Отдел молекулярной нейробиологии

В фокусе интересов отдела – организация и функционирование нервной системы. Проводятся фундаментальные исследования, направленные на выяснение молекулярной природы передачи нервных сигналов в норме и при патологиях, структуры и функции нейрорецепторов и ионных каналов и их лигандов, межклеточной коммуникации нейронов и глиальных клеток, внутриклеточных сигнальных каскадов, характерных для этих клеток, а также клеточных и молекулярных механизмов кодирования информации в сетях нейронов и глии, лежащих в основе обучения и памяти. Кроме того, выполняются прикладные работы, посвященные созданию новых подходов к терапии заболеваний, например, болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний, болевых синдромов при артрите и цистите, других воспалительных и нейрогенных синдромов. Исследования проводятся в кооперации с другими ведущими исследовательскими центрами России и других стран (Бельгии, Великобритании и США). В отделе реализуются темы ГЗ №№ и 0101-2014-0029, 0101-2018-0001, 0101-2018-0008, 0101-2018- 0011. Наибольшее внимание будет уделено следующим исследованиям и разработкам:

  • Получение данных сверхвысокого разрешения о структуре и динамике сетей нейронов и астроцитов
  • Получение селективных лигандов ионных каналов и нейрорецепторов, являющихся фармакологическими мишенями, прежде всего в болевых синдромах
  • Разработка подходов к терапии заболеваний, связанных с дисфункцией нервной системы, в том числе нейродегенеративных

Все публикации (показать избранные)

Семьянов Алексей Васильевич

Протон-управляемые каналы ASIC1 являются молекулярной мишенью трехпетельных токсинов из яда черной мамбы (Dendroaspis polylepis) – мамбалгинов. Мамбалгины эффективно ингибируют гомо- и гетеромерные рецепторы, содержащие субъединицу ASIC1a, однако возможность их использования в качестве противоопухолевых агентов ранее не исследовалась. Показано, что мРНК ASIC1а экспрессируется в клетках хронической миелогенной лейкемии и глиом, но не в нормальных клетках. Мамбалгин-2 подавлял рост клеток глиомы U251 MG и A172 с ЕС50 в наномолярном диапазоне, не влияя на пролиферацию нормальных астроцитов. Примечательно, что мутанты мамбалгина-2 не влияли на рост клеток глиомы, указывая на ASIC1a как на главную молекулярную мишень мамбалгина-2 в глиомных клетках. Мамбалгин-2 вызывал остановку клеточного цикла, ингибировал фосфорилирование циклина D1 и циклин-зависимых киназ (CDK) и вызывал апоптоз в глиомных клетках. Кроме того, мамбалгин-2 подавлял рост клеток первичной линии, полученной от пациента с глиобластомой. Наши данные указывают на мамбалгин-2 как на перспективный прототип препаратов для направленного лечения онкозаболеваний, и на каналы, содержащие субъединицу ASIC1a, как на новую мишень таргетной терапии.

Трёхмерная реконструкция астроцитарных отростков

Лаборатория внесинаптической передачи

Используя электронную микроскопию серийных срезов, мы получили трёхмерную реконструкцию астроцитарных отростков. Астроцитарные отростки состояли из веточек, стержнеобразных структур, содержащих органеллы, а также листочков, тонких перисинаптических отростков без органелл, прикреплённых к веточкам. Мы идентифицировали листочки разных размеров и форм и показали, что более крупные листочки частично теряют свою плоскую структуру, что может быть необходимо для приёма цистерн эндоплазматического ретикулума и дальнейшего преобразования листочков в расширения веточек. Дополнительно было показано, что количество глутаматергических синапсов, контактирующих с листочками, определялось только размерами самих листочков.

Публикации

  1. Gavrilov N, Golyagina I, Brazhe A, Scimemi A, Turlapov V, Semyanov A (2018). Astrocytic coverage of dendritic spines, dendritic shafts, and axonal boutons in hippocampal neuropil. Front Cell Neurosci 12, 248

Исследование паттернов кальциевой динамики в сетях астроцитов головного мозга

Лаборатория внесинаптической передачи

Астроциты кодируют информацию о состоянии окружающей нервной ткани в виде пространственно-временных паттернов Ca2+ активности. В свою очередь, Ca2+ события в астроцитах через ряд механизмов влияют на синаптическую пластичность, высвобождение глиопередатчиков и локальный кровоток. Использование генетически кодируемых Ca2+ индикаторов позволило визуализировать астроцитарную Ca2+ активность на уровнях от тонких периферических отростков до целых клеточных доменов и сетей клеток. Интерпретация экспериментальных результатов требует использования адекватных методов обработки данных, включая стабилизацию изображений, подавление шума, разделение сигнала на быстрые и медленные компоненты, сегментацию отдельных событий сигнализации и установление возможных закономерностей в появлении этих событий. Мы показали, что спонтанная Ca2+ активность в отдельных астроцитах имеет вид локализованных событий. Эти события (оттенки жёлтого на обработанном рисунке) возникали преимущественно на периферии пространственных доменов астроцита и характеризовались распределениями с тяжелым хвостом по размерам и длительностям. Локальные кинетические параметры нарастания и затухания флуоресценции были привязаны к морфологии клетки; в зависимости от степени вовлеченности крупных отростков в наблюдаемые события, присутствовали градации средней амплитуды и пиковой скорости изменения флуоресценции. На уровне астроцитарной сети наблюдались флуктуации суммарной Ca2+ активности, наибольший вклад в пики активности вносили одиночные события, охватывающие целиком пространственный домен астроцита. Разработанные методические подходы и полученные данные могут пролить свет на принципы формирования пространственно-временных паттернов астроцитарной Ca2+ активности и их вовлеченность в когнитивные процессы.

