Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов

Лаборатория Екатерины Люкмановой исследует «трехпетельные» белки человека семейства Ly6/uPAR и родственные им нейротоксины из яда змей. В центре внимания находятся молекулярные механизмы взаимодействия изучаемых белков с их рецепторами. Коллектив лаборатории владеет передовыми технологиями рекомбинантной продукции «трехпетельных» белков, недоступных из природных источников. Это позволило впервые исследовать пространственную структуру и провести ряд функциональных исследований таких белков человека как Lynx1 (фактор регуляции нейропластичности), а также SLURP-1 и SLURP-2 (ауто/паракринные регуляторы эпителиальных клеток). Эти белки в будущем могут быть использованы в качестве прототипов для препаратов, улучшающих когнитивные функции, противораковых препаратов, а также лекарств, направленных на лечение ряда кожных заболеваний.

Исследования лаборатории ведутся методами  белковой инженерии, клеточной биологии, нейрофизиологии, электрофизиологии. Кроме того, лаборатория сотрудничает с лабораторией структурной биологии ионных каналов ИБХ РАН в исследовании потенциалозависимых ионных каналов человека. Последнее время лаборатория активно развивает структурные исследования ионных каналов методами крио-электронной микроскопии. Разработаны системы экспрессии в клетках насекомых каналов млекопитающих TRPV1, ASIC3, a7-nAChR.

Все публикации (показать избранные)

Загружаются...

Люкманова Екатерина Назымовна

Методом cryo-EM определены структуры комплексов внеклеточного домена a7-nAChR с нейротоксинами a-Bgtx и WTX

Совместно с: Лаборатория структурной биологии ионных каналов,  Группа анализа структуры мембранных белков in silico

Методами крио-электронной микроскопии получены изображения комплексов внеклеточного домена a7-nAChR с нейротоксинами a-Bgtx и WTX, что позволило в обоих случаях определить структуры комплексов со средним разрешением 3.5 А и 6.0 А, соответственно. Методами ЯМР-спектроскопии и сайт-направленного мутагенеза были получены дополнительные данные о взаимодействии токсина WTX с мембранным окружением a7-nAChR и самим рецептором. Полученные данные позволили методами компьютерного моделирования построить модель комплекса полноразмерного рецептора a7-nAChR с токсином WTX в мембранном окружении, что в свою очередь позволило описать новый тип взаимодействия нейротоксин/рецептор, не описанный ранее. В процессе работы также был разработан новый метод подтверждения комплексообразования рецептор-лиганд с применением флуоресцентно-меченых лигандов и гель-фильтрации.

Публикации

  1. Kulbatskii DS, Shulepko MA, Sluchanko NN, Yablokov EO, Kamyshinsky RA, Chesnokov YM, Kirpichnikov MP, Lyukmanova EN (2020). Efficient screening of ligand-receptor complex formation using fluorescence labeling and size-exclusion chromatography. Biochem Biophys Res Commun ,

(1) Определена роль природных мутаций белка человека SLURP-1 в патогенезе кожного заболевания Mal de Meleda

Совместно с: Лаборатория структурной биологии ионных каналов,  Группа анализа структуры мембранных белков in silico

Mal de Meleda (MDM) это рецессивно наследуемая подошвенная кератодермия, связанная с мутациями в гене, кодирующем белок SLURP-1. SLURP-1 контролирует рост, дифференцировку и апоптоз кератиноцитов путем взаимодействия с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами α7-типа (α7-nAChR). SLURP-1 имеет трехпетельную структуру с β-структурным ядром («головой»). Чтобы определить роль мутаций SLURP-1, мы получили 24 мутантных варианта белка с заменами в различных частях молекулы SLURP-1, включая природные варианты, участвующие в развитии MDM. Все мутанты, кроме R71/H/P/A, T52/A, R96/P и L98/P, были успешно рефолдированы из цитоплазматических телец включения. Антипролиферативную активность мутантов изучали на кератиноцитах человека Het-1A. Мутации в петлях I и III приводили к частичной или полной инактивации SLURP-1, в то время как большинство мутаций в петле II увеличивали антипролиферативную активность SLURP-1. Замена остатков R96 и L98, расположенных в «голове» белка, на аланин, приводила к проявлению проапоптотической активности SLURP-1. Наши результаты согласуются с наблюдаемым разнообразием фенотипов MDM. На основе полученных функциональных данных построена модель комплекса SLURP-1/α7-nAChR. Наше исследование предоставляет новую функциональную и структурную информацию о роли мутаций SLURP-1 в патогенезе MDM и предсказывает новые варианты SLURP-1, которые могут вызывать заболевание.

