Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) - распространенный патоген человека, который очень часто ассоциируется с устойчивостью к антибиотикам. Уничтожение этого часто встречаемого инфекционного агента особенно затруднено из-за чрезмерного образования биопленок и резистентных клеток, которые уклоняются от действия антибактериальных препаратов. Конститутивная гетерологичная продукция высокоспецифичной бактериолитической протеазы лизостафина в дрожжах Pichia pastoris выступает как эффективный агент биоконтроля, в частности убивая S. aureus в сокультуре. Полученный пробиотик S.aureus эффективен в широком диапазоне температур и соотношении мишень-фактор, что указывает на его надежность и универсальность в устранении клеток S. aureus. Дальнейшее биомедицинское применение новых агентов биоконтроля на основе дрожжей требуют оценки на моделях in vivo. Однако мы считаем эту стратегию очень многообещающей, поскольку она обеспечивает безопасные, эффективные и селективные генетически запрограммированные пробиотики и целевые агенты биоконтроля.

Разработан новый подход на основе метода квантовой механики/молекулярной механики (QM/MM) и funnel-метадинамики с использованием возможностей суперкомпьютера для направленного изменения реакционной способности иммуноглобулинов (Ig). Это было достигнуто за счет определения позиций и типа аминокислотных остатков для замены в  каталитическом центре, что позволило обеспечить усиление нуклеофильности атакующего остатка Тирозина 37. Оптимизированный с точки зрения вычислений вариант, L-Leu47Lys, обеспечивает 340-кратное увеличение реакционноспособной полученного мутантного варианта по сравнению с Ig-параоксоназой дикого типа в результате индуцированной субстратом ионизации остатка Тирозина 37. Этот универсальный алгоритм был с успехом использован для объяснения стереоселективности мутантных антител по отношению к Р-хиральному фенилфосфонату. Эти расчеты были подтверждены кинетическими и кристаллографическими методами.

Показано, что амплификация отдельных молекул ДНК, инкапсулированных в огромном количестве капель эмульсии (ePCR), позволяет решить эту проблему. Различные режимы ePCR были экспериментально проанализированы, чтобы определить наиболее совершенные методы амплификации библиотек ДНК. На основе полученных экспериментальных данных была разработана математическая модель, являющаяся основой для рационализации амплификации библиотек с использованием ePCR. Детальное описание ампликонов библиотек ДНК было получено в результате высокопроизводительного секвенирования, подчеркивающего основные преимущества ePCR по сравнению с обычной PCR. ePCR снижает частоту возникновения грубых ошибок в процессе ДНК амплификации и обеспечивает более равномерное распределение амплифицированных последовательностей. Таким образом, благодаря ePCR достигается квазимономолекулярная амплификация, представляющая собой фундаментальное требование при амплификации сложных матриц. Исследователи показали, что ePCR препятствует дегенерации разнообразия и обеспечивает сохранение качества библиотек ДНК.

Исследователи из Лаборатории биокатализа, Лаборатории химии протеолитических ферментов, Лаборатории биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии и Лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ РАН вместе с коллегами из других российских и зарубежных институтов показали, что амплификация отдельных молекул ДНК, инкапсулированных в огромном количестве капель эмульсии (ePCR), позволяет решить эту проблему. Различные режимы ePCR были экспериментально проанализированы, чтобы определить наиболее совершенные методы амплификации библиотек ДНК. На основе полученных экспериментальных данных была разработана математическая модель, являющаяся основой для рационализации амплификации библиотек с использованием ePCR. Детальное описание ампликонов библиотек ДНК было получено в результате высокопроизводительного секвенирования, подчеркивающего основные преимущества ePCR по сравнению с обычной PCR. ePCR снижает частоту возникновения грубых ошибок в процессе ДНК амплификации и обеспечивает более равномерное распределение амплифицированных последовательностей. Таким образом, благодаря ePCR достигается квазимономолекулярная амплификация, представляющая собой фундаментальное требование при амплификации сложных матриц. Исследователи показали, что ePCR препятствует дегенерации разнообразия и обеспечивает сохранение качества библиотек ДНК.

Впервые показана способность рекомбинантной IgA1-протеазы N. meningitidis серогруппы В и созданных нами химерных рекомбинантных белков, состоящих из трёх (I) или двух (II) соединенных между собой фрагментов из различных участков первичной структуры фермента, защищать иммунизированных ими животных от смертельной дозы менингококковых и некоторых пневмококковых штаммов микробов. Снижение уровня бактериемии (число КОЕ, %) зависело от структуры соединения и штамма возбудителя (Рис.1).

Впервые в сыворотках кроликов, иммунизированных инактивированными микробными клетками S. pneumoniae различных серотипов, были обнаружены антитела к IgA1-протеазе N. meningitidis и белкам I и II (Рис.2). На модели пассивной защиты животных было показано, что сыворотки этих кроликов способны защищать животных от заражения менингококками серогруппы В, что свидетельствует о возможности возникновения перекрестного иммунитета при пневмококковой и менингококковой инфекциях (Рис. 3).

Полученные данные позволяют заключить, что на основе белков I и II может быть создана монокомпонентная поливалентная вакцина для профилактики заболеваний, вызванных бактериями, общим фактором вирулентности которых является IgA1 протеаза: N. meningitidis, N. gonorrhoeae, H. influenzae, S. pneumoniae, S. sanguis, S. oralis и др.

В практике мирового здравоохранения аналогов такой вакцины не существует.

Сравнительный анализ первичных и вторичных структур N-концевых областей АТР-зависимых Lon-протеаз, молекулярных шаперонов ClpC и ClpE, а также АТР-независимых протеаз LonC позволил охарактеризовать положение подсемейства LonA в классификации ферментов системы контроля качества клеточных белков.

На основании 3D-структур протозойных олигопептидаз В (ОрdB) из Leischmania major и Trypanosoma bruceiвыполнено моделирование трехмерной структуры олигопептидазы В. Предположен механизм переходабактериальных ОрdB из неактивной - открытой конформации в активную – закрытую.

Рекомбинантный катепсин L с 3 Flag и С-myc эпитопами на С-конце белка (rec-С-Cat L) получен в клетках E. coliRosetta гл. образом в виде телец включения. Белок проявляет протеолитическую (желатин) и пептидолитическую (хромогенный субстрат Z-Ala-Phe-Arg-pNa) активности.

Роль IgA1 протеаз в пневмококковой инфекции

Анализ аминокислотной последовательности IgA1 протеаз некоторых штаммов пневмококкока (Streptococcus pneumoniae) и IgA1 протеазы менингококка (N. meningitidis ) показал их высокую идентичность.

В эксперименте кроликов линии Шиншилла инфицировали сублетальной дозой пневмококков различных штаммов (3, 14, 6А, 19А, 19F, 23F, 18C, 9N, 6В, 9V, 15B, 7F). Титрование сывороток иммунизированных кроликов методом ИФА показало в большинстве из них наличие суммарных антител к IgA1 протеазе менингококка с величиной титра от 1:3000 до 1:50000. Полученные данные дают основание предположить возможность использования последней в качестве препарата для защиты от пневмококковой инфекции.