Публикации

  1. Браже АР, Доронин МС, Попов АВ, Денисов Александро, Семьянов АВ (2019). Patterns of Calcium Dynamics in Brain Astrocytic Networks. Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova 105 (11), 1436–1451

Ранее для проектирования пептидов с заданной функцией мы предложили использовать удобный структурный каркас, а именно α-гарпининовую укладку, характерную для токсинов из яда скорпионов и защитных пептидов растений. Теперь использование разработанного нами метода белковой топографии позволило существенно улучшить свойства искусственного α-гарпинина, блокирующего калиевые каналы Kv1.3, важную фармакологическую мишень. Совместное использование двух подходов ‑ «скаффолд-инженерии» и белковой топографии ‑ позволяет получать оптимизированные лиганды ионных каналов.

Изучено физиологическое действие двух бисбензилизохинолиновых алкалоидов - лигандов каналов ASIC1a.

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов,  Лаборатория биологических испытаний,  Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Подтип ASIC1a является самым эффективным кислото-чувствительным каналом в клеточной мембране, и он играет важную роль в возбуждении нейронов центральной нервной системе. Именно лиганды к этому подтипу каналов ASIC представляют наибольший интерес для разработки средств борьбы с болью, инсультами, и с нейродегенеративными заболеваниями.

В экспериментах in vitro на гетерологически экспрессированных каналах ASIC1a методом двухэлектродного фиксирования потенциала изучено действие двух бисбензилизохинолиновых алкалоидов растений.

Алкалоид линдольдхамин, выделенный из листьев лавра, значительно ингибировал ответ канала ASIC1a на физиологически значимые слабые стимулы pH 6,5–6,85 с IC50 в диапазоне 150–9 мкМ, но вызывал лишь частичный ингибирующий ответ при подаче более кислых раздражители. У мышей внутривенное введение линдольдхамина в дозе 1 мг/кг вызывало обезболивающий эффект в тесте термической гиперальгезии при воспалении, но не в тесте уксусные корчи, где проводят внутрибрюшинную инъекцию уксусной кислоты. Таким образом, было показана не просто перспективность использования растительных алкалоидов для облегчения боли, но и косвенно подтверждена вовлеченность каналов ASIC1a периферической нервной системы в генерацию болевого ответа на слабое закисление.

Структурный аналог дауризолин, в отличие от линдольдхамина, не ингибировал активацию канала ASIC1a, но вызывал необычный ответ на активацию канала протонами. Необычность заключается в проявлении второй компоненты тока, которая проявляется с задержкой в 2.5 секунды после начала развития первой быстрой компоненты тока и так же быстро десенситизируется. Вторые компоненты тока характерны для каналов ASIC2 и ASIC3, но эти компоненты постоянные, и длятся все время до полной отмены кислотного стимула. Найденный второй компонент тока у подтипа ASIC1a позволяет утверждать, что все типы кислото-чувствительных каналов имеют двойной механизм открывания и десенситизации тока, который интересно будет определить в дальнейших экспериментах.

Создана база данных всех известных пептидных лигандов калиевых каналов – Kalium 2.0

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии

Ранее нами была создана исчерпывающая база данных токсинов скорпионов, действующих на калиевые каналы, получившая название Kalium. Теперь она была расширена и включает вообще все известные лиганды калиевых каналов пептидной природы. Вместе с ресурсом Guide to PHARMACOLOGY, содержащим информацию о низкомолекулярных лигандах, база данных Kalium 2.0 предоставляет исследователям всеобъемлющую информацию об этой важнейшей группе соединений.

По традиции, наша инициатива получила широкое одобрение сообщества, в качестве экспертов Kalium 2.0 выступили ведущие мировые специалисты в области лигандов ионных каналов. Подробнее читай в пресс-релизе на сайте РНФ. База данных Kalium 2.0 доступна по ссылке.

Впервые обнаружена молекулярная мишень действия орфанного нейропептида млекопитающих – ноцистатина, связанная с процессами болевой чувствительности.

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий,  Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Ноцистатин - эндогенный нейропептид, вырабатываемый нейронами в центральной и периферической нервной системе - до настоящего времени относился к классу сиротских белков, для которых не была явно определена молекулярная мишень действия. В лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН в экспериментах in vitro было показано, что ноцистатин возбуждает мембранные ионные каналы ASIC в нейронах центральной и периферической нервной системы, при этом возникающий ионный ток сопоставим по основным параметрам с тем, который возникает при закислении внеклеточной среды. Пептид способен активировать все подтипы кислото-чувствительных каналов, и его действие является концентрационно зависимым. Антагонисты ASIC ингибируют вызываемый аппликацией ноцистатина ток. Более того, активированные ноцистатином каналы десенсетизируются и теряют способность в дальнейшем реагировать на кислоту, поэтому в низкой дозе пептид ингибирует (подавляет), а в высокой – стимулирует работу каналов ASIC. Этим объясняется его двойственное действие на болевую чувствительность, где он выступает и как генератор болевых сигналов и как тормозящий агент одновременно. Ни один известный ранее лиганд ионных каналов ASIC не имеет подобных свойств.