1) Ингибитор каналов ASIC мамбалгин – новый прототип препаратов для направленной терапии онкозаболеваний

Совместно с: Лаборатория структурной биологии ионных каналов,  Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов,  Лаборатория мембранных и биоэнергетических систем

Протон-управляемые каналы ASIC1 являются молекулярной мишенью трехпетельных токсинов из яда черной мамбы (Dendroaspis polylepis) – мамбалгинов. Мамбалгины эффективно ингибируют гомо- и гетеромерные рецепторы, содержащие субъединицу ASIC1a, однако возможность их использования в качестве противоопухолевых агентов ранее не исследовалась. Показано, что мРНК ASIC1а экспрессируется в клетках хронической миелогенной лейкемии и глиом, но не в нормальных клетках. Мамбалгин-2 подавлял рост клеток глиомы U251 MG и A172 с ЕС50 в наномолярном диапазоне, не влияя на пролиферацию нормальных астроцитов. Примечательно, что мутанты мамбалгина-2 не влияли на рост клеток глиомы, указывая на ASIC1a как на главную молекулярную мишень мамбалгина-2 в глиомных клетках. Мамбалгин-2 вызывал остановку клеточного цикла, ингибировал фосфорилирование циклина D1 и циклин-зависимых киназ (CDK) и вызывал апоптоз в глиомных клетках. Кроме того, мамбалгин-2 подавлял рост клеток первичной линии, полученной от пациента с глиобластомой. Наши данные указывают на мамбалгин-2 как на перспективный прототип препаратов для направленного лечения онкозаболеваний, и на каналы, содержащие субъединицу ASIC1a, как на новую мишень таргетной терапии.

Трехпетельные белки человека ингибируют рост клеток карцином

Совместно с: Лаборатория структурной биологии ионных каналов

Никотиновые рецепторы ацетилхолина (nAChR) играют важную роль в физиологии клеток эпителия, а их активация способствует развитию карцином. Природные модуляторы никотиновых рецепторов ацетилхолина могут стать перспективными прототипами новых противоопухолевых средств.

Показано, что рекомбинантные препараты трехпетельных белков человека ws-Lynx1 и rSLURP-1 ингибируют рост клеток карциномы легкого и меланомы. Препарат ws-Lynx1 в клетках А549 стимулирует антипролиферативные и проапоптотические сигнальные каскады, связанные с активацией α7-nAChR. Препарат rSLURP-1 тормозит никотин-индуцированный рост клеток карциномы легкого, а также отменяет вызванное никотином увеличение экспрессии α7-nAChR и снижение экспрессии гена-онкосупрессора PTEN. Кроме того, rSLURP-1 тормозит рост мультиклеточных сфероидов из клеток различных карцином. Совместное применение rSLURP-1 с другими противоопухолевыми препаратами (гефитиниб, бортезомиб, доксорубицин) приводит к полной остановке роста сфероидов.

Таким образом, препараты ws-Lynx1 и rSLURP-1 представляют собой перспективные прототипы для разработки новых препаратов для лечения онкологических заболеваний.

Комбинаторное селективное введение изотопов 13C и 15N упрощает анализ спектров ЯМР и позволяет картировать интерфейс взаимодействия в комплексах мембранных рецепторов с лигандами

Совместно с: Группа анализа структуры мембранных белков in silico,  Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии,  Лаборатория структурной биологии ионных каналов

Комбинаторное введение в молекулы белков стабильных изотопов 13C и 15N позволяет значительно упростить анализ спектров ЯМР. Впервые решена задача и разработан алгоритм CombLabel по расчету схемы комбинаторного введения 13C и 15N меток с минимальной ценой. Применение программы позволило произвести отнесение 50% ЯМР-сигналов основной цепи второго потенциал-чувствительного домена натриевого канала Nav1.4 человека (VSD-II). Токи утечки через мутантные варианты Nav1.4, содержащие замену Arg675Gly в VSD-II, приводят к развитию наследственного заболевания – нормокалемического периодического паралича. Методом ЯМР спектроскопии определен интерфейс взаимодействия VSD-II с токсином Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei, который способен блокировать токи утечки. В модели комплекса VSD-II/Hm-3, построенной на основании данных ЯМР, токсин связывается с внеклеточной петлей S1-S2, дестабилизируя состояние домена, при котором наблюдаются токи утечки. На примере комплексов токсина Hm-3 с VSD-I и VSD-II канала Nav1.4 показано, что токсины паукообразных могут по-разному взаимодействовать с различными доменами в составе одного натриевого канала.

