235-584), PDB ID 6N2I). Это позволило Ес-Lon-протеазе стать первым представителем подсемейства LonА, для которого доступны структурные данные фрагментов, покрывающих полную последовательность фермента. Получено подтверждение справедливости гипотезы о том, что LonA-протеазы представляют особый подкласс AAA+-белков, содержащих наряду с классическим АТР-азным модулем часть гипотетического второго АТР-азного модуля. Получены четыре новых рекомбинантных белка, содержащих фрагменты из различных участков фермента IgA-протеазы.

Исследованы их иммуногенные и протективные свойства в отношении менингококков основных эпидемических серогрупп. Показано формирование долгосрочного иммунного ответа и эффективной защиты от менингококков серогрупп А, В и С в модельных животных.

Получены кристаллы каталитически неактивного мутанта олигопептидазы В из Serratia proteamaculans (PSP) PSP – S532A в комплексе с низкомолекулярным субстратом ВАРNA и с пептидным субстратом Z-Arg-Arg-рNA.

Усовершенствован метод молекулярного моделирования в приложении к описанию кинетического механизма взаимодействия бутирилхолинэстеразы с экотиофатом. При помощи методов молекулярного моделирования мы обнаружили, что существует две возможных конкурирующих конформации экотиофата в активном центре бутирилхолинэстеразы. Существование первой, реакционноспособной, было предсказано ранее (run11_16). Вторая - близкая по режиму связывания к субстратам холиновой группы и обладающая лучшей оценкой энергии связывания, является ингибирующей (run6_2). Учет наличия обоих состояний позволил уточнить кинетическую схему для реакции экотиофата с бутирилхолинэстеразой, что было использовано при дизайне вариантов бутирилхолинэстеразы с фосфатазной активностью.

В результате выполнения этапа проекта был выделен максимально очищенный функционально активный препарат ранее неописанного фермента - люциферазы F.heliota, а также предложены и обоснованы заключения о комплексном строении данного фермента. Люцифераза червей F. heliota является не одним полипептидом, а белковым комплексом. Данный комплекс имеет ряд посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование по нескольким сайтам, что подтверждается данными ИЭФ, указывающими на наличие нескольких изоформ с различным зарядом у комплекса люциферазы червей F. heliota.

Разработан мультиферментативный каскад синтеза модифицированных нуклеотидов. Для расширения перечня доступных для синтеза нуклеотидов de novo был получен новый термофильный рекомбинантный фермент ‒ гипоксантинфосфорибозилтрансфераза HPRT из Thermus Thermophilus HB27 и исследована его субстратная специфичность. Проведен синтез новых модифицированных нуклеотидов (2-хлораденозинмонофосфата и аллопуринол-монофосфата) и исследована их структура физико-химическими методами.

 

ИТОГОВЫЙ ОТЧЕТ (за 2015 – 2018 гг.)

по Соглашению №14-50-00131 с Российским научным фондом

 

Направление «Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции»

На основе обобщения экспериментальных и модельных структурно-динамических данных описаны конформационные перестройки лиганд-связывающих, трансмембранных,примембранныхи цитоплазматических доменов РТК и РТК-подобных рецепторов, в том числе рецепторов нейротрофинов, факторов роста фибробластов, эпидермальных факторов роста и гормона роста из организма человека. В рамках разработанного липид-опосредованного механизма передачи сигнала через мембрану клетки показана возможность альтернативных согласованных белок-белковых и белок-липидных взаимодействий для структурных доменов рецепторов в ответ на связывание лигандов. 

Ранее нами было показано, что рецепторная тирозинкиназа ИРР, близкий структурный гомолог рецептора инсулина, является клеточным сенсором слабощелочной среды. Была проведена экспрессия эктодомена ИРР в эукариотических клетках, выделен чистый белок и изучена его пространственная структура при помощи малоуглового рентгеновского рассеяния. Построена модель трехмерной структуры эктодомена и найдены ее изменения при защелачивании среды. 