Таким образом, обнаружен новый лиганд ионных каналов ASIC, физиологическая значимость которого в жизнедеятельности животных и человека ранее никак не ассоциировалась с регулированием работы этого рецептора. Поскольку каналы ASIC, прежде всего, участвуют в возникновении чувства боли, это открытие может послужить для разработки принципиально новых обезболивающих и противовоспалительных лекарств. Помимо этого, каналы ASIC участвуют в процессах, связанных с обучением, памятью и нейропластичностью, что позволяет предположить возможную вовлеченность ноцистатина в процессы регулирования высшей нервной деятельности и нейродегенерации. В этом аспекте изучение таких процессов с измерением и регулированием уровня эндогенного нейропептида – перспективная задача фундаментальных исследований.

Статья с результатами первых экспериментов опубликована в журнале Biomolecules.

Комбинаторное селективное введение изотопов 13C и 15N упрощает анализ спектров ЯМР и позволяет картировать интерфейс взаимодействия в комплексах мембранных рецепторов с лигандами

Группа анализа структуры мембранных белков in silico,  Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов,  Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии,  Лаборатория структурной биологии ионных каналов

Комбинаторное введение в молекулы белков стабильных изотопов 13C и 15N позволяет значительно упростить анализ спектров ЯМР. Впервые решена задача и разработан алгоритм CombLabel по расчету схемы комбинаторного введения 13C и 15N меток с минимальной ценой. Применение программы позволило произвести отнесение 50% ЯМР-сигналов основной цепи второго потенциал-чувствительного домена натриевого канала Nav1.4 человека (VSD-II). Токи утечки через мутантные варианты Nav1.4, содержащие замену Arg675Gly в VSD-II, приводят к развитию наследственного заболевания – нормокалемического периодического паралича. Методом ЯМР спектроскопии определен интерфейс взаимодействия VSD-II с токсином Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei, который способен блокировать токи утечки. В модели комплекса VSD-II/Hm-3, построенной на основании данных ЯМР, токсин связывается с внеклеточной петлей S1-S2, дестабилизируя состояние домена, при котором наблюдаются токи утечки. На примере комплексов токсина Hm-3 с VSD-I и VSD-II канала Nav1.4 показано, что токсины паукообразных могут по-разному взаимодействовать с различными доменами в составе одного натриевого канала.

Яд скорпионов богат пептидными блокаторами потенциал-чувствительных калиевых каналов (KV), и это разнообразие мы отразили в ранее созданной базе данных таких пептидов Kalium. Из яда скорпиона Mesobuthus eupeus получен высокоаффинный и селективный блокатор каналов KV1.2, характерных для центральной нервной системы человека. С применением молекулярного моделирования и сайт-направленного мутагенеза изучен механизм селективного взаимодействия токсина и каналов.

Молекулярный механизм действия ацилполиаминов – блокаторов глутаматных рецепторов

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии

В составе яда пауков и ос находят ацилполиамины – высокоаффинные блокаторы рецепторов глутамата, главного возбуждающего нейромедиатора мозга человека. Под руководством Е.В. Гришина в 1986 г. был описан первый представитель ацилполиаминов – аргиопин из яда паука-кругопряда Argiope lobata. В 2018 г. с использованием метода криоэлектронной микроскопии изучена пространственная структура комплекса аргиопина с глутаматным рецептором. Полученные результаты позволят создать препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний. Исследование удостоено иллюстрации на обложке журнала Neuron. Подробнее в пресс-релизе на сайте ИБХ.

Публикации

  1. Twomey EC, Yelshanskaya MV, Vassilevski AA, Sobolevsky AI (2018). Mechanisms of Channel Block in Calcium-Permeable AMPA Receptors. Neuron 99 (5), 956–968.e4

В лекарственном растении Laurus nobilis обнаружен протон-независимый активатор кислото-чувствительных каналов ASIC3 с необычными фармакологическими свойствами.

Лаборатория биофармацевтики,  Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Целенаправленный поиск новых лигандов к ионным каналам семейства ASIC привел к обнаружению в листьях благородного лавра алкалоида линдолдхамин, который может активировать канал ASIC3 при физиологических значениях pH. Было продемонстрировано, что закисление внеклеточной среды, которое в норме приводит к активации ионного канала, не является необходимым условием для открытия, как человеческой, так и крысиной изоформы ASIC3 канала. Электрофизиологические исследования на гетерологически экспрессированных ионных каналах ASIC3 выявили различия в модуляции активности человеческой и крысиной изоформы линдолдхамином. С помощью различных протоколов было показано, что связывание линдолдхамина с человеческой изоформой ASIC3 канала в закрытом состоянии приводит к 2 кратному росту амплитуды транзиентного тока в ответ на кислотный рН стимул; при этом на крысиную изоформу ASIC3 лиганд не влиял. Протон независимая активация крысиного канала также была существенно ниже по амплитуде регистрируемого тока. В итоге были показаны существенные фармакологические отличия каналов ASIC3 человека и крысы при их взаимодействии с новым алколоидом, что еще раз доказывает неоднозначность возможной интерпретации данных, получаемых в тестировании на животных моделях, при разработке лекарственных средств для людей. Уникальные фармакологические свойства линдолдхамина позволяют позиционировать его как новый инструмент для изучения активности каналов ASIC, и для изучения синаптической пластичности нервной системы в целом, так как решающая роль этих каналов в этом процессе давно доказана. Уникальным свойством нового лиганда является способность конкурировать с протонами, вызывающими десенситизацию транзиентного тока ASIC3 канала, таким образом, что на кривой рН-зависимости десенситизации наблюдается увеличение амплитуды транзиентного тока, а не сдвиг кривой в область более кислых значений. Ни для одного известного лиганда ASIC такой эффект опубликован ранее не был.