Изучено физиологическое действие двух бисбензилизохинолиновых алкалоидов - лигандов каналов ASIC1a.

Совместно с: Лаборатория биологических испытаний,  Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Подтип ASIC1a является самым эффективным кислото-чувствительным каналом в клеточной мембране, и он играет важную роль в возбуждении нейронов центральной нервной системе. Именно лиганды к этому подтипу каналов ASIC представляют наибольший интерес для разработки средств борьбы с болью, инсультами, и с нейродегенеративными заболеваниями.

В экспериментах in vitro на гетерологически экспрессированных каналах ASIC1a методом двухэлектродного фиксирования потенциала изучено действие двух бисбензилизохинолиновых алкалоидов растений.

Алкалоид линдольдхамин, выделенный из листьев лавра, значительно ингибировал ответ канала ASIC1a на физиологически значимые слабые стимулы pH 6,5–6,85 с IC50 в диапазоне 150–9 мкМ, но вызывал лишь частичный ингибирующий ответ при подаче более кислых раздражители. У мышей внутривенное введение линдольдхамина в дозе 1 мг/кг вызывало обезболивающий эффект в тесте термической гиперальгезии при воспалении, но не в тесте уксусные корчи, где проводят внутрибрюшинную инъекцию уксусной кислоты. Таким образом, было показана не просто перспективность использования растительных алкалоидов для облегчения боли, но и косвенно подтверждена вовлеченность каналов ASIC1a периферической нервной системы в генерацию болевого ответа на слабое закисление.

Структурный аналог дауризолин, в отличие от линдольдхамина, не ингибировал активацию канала ASIC1a, но вызывал необычный ответ на активацию канала протонами. Необычность заключается в проявлении второй компоненты тока, которая проявляется с задержкой в 2.5 секунды после начала развития первой быстрой компоненты тока и так же быстро десенситизируется. Вторые компоненты тока характерны для каналов ASIC2 и ASIC3, но эти компоненты постоянные, и длятся все время до полной отмены кислотного стимула. Найденный второй компонент тока у подтипа ASIC1a позволяет утверждать, что все типы кислото-чувствительных каналов имеют двойной механизм открывания и десенситизации тока, который интересно будет определить в дальнейших экспериментах.

Обнаружено, что секретируемый белок человека SLURP-1, который экспрессируется в эпителиальных клетках и контролирует их пролиферацию и миграцию, подавляет рост раковых клеток эпителиального происхождения.

Воздействие SLURP-1 на раковые клетки характеризуется положительной обратной связью: экзогенный (рекомбинантный) SLURP-1 связывается с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами α7 типа на поверхности клеток и запускает каскад сигналов, который мгновенно активирует секрецию эндогенного SLURP-1 из внутриклеточных депо, быстро повышая его концентрацию в межклеточном пространстве и усиливая антипролиферативное действие.

Концентрации SLURP-1, подавляющие деление опухолевых клеток, не влияют на рост нормальных клеток.

Токсин паука блокирует аберрантные токи в мутантных ионных каналах

Совместно с: Лаборатория структурной биологии ионных каналов,  Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии

Токсин из яда паука-бокохода Heriaeus melloteei может стать основой для создания лекарства от гипокалиемического периодического паралича второго типа, надежного лекарства от всех случаев которого не существует. Причиной заболевания служат мутации гена потенциал-чувствительных натриевых каналов NaV1.4, характерных для скелетных мышц. В результате мутаций эти каналы проводят аберрантные токи, мышцы оказываются неспособны отвечать на сигналы нервной системы, и развивается слабость вплоть до паралича. Токсин Hm-3 оказался способным селективно блокировать такие токи, протекающие через потенциал-чувствительных домен I мутантных каналов. Подробнее в пресс-релизе на сайте ИБХ.

