Лаборатория химии протеолитических ферментов

Отдел пептидно-белковых технологий

Руководитель: Смирнов Иван Витальевич, д. х. н.
smirnov@ibch.ru+7(926)7397865

enz.siobc.ras.ru/

протеолиз, активные центры, механизм действия, пространственная структура, ААА+-белки, биотехнология

Лаборатория химии протеолитических ферментов, возглавлявшаяся чл.-корр. РАН В. К. Антоновым, была образована в 1967 году, выделившись из Лаборатории химии антибиотиков, возглавлявшейся академиком М. М. Шемякиным. С 1992 года лабораторией заведует проф. Л. Д. Румш.

В настоящее время лаборатория занимается исследованием структурно-функциональных особенностей функционирования Lon-протеиназы, исследованием регуляторных функций энтеропептидазы и дуоденазы в отношении рецепторов, активируемых протеиназами (PAR), а также выделением и исследованием протеиназ экстремофильных организмов.

Лаборатория активно участвует в научной и педагогической деятельности — подготовлено и защищено три докторских и более 50 кандидатских диссертаций, под руководством сотрудников лаборатории выполнено большое количество студенческих дипломных работ. Лаборатория является организатором постоянно действующего межинститутского семинара «Проблемы и перспективы исследования протеолитических ферментов», а также регулярно организует проведение Всероссийских симпозиумов «Химия протеолитических ферментов».

Основным направлением работ лаборатории является исследование протеиназ, выполняющих регуляторные функции в системах внутриклеточного протеолиза (АТР-зависимые Lon-протеиназы) и процессинга белков (энтеропептидаза, дуоденаза). Кроме того, объектами изучения служат экстремофильные протеиназы, а также протеиназы, являющиеся ключевыми при развитии особо опасных и социально значимых инфекций, вызываемых такими патогенами как Plasmodium falciparum и ВИЧ. Научная деятельность лаборатории направлена не только на решение фундаментальных проблем современной энзимологии (выяснение природы избирательности протеиназ в процессе узнавания белков-мишеней и путей реализации их специфичности, установление механизма функционирования некоторых протеиназ), но и на решение прикладных задач (выделение и изучение протеиназ, применяющихся в биотехнологии и в медицине, поиск ингибиторов ряда протеиназ).

Для изучения механизма каталитического акта при функционировании протеолитических ферментов используется метод теоретического конформационного анализа. В лаборатории разработан подход, позволяющий различать механизмы действия пептидгидролаз – общий основной и ковалентный катализ – путем использования тяжелокислородной воды как среды реакции и предложена классификация пептидгидролаз, основанная на различиях в механизмах их действия.

Проводится исследование АТР-зависимых Lon-протеиназ, относящихся к суперсемейству ААА+-белков и играющих ключевую роль в обеспечении сохранности клеточного протеома.

Установлено, что протеолитические активные центры Lon-протеиназ представлены каталитической диадой Ser-Lys, при этом семейство Lon состоит из двух подсемейств (А и В), различающихся окружением каталитических остатков активных центров, структурной организацией АТР-азных доменов и общей архитектурой молекулы. Сравнительное исследование протеиназ LonA из Escherichia coli (ЕcLonА) и LonB из Archaeoglobus fulgidus (AfLonВ) выявило важность четвертичной структуры для реализации процессивного механизма протеолиза.

Рентгеноструктурным анализом показано, что протеолитические домены ЕcLonА и AfLonВ обладают уникальным типом пространственной структуры и образуют в кристалле циклические гексамеры. Мономерный N-концевой субдомен ЕcLonА также имеет уникальную укладку, в то время как структура альфа-спирализованного домена фермента типична для ААА+-белков. Полученные результаты послужили основанием для выведения семейства Lon-протеиназ в индивидуальный клан SJ в базе данных пептидгидролаз MEROPS.

Рис. 1. Пространственные структуры фрагментов LonA-протеиназы из E. coli. А — N-концевой субдомен (остатки (1—119));B — α-спирализованный домен (остатки (491—584));C — протеолитический домен (остатки (585—784)).

В процессе исследования сериновых протеиназ желудочно-кишечного тракта выделен и охарактеризован новый фермент — дуоденаза. Установлена первичная и пространственная структура дуоденазы; обнаружена двойственная (трипсино- и химотрипсиноподобная) специфичность фермента. Показано, что уникальные свойства энтеропептидазы тонкого кишечника, обладающей абсолютной специфичностью, обусловлены сложной доменной организацией при наличии строгой иерархии первичного и двух вторичных субстрат-связывающих центров, один из которых обеспечивает высокую специфичность, а другой — высокую эффективность катализа.