Токсин из яда паука-бокохода Heriaeus melloteei может стать основой для создания лекарства от гипокалиемического периодического паралича второго типа, надежного лекарства от всех случаев которого не существует. Причиной заболевания служат мутации гена потенциал-чувствительных натриевых каналов NaV1.4, характерных для скелетных мышц. В результате мутаций эти каналы проводят аберрантные токи, мышцы оказываются неспособны отвечать на сигналы нервной системы, и развивается слабость вплоть до паралича. Токсин Hm-3 оказался способным селективно блокировать такие токи, протекающие через потенциал-чувствительных домен I мутантных каналов. Подробнее в пресс-релизе на сайте ИБХ.

Публикации

  1. Männikkö R, Shenkarev ZO, Thor MG, Berkut AA, Myshkin MY, Paramonov AS, Kulbatskii DS, Kuzmin DA, Castañeda MS, King L, Wilson ER, Lyukmanova EN, Kirpichnikov MP, Schorge S, Bosmans F, Hanna MG, Kullmann DM, Vassilevski AA (2018). Spider toxin inhibits gating pore currents underlying periodic paralysis. Proc Natl Acad Sci U S A 115 (17), 4495–4500

Взаимодействие вольт-сенсорного токсина Hm-3 с потенциал-чувствительным доменом Na+ канала Nav1.4: структурный взгляд на связывание опосредованное мембраной

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов,  Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии,  Лаборатория структурной биологии ионных каналов

Потенциалозависимые Na+ каналы (Nav) играют важнейшую роль в функционировании сердечно-сосудистой, мышечной и нервной систем. Некоторые мутации вызывают токи утечки через потенциал-чувствительные домены (VSD) каналов Nav, которые приводят к различным заболеваниям. Гипокалиемический периодический паралич (HypoPP) 2 типа вызван мутациями в сегментах S4 VSD в канале NaV1.4 скелетных мышц человека. Вольт-сенсорный токсин Hm-3 из яда паук Heriaeus melloteei подавляет токи утечки через такие мутантные каналы. Для изучения механизма взаимодействия Hm-3 и канала NaV1.4 мы сосредоточились на исследовании изолированного домена VSD-I с помощью ЯМР-спектроскопии в среде имитирующей мембрану. Модель комплекса Hm-3/VSD-I была построена методом белок-белкового докинга с использованием ограничений ЯМР. Токсин изначально закрепляется на поверхности мембраны, а затем образует комплекс с петлей S3b-S4 VSD-I. Связывание Hm-3 блокирует движение спирали S4 – датчика-потенциала и индуцирует аллостерические изменения, которые препятствуют появлению токов утечки. Наша работа является первым структурным ЯМР-исследованием взаимодействия между вольт-сенсорными токсинами и каналами Nav.

Публикации

  1. Männikkö R, Shenkarev ZO, Thor MG, Berkut AA, Myshkin MY, Paramonov AS, Kulbatskii DS, Kuzmin DA, Castañeda MS, King L, Wilson ER, Lyukmanova EN, Kirpichnikov MP, Schorge S, Bosmans F, Hanna MG, Kullmann DM, Vassilevski AA (2018). Spider toxin inhibits gating pore currents underlying periodic paralysis. Proc Natl Acad Sci U S A 115 (17), 4495–4500

Авторы: Апарин И.О., Проскурин Г.В., Прохоренко И.А., Коршун В.А. (Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза), Шенкарев З.О. (Группа структурной биологии ионных каналов), Парамонов А.С. (Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии), Рогожин Е.А. (Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов).

Установлена структура двух компонентов липопептидного антибиотика кристалломицина из образца, полученного 60 лет назад. Установлена идентичность компонентов кристалломицина двум компонентам аспартоцина, структура которых была выяснена недавно. Антибиотик проявляет Ca2+-зависимую активность к грам-положительным бактериям. С помощью ЯМР исследованы конформации кристалломицина 2 в растворе.

В составе пептидного антибиотика INA-5812 обнаружена аминокислота 4-хлор-L-кинуренин, ранее встречавшаяся в природных продуктах лишь однажды. Нами впервые описаны флуоресцентные свойства 4-хлор-L-кинуренина и его использование в качестве донора энергии для возбуждения других флуорофоров.

С использованием различных методов 2D ЯМР установлена структура двух новых макролидных антибиотиков, астолидов А и Б. Молекулы астолидов одновременно содержат в качестве агликонов мембрано-активный полиольный макролид и редокс-активный нафтохиноновый остаток. Наличие гидроксильной группы в положении 18 принципиальным образом меняет спектр биологической активности по сравнению с известными аналогами – возрастает противогрибковая активность и снижается цитотоксичность.