Получен профиль экспрессии транскриптов в почках однопометных ИРР нокаутных мышей и мышей дикого типа в условиях до и после щелочной нагрузки с использованием метода глубокого секвенирования NGS. Выявлены белки, функционально связанные с рецептором ИРР. Наибольший интерес представляет белок рН-зависимый калиевый канал TASK-2, один из главных медиаторов респираторной хемочувствительности.

В результате работы по программе были изучена роль сигнальных путей, регулируемых белками семейств Agrи Nogginразвитие головного мозга и при регенерацию больших придатков тела у модельных низших позвоночных (рыб и амфибий). Впервые был выявлен рецептор белка Ag1 - белок Tfp4. Показано, что взаимодействие Ag1 с Tfp4 регулирует регенерацию хвостов и почек задних конечностей у головастиков шпорцевой лягушки Xenopus laevis, а также плавников у рыбы Danio rerio. Впервые показано взаимодействие белка Noggin4 с белками Wnt8 и Wnt11. Выявлена важная роль этого взаимодействия для раннего развития мозга.

 

Направление «Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы»

Самым опасным свойством рака ПЖ является раннее метастазирование, которое часто происходит до выявления первичной опухоли. Рак ПЖ не поддается новейшим методам иммунотерапии, удостоенным Нобелевской премии 2018 г. и успешно работающим в других видах рака. В процессе развития рака включение и выключение ключевых генов часто происходит в порядке обратном тому, что наблюдается при эмбриогенезе. Это явление называется рекапитуляцией. Мы пытались применить этот принцип к раку ПЖ.

Для решения этой задачи были систематизированы данные по белкам и генам, вовлеченным в развитие и морфогенез поджелудочной железы человека и животных. Систематизированы данные по белкам и генам, активно вовлеченным в возникновение и развитие рака поджелудочной железы, а также в инициацию метастатического процесса и диссеминированного роста. Проведено сопоставление этих двух массивов данных и выявлены потенциальные гены-кандидаты, вызывающие эмбриоподобное состояние раковых клеток.

Созданы коллекции эмбриональных тканей человека на различных стадиях формирования поджелудочной железы. Собраны образцы аутопсийного материала ткани нормальной поджелудочной железы и коллекция хирургических образцов поджелудочной железы при хроническом панкреатите. Созданы коллекции хирургических образцов рака поджелудочной железы. Все образцы гистологически охарактеризованы, собраны сведения о пациентах. Созданы аннотированные каталоги собранных образцов тканей. Из собранных образцов тканей приготовлены панели РНК, кДНК, а также выделена геномная ДНК для проведения в дальнейшем эпигенетического анализа промоторов наиболее интересных мастер генов.

Для дальнейшей работы были взяты семь потенциальных мастер генов (PDX1, PTF1a, SOX9, HNF1-beta, GATA4, KLF5 и ZEB1) и белков, вызывающих эмбриоподобное состояние опухоли. Проведен экспериментальный анализ содержания продуктов экспрессии потенциальных мастер генов в опухолевых и эмбриональных тканях поджелудочной железы, показана дифференциальная экспрессия этих генов в опухолевых и фетальных тканях поджелудочной железы.