Публикации

  1. Männikkö R, Shenkarev ZO, Thor MG, Berkut AA, Myshkin MY, Paramonov AS, Kulbatskii DS, Kuzmin DA, Castañeda MS, King L, Wilson ER, Lyukmanova EN, Kirpichnikov MP, Schorge S, Bosmans F, Hanna MG, Kullmann DM, Vassilevski AA (2018). Spider toxin inhibits gating pore currents underlying periodic paralysis. Proc Natl Acad Sci U S A 115 (17), 4495–4500

Взаимодействие вольт-сенсорного токсина Hm-3 с потенциал-чувствительным доменом Na+ канала Nav1.4: структурный взгляд на связывание опосредованное мембраной

Совместно с: Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии,  Лаборатория структурной биологии ионных каналов

Потенциалозависимые Na+ каналы (Nav) играют важнейшую роль в функционировании сердечно-сосудистой, мышечной и нервной систем. Некоторые мутации вызывают токи утечки через потенциал-чувствительные домены (VSD) каналов Nav, которые приводят к различным заболеваниям. Гипокалиемический периодический паралич (HypoPP) 2 типа вызван мутациями в сегментах S4 VSD в канале NaV1.4 скелетных мышц человека. Вольт-сенсорный токсин Hm-3 из яда паук Heriaeus melloteei подавляет токи утечки через такие мутантные каналы. Для изучения механизма взаимодействия Hm-3 и канала NaV1.4 мы сосредоточились на исследовании изолированного домена VSD-I с помощью ЯМР-спектроскопии в среде имитирующей мембрану. Модель комплекса Hm-3/VSD-I была построена методом белок-белкового докинга с использованием ограничений ЯМР. Токсин изначально закрепляется на поверхности мембраны, а затем образует комплекс с петлей S3b-S4 VSD-I. Связывание Hm-3 блокирует движение спирали S4 – датчика-потенциала и индуцирует аллостерические изменения, которые препятствуют появлению токов утечки. Наша работа является первым структурным ЯМР-исследованием взаимодействия между вольт-сенсорными токсинами и каналами Nav.

Публикации

  1. Männikkö R, Shenkarev ZO, Thor MG, Berkut AA, Myshkin MY, Paramonov AS, Kulbatskii DS, Kuzmin DA, Castañeda MS, King L, Wilson ER, Lyukmanova EN, Kirpichnikov MP, Schorge S, Bosmans F, Hanna MG, Kullmann DM, Vassilevski AA (2018). Spider toxin inhibits gating pore currents underlying periodic paralysis. Proc Natl Acad Sci U S A 115 (17), 4495–4500

Ефременко А.В., Шаронов Г.В., Феофанов А.В. (Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул), Люкманова Е.Н., Бычков М.Л., Шулепко М.А., Кульбатский Д.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. (Группа биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов, Отдел биоинженерии), Шенкарев З.О (Группа структурной биологии ионных каналов).

Обнаружено, что секретируемый белок человека SLURP-1, который экспрессируется в эпителиальных клетках и контролирует их пролиферацию и миграцию, подавляет рост раковых клеток эпителиального происхождения. Воздействие SLURP-1 на раковые клетки характеризуется положительной обратной связью: экзогенный (рекомбинантный) SLURP-1 связывается с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами α7 типа и запускает каскад сигналов, который активирует секрецию эндогенного SLURP-1, быстро повышая его концентрацию в межклеточном пространстве и усиливая антипролиферативное действие.  Концентрации SLURP-1, подавляющие деление опухолевых клеток, не влияют на рост нормальных клеток.

Вторичная структура и динамика потенциалочувствительного домена второй псевдосубъединицы канала Nav1.4 скелетных мышц человека

Совместно с: Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория структурной биологии ионных каналов

Потенциалозависимые Na+ каналы играют важнейшую роль в функционировании сердечно-сосудистой, мышечной и нервной систем. α-субъединица Na+ канала состоит из ~2000 аминокислотных остатков, что значительно затрудняет структурные исследования полноразмерных каналов. Методом ЯМР-спектроскопии мембраномоделирующем окружении, был исследован изолированный потенциалочувствительный домен (VSD-II) канала Nav1.4 скелетных мышц человека. Вторичная структура VSD-II схожа со структурой бактериальных Na+ каналов. Часть спирали S4 между первым и вторым консервативными остатками Arg, вероятно, имеет конформацию 3/10-спирали. Данные о релаксации ядер 15N выявили характерную подвижность в мкс-мс временном диапазоне для участков VSD-II, участвующих в предполагаемых межспиральных контактах. VSD-II демонстрирует повышенную подвижность в пс-нс временном диапазоне по сравнению с изолированными VSD K+ каналов.