Публикации

  1. Alferova VA, Shuvalov MV, Suchkova TA, Proskurin GV, Aparin IO, Rogozhin EA, Novikov RA, Solyev PN, Chistov AA, Ustinov AV, Tyurin AP, Korshun VA (2018). 4-Chloro-l-kynurenine as fluorescent amino acid in natural peptides. Amino Acids 50 (12), 1697–1705
  2. Alferova VA, Novikov RA, Bychkova OP, Rogozhin EA, Shuvalov MV, Prokhorenko IA, Sadykova VS, Kulko AB, Dezhenkova LG, Stepashkina EA, Efremov MA, Sineva ON, Kudryakova GK, Peregudov AS, Solyev PN, Tkachev YV, Fedorova GB, Terekhova LP, Tyurin AP, Trenin AS, Korshun VA (2018). Astolides A and B, antifungal and cytotoxic naphthoquinone-derived polyol macrolactones from Streptomyces hygroscopicus. Tetrahedron 74 (52), 7442–7449
  3. Jiang ZK, Tuo L, Huang DL, Osterman IA, Tyurin AP, Liu SW, Lukyanov DA, Sergiev PV, Dontsova OA, Korshun VA, Li FN, Sun CH (2018). Diversity, novelty, and antimicrobial activity of endophytic actinobacteria from mangrove plants in Beilun Estuary National Nature Reserve of Guangxi, China. Front Microbiol 9 (MAY), 868
  4. Tyurin AP, Alferova VA, Paramonov AS, Shuvalov MV, Malanicheva IA, Grammatikova NE, Solyev PN, Liu S, Sun C, Prokhorenko IA, Efimenko TA, Terekhova LP, Efremenkova OV, Shenkarev ZO, Korshun VA (2018). Crystallomycin revisited after 60 years: Aspartocins B and C. Medchemcomm 9 (4), 667–675

А.В. Феофанов (Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул), О.В. Некрасова, К.С. Кудряшова (Отдел биоинженерии, группа нанобиоинженерии), А.А. Василевский, А.И. Кузьменков, А.М. Гиголаев (Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии), А.О. Чугунов, В.М. Табакмахер, Р. Г. Ефремов (Группа анализа структуры мембранных белков in silico, Лаборатория моделирования биомолекулярных систем).

Исследован уникальный высокоаффинный и высокоселективный пептидный блокатор канала Kv1.2 - MeKTx11-1 из яда скорпиона Mesobuthus eupeus. Пептид MeKTx11-1 и его мутантные аналоги были получены в рекомбинантной форме, их рецептор-связывающая активность изучена на панели Kv1-каналов. Проведено молекулярное моделирование взаимодействия этих пептидов с каналом Kv1.2, установлены ключевые структурные детерминанты этого взаимодействия. Пептид MeKTx11-1 является новым эффективным молекулярным инструментом для нейробиологии, позволяющим идентифицировать и изучать активность канала Kv1.2 в присутствии различных изоформ Kv1-каналов.

В сотрудничестве с S.Peigneur, J.Tytgat из University of Leuven, Бельгия и А.Ф. Фрадковым из ООО Евроген.

Оксана В. Некрасова, К.С. Кудряшова (Отдел биоинженерии, группа нанобиоинженерии), А.А. Василевский, А.И. Кузьменков, А.М. Гиголаев (Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии), А.О. Чугунов, В.М. Табакмахер, Р. Г. Ефремов (Группа анализа структуры мембранных белков in silico, Лаборатория моделирования биомолекулярных систем), А.В. Феофанов (Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул).

Исследован уникальный высокоаффинный и высокоселективный пептидный блокатор канала Kv1.2 - MeKTx11-1 из яда скорпиона Mesobuthus eupeus. Пептид MeKTx11-1 и его мутантные аналоги были получены в рекомбинантной форме, их рецептор-связывающая активность изучена на панели Kv1-каналов. Проведено молекулярное моделирование взаимодействия этих пептидов с каналом Kv1.2, установлены ключевые структурные детерминанты этого взаимодействия. Пептид MeKTx11-1 является новым эффективным молекулярным инструментом для нейробиологии, позволяющим идентифицировать и изучать активность канала Kv1.2 в присутствии различных изоформ Kv1-каналов.

В сотрудничестве с S.Peigneur, J.Tytgat из University of Leuven, Бельгия и А.Ф. Фрадков из ООО Евроген.

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии систематически изучает яды членистоногих, выделяя из них пептиды, специфично и с высокой активностью модулирующие активность разнообразных ионных каналов. Яд скорпионов особенно богат пептидными поровыми блокаторами потенциал-чувствительных калиевых каналов (Kv), и это разнообразие мы отразили в ранее созданной базе данных таких пептидов Kalium.

В сотрудничестве с Лабораторией оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул и Группой нанобиоинженерии с применением разработанной ранее уникальной системы скрининга из яда скорпиона Mesobuthus eupeus был выделен пептидный блокатор канала Kv1.2 MeKTx11-1, связывающийся с высокой аффинностью (IC50 ≈0,2 нМ) и специфичностью (эффект на каналах Kv1.1, 1.3 и 1.6 проявляется в концентрациях в сотни раз выше). Этот пептид отличается всего двумя остатками от родственного MeKTx11-3, обладающего существенно меньшей селективностью в отношении Kv1.2.