Мы проводили исследование экспрессии генов в хирургических образцах рака ПЖ и фетального материала и открыли отсутствие рекапитуляции при раке ПЖ, за исключением нескольких генов. Это совпало с появившимися литературными данными, что ПАПЖ (протоковая аденома ПЖ) может представлять многочисленные болезни с одинаковым внешним видом. Мы обратили также внимание, что в большинстве хирургических образцов понижено содержание одного из ключевых факторов эмбрионального развития – мастер регулятора PDX1. Самые плохие прогнозы имеют пациенты с низким уровнем этого регулятора в опухоли. Предполагалось, что мастер ген PDX1 возможно на последних этапах развития ПАПЖ может быть ингибитором метастазирования. Для проверки такой возможности мы привлекли коллег из ИМГ РАН с моделью рыбы зебра. Небольшие размеры, короткий жизненный цикл и иммунная система эмбрионов Danio, толерантная к чужеродным антигенам, позволяет использовать для анализа клетки человека. Мы сконструировали клетки ПАПЖ, экспрессирующие PDX1, вводили их в эмбрионы Danio и с помощью флуоресцентной метки показали, что экспрессия PDX1 действительно ингибирует миграцию клеток по телу рыбки. Таким образом, открылось новое поле для борьбы с ПАПЖ, которое мы собираемся развивать уже после завершения проекта, но которое является его порождением. Другим результатом является разработка альтернативной концепции терапии рака, особенно такого, как ПАПЖ. В отличие от стандартных подходов, рассчитанных на уничтожение собственно раковых клеток, эта концепция указывает на предпочтительность использования в качестве терапевтических мишеней контакты раковых клеток и окружающей стромы.

Исследовались функциональные внутриклеточные взаимосвязи двух важнейших мастер генов - PDX1 и важного гена SOX9. Для этой цели в случае SOX9, которого много в клетках ПАПЖ, мы применяли специфическое подавление транскрипции гена и затем анализировали реакции других генов на это снижение концентрации. В результате нам удалось добавить к известным участникам сети взаимодействий SOX9 еще несколько дополнительных. В случае PDX1, которого в клетках ПАПЖ мало, наоборот, мы вводили в эти клетки экспрессирующийся ген. При этом реагировали только уже известные своими взаимосвязями с PDX1 гены. Был завершен анализ экспрессии для пяти потенциальных мастер генов (PDX1, PTF1a, SOX9, HNF1-beta, GATA4), ключевых для эмбриогенеза поджелудочной железы и гена ZEB1, важного для процесса метастазирования. Наконец, проводили анализ эпигенетического состояния промоторов отобранных мастер генов, главным образом упомянутого SOX9, поскольку известна большая роль эпигенетических процессов в регуляции их экспрессии в опухолевых и эмбриональных тканях ПЖ. Наибольшие изменения наблюдались для промоторов генов ZEB1, MDC1, SOX9 и GATA4, что указывает на вовлеченность этих промоторов в функционирование генов.

 

Направление «Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета»

Разработана эффективная технология экспрессии в прокариотической системе и очистки рекомбинантных антимикрбных пептидов (АМП). Для экспрессии АМП в бесклеточной белок-синтезирующей системе были получены генно-инженерные конструкции в виде кольцевых и линейных молекул ДНК, кодирующих АМП под контролем промотора Т7. Изучена антимикробная активность пептидов в отношении штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также их гемолитическая активность в отношении свежевыделенных человеческих эритроцитов. Исследованы цитотоксические свойства аналогов пептида мечехвоста Tachypleus tridentatus, обладающих высокой селективностью антибактериального действия в отношении нормальных клеток человека. Показано, что аналоги TachY8S и TachI11S обладают сравнительно невысокой цитотоксичностью при концентрациях вплоть до 50 мкМ, что позволяет рассматривать их как перспективные соединения для разработки антибиотиков с широким спектром действия. Исследована способность ряда антимикробных пептидов, относящихся к различным структурным классам к ингибированию процесса бактериальной трансляции. Пептид PRP7(1-22), продемонстрировавший высокую эффективность ингибирования рибосомального биосинтеза белка, был подвергнут сканированию аланином, что позволило выявить ключевые аминокислотные остатки, необходимые для осуществления биологической функции пептида. Методом проточной цитофлуориметрии исследовано действие пептида мечехвоста Tach, а также его модифицированных аналогов TachY8S и TachI11S на бактерии и линии клеток человека. Показано, что точечные замены гидрофобных остатков на остаток серина в структуре пептида позволяют свести к минимуму его цитотоксичность при сохранении мембранотропного механизма действия и высокой антибактериальной активности. Проведены исследования совместного действия АМП с различными конвенциальными антибиотиками на бактерии. Синергический эффект наблюдался для пептида Tach при совместном действии с эритромицином или рифампицином в отношении культуры E. coli и ванкомицином в отношении культуры S. aureus. Наиболее ярко синергизм проявлялся в сочетании PRP7(1-22) / рифапмицин. При этом в данном сочетании не наблюдалось усиление гемолитического эффекта.