Получены данные, свидетельствующие в пользу того, что дуоденаза может являться специфическим активатором проэнтеропептидазы, т. е. играть ключевую роль в инициации каскада активации протеолитических ферментов пищеварительного тракта. Кроме того, обнаружено, что энтеропептидаза и дуоденаза обладают также регуляторной функцией по отношению к рецепторам семейства PAR.

Впервые получена протеиназа Ulysses (гомологичная протеиназе HIV—1), ген которой был обнаружен в мобильном генетическом элементе Drosophila virilis. Исследованы энзимологические свойства и подтверждена функциональная активность фермента. Методом гомологичного моделирования и молекулярной динамики построена пространственная модель протеиназы Ulysses.

Рис. 2. Пространственная структура дуоденазы.

Для аспартатной протеиназы плазмепсин II из малярийного паразита Plasmodium falciparum получены высокоаффинные и специфические ингибиторы.

Ф.И.О.ДолжностьКонтакты
Смирнов Иван Витальевич, д. х. н.зав. лаб.smirnov@ibch.ru+7(926)7397865
Румш Лев Давыдович, д. х. н., профессорг.н.с.lrumsh@mail.ru+7(495)336-28-11
Ротанова Татьяна Васильевна, д. х. н.в.н.с.tatyana.rotanova@ibch.ru+7(495)335-42-22
Зинченко Алексей Алексеевич, к. х. н.с.н.с.alezina@mail.ru
Котельникова Ольга Викторовна, к. б. н.с.н.с.+7(495)3353322
Михайлова Анна Григорьевна, к. х. н.с.н.с.anna.mikhailova@ibch.ru+7(495)335-42-22
Андрианова Анна Говардовна, к. х. н.н.с.govardovna@mail.ru+7(495)330-63-74
Калиберда Елена Николаевна, к. х. н.н.с.elena.kaliberda@ibch.ru+7(495)330-63-74
Карлинский Давид Михайлович, к. х. н.н.с.karlinskyd@gmail.com
Нокель Елена Адамовнан.с.
Гордеева Елена Анатольевнам.н.с.
Куджаев Арсен Мизамудиновичм.н.с.kudzhaev_arsen@mail.ru+7(926)7117732
Мелихова Татьяна Дмитриевнам.н.с.tdm-63@yandex.ru
Прокопенко Юрий Анатольевичм.н.с.
Попов Михаил Евгеньевич, к. х. н.ст. инж.popovm@gmail.com+7(495)336-28-11
Абрикосова Виктория Александровнаинж.-иссл.

Ранее здесь работали:

Антонов Владимир Константинович, чл.-корр. РАНрук.
Замолодчикова Татьяна Степановна, к. х. н.с.н.с.tatyanazam@yandex.ru
Мельников Эдвард Эдуардович, к. х. н.с.н.с.
Дергоусова Наталья Ивановна, к. х. н.н.с.natd2002@mail.ru
Волков Денис Александрович, к. х. н.м.н.с.volkov.den@gmail.com
Овчинникова Марина Владимировнам.н.с.
Степнов Антон Андреевичм.н.с.
Хайруллин Рафиль Фидаилевич, к. х. н.м.н.с.rfkhairullin@yahoo.com
Данилов Дмитрий Викторовичинженерdenycore@ibch.ru
Пипия София Онисеевнаинженерpipiyasofiya@ibch.ru

Все публикации (показать избранные)

Загружаются...

Смирнов Иван Витальевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. БОН, комн. 520
  • Тел.: +7(495)9955557
  • Эл. почта: smirnov@ibch.ru

Создание агентов биоконтроля Staphylococcus aureus на основе лизостафина

Совместно с: Лаборатория биокатализа,  Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии

Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) - распространенный патоген человека, который очень часто ассоциируется с устойчивостью к антибиотикам. Уничтожение этого часто встречаемого инфекционного агента особенно затруднено из-за чрезмерного образования биопленок и резистентных клеток, которые уклоняются от действия антибактериальных препаратов. Конститутивная гетерологичная продукция высокоспецифичной бактериолитической протеазы лизостафина в дрожжах Pichia pastoris выступает как эффективный агент биоконтроля, в частности убивая S. aureus в сокультуре. Полученный пробиотик S.aureus эффективен в широком диапазоне температур и соотношении мишень-фактор, что указывает на его надежность и универсальность в устранении клеток S. aureus. Дальнейшее биомедицинское применение новых агентов биоконтроля на основе дрожжей требуют оценки на моделях in vivo. Однако мы считаем эту стратегию очень многообещающей, поскольку она обеспечивает безопасные, эффективные и селективные генетически запрограммированные пробиотики и целевые агенты биоконтроля.