В Группе анализа структуры мембранных белков in silico провели молекулярное моделирование взаимодействия этих двух пептидов с каналом Kv1.2, помещенным в явно заданную бислойную липидную мембрану, и объяснили механизм селективного действия MeKTx11-1. Выработанная методика анализа позволит создавать новые селективные лиганды Kv и других каналов, востребованные как в качестве молекулярных инструментов для изучения нервной системы, так и для медицины.

Синтетический фрагмент рецептора конечных продуктов гликозолирования предотвращает потерю памяти и защищает нейроны мозга у животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера.

Лаборатория синтетических вакцин

Установлена взаимосвязь между способностью пептидных фрагментов рецептора конечных продуктов гликозилирования предотвращать потерю памяти у животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера при интраназальном введении, при иммунизации и их способностью предотвращать гибель нейронов мозга и  снижать уровень мозгового бета-амилоида. С помощью флуоресцентного производного активного пептида показано, что при интраназальном введении животным пептид проникает в мозг и солокализуется с бета-амилоидными бляшками. Установлено, что одной из молекулярных мишеней пептида является бета-амилоид. Эти данные являются основой для разработки новых средств терапии болезни Альцгеймера

Открыты первые пептидные лиганды, потенцирующие ответ TRPA1 рецепторов на агонисты, проявляющие обезболивающий и противовоспалительный эффекты.

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий,  Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Из морских анемон видов Metridium senile и Urticina eques выделены и охарактеризованы анальгетические пептиды Мs9а-1 и Ueq 12-1. Пептид Мs9а-1 содержит 35 аминокислотных остатков, а его пространственная структура стабилизирована двумя дисульфидными мостиками подобно ранее описанным  пептидам из морских анемон. Ueq 12-1 состоит из 45 аминокислотных остатков, включая 10 остатков цистеина с необычным распределением, образующих 5 дисульфидных связей, и является уникальным среди многообразия известных пептидов морских анемон. Являясь по сути принципиально новой обнаруженной пространственной структурой, пространственная укладка части полипептидной цепи молекулы Ueq 12-1 похожа на альфа дефензины млекопитающих. Возможно, именно поэтому пептид также обладает слабым антимикробным действием на грамм-положительные бактерии. Структурно непохожие друг не друга пептиды Мs9а-1 и Ueq 12-1 имеют схожий механизм действия и одну биологическую мишень. В тестах in vitro на ооцитах лягушки Xenopus laevis и клетках млекопитающих, экспрессирующих рецептор TRPA1, оба пептида усиливали действие прямых агонистов, таких как AITC и диклофенак. В тестах in vivo на мышах введение пептидов внутривенно давало значительный анальгетический и противовоспалительный эффект, при этом сами пептиды при введении не вызывали ни болевых ощущений ни тепловую гиперчувствительность. Обнаруженные эффекты пептидов связаны с тем, что при взаимодействии с TRPA1 пептиды делают рецептор более восприимчивым к распознаванию своих агонистов (потенцирующее действие), таким образом, при появлении эндогенных раздражителей, таких как, например, медиаторы воспаления, происходит десенситизация TRPA1-экспрессирующих нейронов. Способность этих веществ избирательно усиливать активность белка TRPA1 открывает новые возможности фундаментальных исследований и служит основой создания лекарств от боли и воспаления.

Установлен разнонаправленный механизм действия пептидных модуляторов TRPV1 рецептора в различных условиях активации рецептора.

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Изучено действие полипептидов APHC1, APHC2 и APHC3, ранее выделенных из морской анемоны Heteractis crispa, на рецепторы rTRPV1, экспрессированные в клетках CHO, с использованием методов электрофизиологии, флуоресцентной спектроскопии и молекулярного моделирования. Установлено, что APHCs потенцируют ответ TRPV1, вызванный низкими (3-300 нМ) концентрациями специфичного агониcта — капсаицина, и ингибируют ответы при высоких (>3.0 мкМ) концентрациях активатора. Были также найдены зависимости действия пептидов на TRPV1 при варьировании активаторов, таких как: 2APB и протоны, и на комбинированные активационные стимулы. В итоге, был установлен бимодальный механизм действия APHCs, зависящий от силы активируюшего стимула, — потенцирование малоамплитудных ответов рецептора и отсутствие эффекта/ингибирование высокоамплитудных ответов. Предложена двойная «шлюзовая» модель активации TRPV1, которая предполагает, что APHC-полипептиды могут стабилизировать промежуточное состояние во время активации рецептора. Методом молекулярного моделирования установлен предполагаемый сайт связывания пептидов между парами внешних P-петель TRPV1.

Модуляторы с дуалистическим эффектом могут иметь определенное преимущество с точки зрения их практического медицинского применения, такие соединения не тормозят нормальную работу рецептора, однако, в случае патологически сильной активации производят желаемый терапевтический эффект.

Публикации

  1. Nikolaev MV, Dorofeeva NA, Komarova MS, Korolkova YV, Andreev YA, Mosharova IV, Grishin EV, Tikhonov DB, Kozlov SA (2017). TRPV1 activation power can switch an action mode for its polypeptide ligands. PLoS One 12 (5), e0177077

Впервые охарактеризованы эндогенные лиганды рецептора ASIC3, способные активировать канал без участия протонов, а также выводить ASIC3 человека из состояния десенситизации при физиологических значениях pH.