Обнаружены и выделены новые изоформы липид-траснпортирующих белков (LTP) укропа и гороха. Определены полные аминокислотные последовательности данных белков и структуры полноразмерных кДНК, кодирующих белки-предшественники. Получены образцы LTP укропа огородного Anethum graveolens (Ag-LTP) и LTP гороха посевного Pisum sativum Ps-LTP1, меченных стабильными изотопами 13C,15N. Методом ЯМР-спектроскопии определена пространственная структура липид-транспортирующего белка укропа Ag-LTP в водном растворе. Показано, что структура Ag-LTP представлена четырьмя α-спиралями и содержит длинную неупорядоченную петлю в С-концевом участке молекулы. Ag-LTP содержит внутреннюю гидрофобную полость объемом ~800 Å3, в которой располагается сайт связывания липидных молекул. По данным о релаксации ядер 15N охарактеризована внутримолекулярная динамика Ag-LTP в свободном состоянии и в комплексе с липидом LPPG. С помощью метода флуоресцентной спектроскопии для LTP укропа и гороха выявлена специфичность при связывании жирных кислот, лизофосфолипидов и жасмоновой кислоты - растительного гормона роста и развития растений. Исследована способность LTP из чечевицы, укропа и гороха переносить липиды и эффективность переноса. Установлено, что анализируемые белки способны переносить липидные молекулы между липосомами in vitro. Все три белка более эффективно переносили отрицательно заряженный 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин (DMPG) по сравнению с 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолином (DMPC). Важно отметить, что LTP гороха наиболее эффективно переносил DMPG по сравнению с LTP чечевицы и, особенно, c LTP укропа. Вместе с тем, LTP укропа эффективнее других белков переносил DMPC.

Разработаны биотехнологические способы получения белков-аллергенов фундука Cor a 8, пыльцы полыни Art v 3 и амброзии Amb a 6, принадлежащих к классу растительных LTP. Проведено сравнительное изучение роли различных растительных LTP в развитии аллергических реакций. Перекрёстная реактивность антител класса IgE в сыворотках пациентов с аллергическими реакциями на Pru p 3 персика и Len с 3 чечевицы (LTP из чечевицы Lens culinaris Lc-LTP2), а также на Pis s 3 гороха (LTP из гороха Pisum sativum Ps-LTP1) была оценена с помощью метода иммуноферментного анализа. Методом иммуноблоттинга подтверждено присутствие специфических IgE к указанным аллергенам в сыворотках пациентов. Полученные данные свидетельствуют о клинически значимой роли аллергенов класса LTP в сенсибилизации пациентов из Московского региона.

Проведен пептидомный анализ ежовника (Echinochloa crusgalli L). Идентифицированы новые молекулы из семейства альфа-харпининов, установлены их молекулярные массы и частичные аминокислотные последовательности. Получены количественные данные об усилении противогрибковой активности при действии комплекса альфа-харпининов семян ежовника из группы EcAMP. Проведен биоинформатический анализ транскрибируемых генов, кодирующих гомологи металл-ассоциированных протеаз (фунгализинов), секретируемых грибами рода Fusarium. Отобрана структура из вида F. graminearum, наиболее гомологичная охарактеризованному ранее ферменту фунгализину из вида F. verticillioides. Разработан способ получения рекомбинантного аналога фермента путем гетерологической экспрессии в эукариотической системе. Разработаны схемы для экспрессии двух структурных типов хитиназ культурных злаков в прокариотической системе. Проведен скрининг пула защитных пептидов растений из семейства альфа-харпининов с целью выявления ингибиторов протеолитической активности. Установлено наличие свойств ингибиторов трипсиноподобных протеаз у двух новых молекул, выделенных из зерна культурного и дикорастущего злаков.