С помощью квантово-механического молекулярно-механического (QM/MM) подхода объяснено изменение стереопецифичности антител

Совместно с: Лаборатория биокатализа

Разработан новый подход на основе метода квантовой механики/молекулярной механики (QM/MM) и funnel-метадинамики с использованием возможностей суперкомпьютера для направленного изменения реакционной способности иммуноглобулинов (Ig). Это было достигнуто за счет определения позиций и типа аминокислотных остатков для замены в  каталитическом центре, что позволило обеспечить усиление нуклеофильности атакующего остатка Тирозина 37. Оптимизированный с точки зрения вычислений вариант, L-Leu47Lys, обеспечивает 340-кратное увеличение реакционноспособной полученного мутантного варианта по сравнению с Ig-параоксоназой дикого типа в результате индуцированной субстратом ионизации остатка Тирозина 37. Этот универсальный алгоритм был с успехом использован для объяснения стереоселективности мутантных антител по отношению к Р-хиральному фенилфосфонату. Эти расчеты были подтверждены кинетическими и кристаллографическими методами.

Публикации

  1. Mokrushina YA, Golovin AV, Smirnov IV, Chatziefthimiou SD, Stepanova AV, Bobik TV, Zalevsky AO, Zlobin AS, Konovalov KA, Terekhov SS, Stepanov AV, Pipiya SO, Shamborant OG, Round E, Belogurov AA, Bourenkov G, Makarov AA, Wilmanns M, Xie J, Blackburn GM, Gabibov AG, Lerner RA (2020). Multiscale computation delivers organophosphorus reactivity and stereoselectivity to immunoglobulin scavengers. Proc Natl Acad Sci U S A 117 (37), 22841–22848

Разработана математическая модель, являющаяся основой для рационализации амплификации библиотек с использованием ePCR.

Совместно с: Лаборатория белков гормональной регуляции,  Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии,  Лаборатория биокатализа

Показано, что амплификация отдельных молекул ДНК, инкапсулированных в огромном количестве капель эмульсии (ePCR), позволяет решить эту проблему. Различные режимы ePCR были экспериментально проанализированы, чтобы определить наиболее совершенные методы амплификации библиотек ДНК. На основе полученных экспериментальных данных была разработана математическая модель, являющаяся основой для рационализации амплификации библиотек с использованием ePCR. Детальное описание ампликонов библиотек ДНК было получено в результате высокопроизводительного секвенирования, подчеркивающего основные преимущества ePCR по сравнению с обычной PCR. ePCR снижает частоту возникновения грубых ошибок в процессе ДНК амплификации и обеспечивает более равномерное распределение амплифицированных последовательностей. Таким образом, благодаря ePCR достигается квазимономолекулярная амплификация, представляющая собой фундаментальное требование при амплификации сложных матриц. Исследователи показали, что ePCR препятствует дегенерации разнообразия и обеспечивает сохранение качества библиотек ДНК.

Публикации

  1. Terekhov SS, Eliseev IE, Ovchinnikova LA, Kabilov MR, Prjibelski AD, Tupikin AE, Smirnov IV, Belogurov AA, Severinov KV, Lomakin YA, Altman S, Gabibov AG (2020). Liquid drop of DNA libraries reveals total genome information. Proc Natl Acad Sci U S A 117 (44), 27300–27306

Амплификация ДНК в каплях позволяет глубже раскрыть полную генетическую информацию

Совместно с: Лаборатория биокатализа,  Лаборатория белков гормональной регуляции,  Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии