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Найдены первые активаторы кислото-чувствительных каналов ASIC, обладающие уникальным, ранее не описанным механизмом действия. Изохинолиновые алкалоиды (THP, ретикулин), которые синтезируются клетками млекопитающих как промежуточные продукты в цикле синтеза эндогенного морфина из тирозина, в милимолярных концентрациях способны возвращать канал ASIC3 из протон-опосредованной десенсибилизации, и одновременно эффективно активировать hASIC3 и rASIC3 при физиологическом рН 7.4 и слабо щелочных условиях. До настоящего момента был описан очень ограниченный набор активаторов ASICs, при чем описанные агонисты главным образом сдвигают активационную способность каналов в область более высоких значений рН, делая рецепторы более чувствительными к меньшим скачкам рН, при этом вклад протонов в процесс открытия каналов рассматривался как основной. Охарактеризованные и зохинолиновые алкалоиды — первые «непротонные» активаторы ASIC3 рецепторов.

При фармакологической характеристике «непротонных» активаторов на изоформы ASIC3 человека и грызунов было выявлено сильное функциональное различие в действии на каналы крысы (незначительный эффект) и человека (сильная потенциация ответа на закисление), что поставило под вопрос эффективность действия известных лигандов, охарактеризованных на животных моделях, при переносе их в клинические исследования.

Также, был сформулирован новый подход к разработке принципиально новых анальгетиков. Найденные лиганд-опосредованные взаимодействия двух систем: ноцицепции (ASIC3) и анти-ноцицепции (опиоидные рецепторы), по нашему мнению, могут находиться во взаимно сбалансированном состоянии, так что ингибирование или активация ферментов в каскаде биосинтеза эндогенного морфина может сдвигать равновесие в ту или иную сторону, приводя к анальгезии или гиперальгезии.

Каналы ASIC играют важную роль не только в ноцицепции, но и в передаче нервного возбуждения, синаптической пластичности, процессах обучения и гибели нейронов. Открытие эндогенных «непротонных» активаторов доказывает существование нескольких путей регуляции этих каналов. Пока не понятно, который из них может в большей степени быть реализован в ЦНС, не исключено, что закисление внеклеточной среды — неосновной путь регуляции. Ответ на этот вопрос будет получен при изучении найденных нами лигандов в модельных экспериментах.

В яде многих пауков обнаружены двудоменные токсины, объединяющие в своей структуре модули, похожие на «простые» однодоменные токсины. Мы провели детальное структурное исследование тех токсинов, что состоят из дисульфид-богатых (похожих на обычные нейротоксины) и линейных (похожих на обычные цитотоксины) модулей. Линейные модули могут служить для ассоциации двудоменных токсинов с мембранами вследствие формирования амфифильных спиралей, характерных для мембрано-активных пептидов. Предложен механизм действия двудоменных токсинов по типу «мембранного доступа» (membrane access): линейные модули взаимодействуют с липидным бислоем, а дисульфид-богатые – с белковым рецептором.

Биомолекулярные инструменты для визуализации ионных каналов

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии

Мы создали высокоаффинные химерные молекулы на основе флуоресцентных белков и токсинов скорпионов, селективно воздействующих на потенциал-чувствительные калиевые каналы человека. Мы также продемонстрировали возможности использования таких химер в нейробиологии для визуализации ионных каналов: изучения их локализации, профиля экспрессии в клетках, тканях и органах. Кроме того, представляется возможным использование новых инструментов для скрининговых технологий и диагностики целого ряда заболеваний.

Создана база данных пептидных токсинов из яда скорпионов – Kalium

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии

Была создана исчерпывающая база данных токсинов скорпионов, действующих на калиевые каналы (KTx), получившая название Kalium.

Kalium имеет открытый доступ и соответствующие ссылки на другие базы данных, такие как UniProt, PDB и NCBI Taxonomy Browser. Основной особенностью Kalium является простота представленных данных в соответствии с актуальной классификацией KTx. Все данные показаны в виде одной таблицы с возможностью сортировки и фильтрации по разным параметрам. Для каждой молекулы в составе Kalium были учтены все посттрансляционные модификации и рассчитаны молекулярные массы. Было проанализировано порядка 300 публикаций, из которых были взяты экспериментальные данные по физиологической активности KTx. Актуальная информация сопровождается ссылкой на соответствующую статью.

Эта инициатива получила широкое одобрение сообщества, в качестве экспертов Kalium выступили ведущие мировые ученые, занимающиеся исследованием животных ядов. Подробнее читай в пресс-релизе на сайте ИБХ.