В рамках изучения пептидома растений проанализированы пептидные пулы клеток модельного объекта – мха Physcomitrella patens – и выявлено свыше 28 тысяч эндогенных пептидов – продуктов деградации функциональных белков. При помощи биоинформатического анализа выявлено около 220 тысяч коротких открытых рамок считывания (sORF). С помощью ПЦР в реальном времени обнаружено увеличение уровня транскрипции некоторых РНК, предположительно кодирующих пептиды, образующиеся при разных стрессовых воздействиях. Выделена, очищена и секвенирована мРНК из трёх типов клеток мха Physcomitrella patens. Обнаружена транскрипция 23446 генов, к которым относится 47976 изоформ. При этом 12043 генов имеют более одной изоформы, т.е. подвергаются альтернативному сплайсингу. Кроме того, проведено секвенирование неполиаденилированной РНК для того, чтобы идентифицировать транскрипты участков генома, способные кодировать пептиды, но не связанные с работой РНК-полимеразы II. С использованием результатов транскрипционного профилирования была создана база данных коротких последовательностей для поиска пептидов в образцах с помощью масс-спектрометрического анализа. Функциональный анализ одного из пептидов, кодируемых длинной некодирующей РНК, показал, что он участвует в регуляции роста и дифференциации мха. Проведено исследование изменения пулов эндогенных пептидов мха Physcomitrella patens в ответ на воздействие стрессовых факторов. Показано, что эндогенные пептиды могут быть как эффекторами, так и модуляторами ответа мха P. patens на стресс. Обнаружено, что стрессовые фитогормоны (метилжасмонат и салициловая кислота) индуцирую образование новых эндогенных пептидов как в клетке, так и в секретоме. Показано, что в этих же условиях происходит активация убиквитин-протеасомной системы деградации белков в клетке, что может являться одним из путей биосинтеза обнаруженных пептидов. Выявленные изменения в доле посттрансляционно модифицированных пептидов, в частности, снижение количества пептидов, гидроксилированных по аминокислотному остатку пролина.

Идентифицировано около 3 тысяч уникальных пептидов из сыворотки крови. Чтобы получить представление о составе пептидома крови в норме и при онкологии, проведен LC-MS/MS анализ 20 образцов сыворотки и плазмы крови здоровых доноров, 10 пациентов с колоректальным раком и 10 пациенток с раком яичников на масс-спектрометре TripleTOF 5600+. В результате сравнения представленности и вариабельности пептидов крови при раке и в норме обнаружено, что в образцах плазмы и сыворотки крови пациентов с колоректальным раком идентифицировано 536 уникальных пептидов, а в образцах от пациенток с раком яичников – 790 уникальных пептидов. В рамках количественного анализа пептидомов крови было проведено выделение пептидного пула из 9 образцов сыворотки крови здоровых доноров и 9 образцов пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников. Проведен количественный анализ пептидомов сыворотки крови методом безметочной квантификации SWATH LC-MS/MS. Количественным безметочным масс-спектрометрическим методом SWATH в пулах образцов сыворотки крови пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников обнаружено 36 пептидов, содержание которых в 2 или более раз выше, чем в пулах сыворотки крови здоровых доноров, и 28 пептидов, содержание которых в 2 или более раз ниже, чем в пулах образцов от здоровых доноров.