Исследователи из Лаборатории биокатализа, Лаборатории химии протеолитических ферментов, Лаборатории биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии и Лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ РАН вместе с коллегами из других российских и зарубежных институтов показали, что амплификация отдельных молекул ДНК, инкапсулированных в огромном количестве капель эмульсии (ePCR), позволяет решить эту проблему. Различные режимы ePCR были экспериментально проанализированы, чтобы определить наиболее совершенные методы амплификации библиотек ДНК. На основе полученных экспериментальных данных была разработана математическая модель, являющаяся основой для рационализации амплификации библиотек с использованием ePCR. Детальное описание ампликонов библиотек ДНК было получено в результате высокопроизводительного секвенирования, подчеркивающего основные преимущества ePCR по сравнению с обычной PCR. ePCR снижает частоту возникновения грубых ошибок в процессе ДНК амплификации и обеспечивает более равномерное распределение амплифицированных последовательностей. Таким образом, благодаря ePCR достигается квазимономолекулярная амплификация, представляющая собой фундаментальное требование при амплификации сложных матриц. Исследователи показали, что ePCR препятствует дегенерации разнообразия и обеспечивает сохранение качества библиотек ДНК.

Публикации

  1. Terekhov SS, Eliseev IE, Ovchinnikova LA, Kabilov MR, Prjibelski AD, Tupikin AE, Smirnov IV, Belogurov AA, Severinov KV, Lomakin YA, Altman S, Gabibov AG (2020). Liquid drop of DNA libraries reveals total genome information. Proc Natl Acad Sci U S A 117 (44), 27300–27306

Разработка монокомпонентной поливалентной вакцины для профилактики заболеваний, вызванных бактериями, продуцирующими IgA1 протеазу

Впервые показана способность рекомбинантной IgA1-протеазы N. meningitidis серогруппы В и созданных нами химерных рекомбинантных белков, состоящих из трёх (I) или двух (II) соединенных между собой фрагментов из различных участков первичной структуры фермента, защищать иммунизированных ими животных от смертельной дозы менингококковых и некоторых пневмококковых штаммов микробов. Снижение уровня бактериемии (число КОЕ, %) зависело от структуры соединения и штамма возбудителя (Рис.1).

Впервые в сыворотках кроликов, иммунизированных инактивированными микробными клетками S. pneumoniae различных серотипов, были обнаружены антитела к IgA1-протеазе N. meningitidis и белкам I и II (Рис.2). На модели пассивной защиты животных было показано, что сыворотки этих кроликов способны защищать животных от заражения менингококками серогруппы В, что свидетельствует о возможности возникновения перекрестного иммунитета при пневмококковой и менингококковой инфекциях (Рис. 3).

Полученные данные позволяют заключить, что на основе белков I и II может быть создана монокомпонентная поливалентная вакцина для профилактики заболеваний, вызванных бактериями, общим фактором вирулентности которых является IgA1 протеаза: N. meningitidis, N. gonorrhoeae, H. influenzae, S. pneumoniae, S. sanguis, S. oralis и др.

В практике мирового здравоохранения аналогов такой вакцины не существует.

Достижения лаборатории химии протеолитических ферментов за 2015 год

Сравнительный анализ первичных и вторичных структур N-концевых областей АТР-зависимых Lon-протеаз, молекулярных шаперонов ClpC и ClpE, а также АТР-независимых протеаз LonC позволил охарактеризовать положение подсемейства LonA в классификации ферментов системы контроля качества клеточных белков.

 

На основании 3D-структур протозойных олигопептидаз В (ОрdB) из Leischmania major и Trypanosoma bruceiвыполнено моделирование трехмерной структуры олигопептидазы В. Предположен механизм переходабактериальных ОрdB из неактивной - открытой конформации в активную – закрытую.


Рекомбинантный катепсин L с 3 Flag и С-myc эпитопами на С-конце белка (rec-С-Cat L) получен в клетках E. coliRosetta гл. образом в виде телец включения. Белок проявляет протеолитическую (желатин) и пептидолитическую (хромогенный субстрат Z-Ala-Phe-Arg-pNa) активности.

 

Роль IgA1 протеаз в пневмококковой инфекции

Анализ аминокислотной последовательности IgA1 протеаз некоторых штаммов пневмококкока (Streptococcus pneumoniaeи IgA1 протеазы менингококка (N. meningitidis ) показал их высокую идентичность.

В эксперименте кроликов линии Шиншилла инфицировали сублетальной дозой пневмококков различных штаммов (3, 14, 6А, 19А, 19F, 23F, 18C, 9N, 6В, 9V, 15B, 7F). Титрование сывороток иммунизированных кроликов методом ИФА показало в большинстве из них наличие суммарных антител к IgA1 протеазе менингококка с величиной титра от 1:3000 до 1:50000. Полученные данные дают основание предположить возможность использования последней в качестве препарата для защиты от пневмококковой инфекции.