На примере одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) впервые показано наличие у растений антимикробного пептида из группы гликопептидов, богатого остатками пролина/гидроксипролина

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Комбинацией методов автоматического N-концевого секвенирования по Эдману, аминокислотного анализа и нисходящей тандемной масс-спектрометрии определена полная аминокислотная последовательность нового узко специфичного антимикробного пролин/гидроксипролин-богатого, не содержащего остатков цистеина гликопептида, выделенного из цветков одуванчика лекарственного (T. officinale). Установлено наличие гликозилирования данной молекулы пентозами исключительно по остаткам гидроксипролина. Определение спектров кругового дихроизма позволило установить формирование пространственной организации данного гликопептида преимущественно в виде полипролиновой спирали. Высокая специфичность действия нового гликополипептида определяется ингибированием грибов-микромицетов с пигментированной (меланизированной) клеточной стенкой, что может обуславливать механизм его молекулярного действия. При этом экспериментально установлено, что тотальное дегликозилирование не приводит в существенному снижению его антимикробной активности на уровне показателя ИК50. Выделенная молекула является первым примером наличия у растений так называемых потенциальных "гликопептидных антибиотиков" - компонентов врожденной иммунной системы.

Разработка интегрального транскриптомного и протеомного подхода для поиска блокаторов калиевых каналов в яде животных

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии

Разработан оригинальный подход поиска новых лигандов калиевых каналов, объединяющий биоинженерную клеточную тест-систему и транскриптомный и протеомный анализ яда животных. С применением этого подхода из яда скорпиона Mesobuthus eupeus были получены восемь высокоаффинных пептидных блокаторов потенциал-зависимого калиевого канала Kv1.1, включая пять новых пептидов. Предложенный подход является универсальным и эффективным инструментом для направленного поиска блокаторов калиевых каналов в природных ядах.

Параллельная эволюция токсинов-модуляторов натриевых каналов у мигаломорфных и аранеоморфных пауков

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии

Мы провели детальное структурное и функциональное исследование токсина Hm-3 из яда аранеоморфного паука Heriaeus melloteei. Структура токсина была исследована с помощью ЯМР-спектроскопии, а активность – с помощью электрофизиологии. Оказалось, что подобно многим токсинам мигаломорфных пауков, Hm-3 формирует мотив «цистинового узла», обладает амфифильной структурой, способен связываться с мембранами и ингибирует активацию потенциал-чувствительных натриевых каналов, по-видимому, по механизму «мембранного доступа». Гидрофобные «хребты» на поверхности молекул Hm-3 и токсинов мигаломорфных пауков однако расположены с противоположных сторон. Мы предполагаем параллельную эволюцию ингибиторов активации натриевых каналов у мигаломорфных и аранеоморфных пауков.

Из яда паука Tibellus oblongus выделен и охарактеризован новый инсекто-специфичный токсин, обладающий «динамическим эпитопом».

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Новый дисульфид-содержащий полипептидный токсин с мотивом пространственной укладки ICK был обнаружен в яде паука Tibellus oblongus. Методами электрофизиологии для нового полипептида была определена биологическая мишень - пресинаптический Са-канал несекомых. Токсин не действовал на препараты из млекопитающих и позвоночных, поэтому получил название ω-Тbo-IT1. ЛД50  нового инсектотоксина составило 11.7 мкг/г на личинках домашней мухи Musca domestica и 20 мкг/г на ювенильный особях тараканов Gromphadorhina portentosa. Методами электрофизиологии было показано обратимое концентрационно-зависимое ингибирование ω-Тbo-IT1 вызванных возбуждающих постсинаптических токов в нейромышечных препаратах мясной мухи Calliphora vicina  (IC50=40±10 нм и коэффициентом Хилла 3.4±0.3) и отсутствие эффекта пептида на спонтанные токи. Анализ пространственной структуры рекомбинантного ω-Тbo-IT1 методом ЯМР-спектроскопии в водном растворе показал, что токсин состоит из нескольких β-шпилечных петель. Две такие петли - длинная и короткая - в водном растворе способны совершать взаимные колебания, которые мы назвали “scissors-like mutual motions”. Такая обнаруженная пластичность молекулы («динамический эпитоп») может играть решающую роль в связывании/распознавании рецептора.

Публикации

  1. Mikov AN, Fedorova IM, Potapieva NN, Maleeva EE, Andreev YA, Zaitsev AV, Kim KK, Bocharov EV, Bozin TN, Altukhov DA, Lipkin AV, Kozlov SA, Tikhonov DB, Grishin EV (2015). ω-Tbo-IT1-New Inhibitor of Insect Calcium Channels Isolated from Spider Venom. Sci Rep 5, 17232

Предложен удобный «минималистичный» структурный каркас для «скаффолд-инженерии» – проектирования белков с заданной функцией

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии

Белковые структуры (типы укладки) различаются по размерам и сложности и, следовательно, по удобству их использования в биоинженерии. Для открытого нами семейства защитных пептидов растений, называемых α-гарпининами, характерна простая укладка. Она состоит из двух коротких α-спиралей, скрепленных двумя дисульфидными мостиками. Подобная структура характерна для некоторых токсинов моллюсков-конусов и скорпионов – ингибиторов калиевых каналов. Мы пересадили функционально важные аминокислотные остатки из токсина в защитный пептид и получили химерную молекулу, полностью воспроизводящую функции токсина. α-Гарпининовая укладка представляется простым и удобным структурным мотивом для белковой инженерии и может быть использована для рационального дизайна лекарственных средств.

Публикации

  1. Berkut AA, Usmanova DR, Peigneur S, Oparin PB, Mineev KS, Odintsova TI, Tytgat J, Arseniev AS, Grishin EV, Vassilevski AA (2014). Structural similarity between defense peptide from wheat and scorpion neurotoxin permits rational functional design. J Biol Chem 289 (20), 14331–14340