 

Направление «Белок и гликан-опосредованные клеточные взаимодействия в динамических условиях»

С помощью синтетичееких молекулярных проб и экспериментаоьных (АСМ, ПМР, иммуно-ПЦР) и рассчетных (МД) методов был внесен значительный вклад в развитие изучения клеточных взаимодействий, в том числе таких, где важна динамическая компонента. Наиболее значимые результаты получены в разработке методов исследования, в том числе модельных экспериментальных систем, что открывает перспективу более интенсивного развития этой области в ближайшие годы. Два поднаправления имеют перспективу практического применения: для разработки лекарства против вируса гриппа важным фактом является обнаружение неклассической рецепции вируса на клетке-мишени; а для понимания эпидемиологии распространения заболеваний, вызванных бактериями, может стать полезным доказательство предположения о переносе на бактерии гликолипидов с групповой специфичностью крови А и В.

В ходе исследований был обнаружили ряд неожиданных фактов и явлений, что в перспективе дает импульс нескольким новым темам для изучения в последующие годы.

 

Направление «Белки биокаталитических систем»

В ходе реализации проекта созданы две системы высокопроизводительного скрининга биокаталитической активности: микрофлюидной системы генерации капель двойной эмульсии; а также системы скрининга биокатализаторов с протеолитической активностью, экспонированных на поверхности дрожжевых клеток, основанной на стрептавидин-биотитовом взаимодействии непосредственно на поверхности клеточной стенки дрожжей. Установлено, что данные системы позволяют проводить селекцию библиотек биокатализаторов с целью направленного изменения их функциональной активности. Для осуществления скрининга с применением таких систем были разработаны системы векторов для дрожжевого дисплея. На основе разработанных векторов были созданы библиотеки активного центра бутирилхолинэстеразы и успешно проведен поиск вариантов, способных к гидролизу фосфорорганических токсинов. Разработан метод компьютерного скрининга библиотек активного центра ферментов и каталитических антител, метаболизирующих фосфорорганические соединения. Экспериментальная проверка полностью подтвердила результаты компьютерного предсказания.

В рамках выполнения проекта был выделен максимально очищенный функционально активный препарат фермента - люциферазы F.heliota и проведен его структурно-функциональный анализ. Для оптимизации работы биолюминесцентной системы червя F. heliota нами были получены аналоги природного люциферина, обладающие повышенной клеточной проницаемостью, а также конъюгат люциферина F. heliota, HOBDI-BF2, максимум биолюминесценции которого смещен в красную область спектра, соответствующую окну прозрачности биологических тканей.

Определена 3D-структура фрагмента (235-584) LonА-протеазы E. coli (Ес-Lon, PDB ID 6N2I). Доказана исключительная роль уникального инсерционного HI(CC)-домена в формировании функционально активной структуры Ес-Lon, в реализации процессивного механизма протеолиза и в сохранении конформационной стабильности фермента. На основе фрагментов IgA1 протеазы N. meningitidis сконструированы и получены четыре новых рекомбинантных белка. На животных исследованы их иммуногенные и протективные свойства.

Разработан и успешно реализован новый полиферментативный каскад синтеза модифицированных нуклеотидов с участием рекомбинантных ферментов нуклеинового обмена из термофильных организмов. Проведен рентгеноструктурный анализ кристаллов ферментов и определена их трехмерная структура. Для уточнения каталитического механизма на основе полученных структур методами молекулярной динамики созданы модели комплексов ферментов с лигандами и определены ключевые аминокислотные остатки, участвующие в связывании субстратов в активном центре.

14 декабря 2018 года

<form action="" method="post" class="commentForm" id="commentForm-{0}"> <input type="hidden" name="pressId" value="2674" /> <input type="hidden" name="parentId" value="{1}" /> <input type="hidden" name="id" value="{2}" /> <txt name="comment_text" id="comment_text">{3}</txt> <input type="button" class="button" value="Комментировать" /> <a class="button" href="javascript:void(null)">Отмена</a> <span class="wait">Подождите немного...</span> <div class="clear"></div> </form>