Лаборатория клеточной биологии рецепторов

 сотрудники

 

Лаборатория занимается изучением механизмов функционирования клеточных рецепторов. В настоящее время проводится работа по двум основным направлениям.

Первое связано с исследованием адгезионного нейронального G-белоксопряженного рецептора CIRL. Рецепторы CIRL представляют собой природные гибриды двух классов белков – сигнальных рецепторов и молекул клеточной адгезии. Считается, что эти химерные рецепторы могут быть вовлечены в межклеточные взаимодействия и передачу сигналов, опосредованных G-белками. Однако до сих пор для рецепторов данного семейства не были найдены природные агонисты.

Второе направление связано с исследованием представителя семейства инсулинового рецептора – IRR (insulin receptor-related receptor). К этому семейству принадлежат также инсулиновый рецептор (IR) и рецептор инсулино-подобного фактора роста (IGF-IR). Лигандами рецепторов IR и IGF-IR являются эндогенные пептиды, тогда как для IRR до недавнего времени не удавалось обнаружить лиганд, несмотря на значительные усилия, предпринятые в этом направлении.

Ф.И.О.ДолжностьКонтакты
Петренко Александр Георгиевич, д. х. н.зав. лаб.petrenkoag@gmail.com+7(495)335-41-77
Горященко Александр Сергеевич, к. х. н.н.с.asgoryash@yandex.ru
Можаев Андрей Александрович, к. х. н.н.с.a.a.mozhaev@gmail.com+7(495)3354177
Попова Надежда Викторовна, к. б. н.н.с.popova@ibch.ru+7(495)335-41-77
Серова Оксана Викторовна, к. х. н.н.с.oxana.serova@gmail.com+7(495)335-41-77
Жевленев Егор Сергеевичасп.egor.zhevlenev@gmail.com
Пручковский Дмитрий Анатольевичасп.pruchkovskii@mail.ru
Чачина Наталия Андреевнаасп.Natali.chachina@gmail.com
Ганцова Елена Александровнаинж.-иссл.gantsova@mail.ru
Орса Александр НиколаевичинженерSaniaorsa@mail.ru

Ранее здесь работали:

Деев Игорь Евгеньевич, к. ф.-м. н.с.н.с.deyevie@ibch.ru
Радионов Никита Викторович, к. б. н.н.с.radionov_nikita@mail.ru
Шаяхметова Динара Маратовна, к. б. н.м.н.с.dinara.shayahmetova@gmail.com
Гавриленкова Алина Александровнатех.-лаб.alycat1008@gmail.com
Лакутинова Надежда Николаевнатех.-лаб.
Лакутинова Ольга ст. инж.akutinova@bk.ru

Все публикации (показать избранные)

Загружаются...

Петренко Александр Георгиевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 31, комн. 208
  • Тел.: +7(495)335-41-77
  • Эл. почта: petrenkoag@gmail.com

Выявлена каплевидная форма эктодомена щелочного сенсора ИРР

Совместно с: Группа молекулярной физиологии,  Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии

Используя атомно-силовую микроскопию (AFM), мы исследовали общую конформацию рекомбинантного растворимого эктодомена IRR (ectoIRR) при нейтральном и щелочном pH. В отличие от хорошо известной перевернутой U-образной конформации рецептора инсулина, структурные модели, реконструированные при различных значениях pH, показали, что организация ectoIRR имеет «каплевидную» форму с более коротким расстоянием между доменами фибронектина. При защелачивании внеклеточной среды происходят незначительные конформационные изменения, что говорит о том, что  в активацию ectoIRR вовлечены дополнительные молекулярные механизмы, взаимодействие соседних рецепторных областей, влияние окружающей липидной среды.

Публикации

  1. Shtykova EV, Petoukhov MV, Mozhaev AA, Deyev IE, Dadinova LA, Loshkarev NA, Goryashchenko AS, Bocharov EV, Jeffries CM, Svergun DI, Batishchev OV, Petrenko AG (2019). The dimeric ectodomain of the alkali-sensing insulin receptor-related receptor (ectoIRR) has a drop-like shape. J Biol Chem 294 (47), 17790–17798
  2. Mozhaev AA, Orsa AN, Deyev IE, Shvets VI, Petrenko AG (2019). Optimization of Heterologous Expression of Insulin Receptor-Related Receptor Ectodomain. Dokl Biochem Biophys 485 (1), 101–103

Изучена структуры и функций сенсора щелочи IRR с помощью панели моноклональных антител

Совместно с: Группа молекулярной физиологии,  Лаборатория молекулярной диагностики

-Получены шесть мышиных моноклональных антител против рекомбинантного эктодомена IRR.

-Определены  сайты связывания полученных антител с IRR. 

-Показано, что антитело 4D5 способно активировать IRR при нейтральном значении рН, а антитело 4С2 ингибирует активацию IRR щелочной средой. 

Проведенное исследование является первым описанием объектов белковой природы, способных регулировать активность сиротского рецептора IRR, а также подтверждает, что активация щелочной средой является неотъемлемым свойством этой рецепторной тирозинкиназы.

Созданы генетически кодируемые сенсоры для измерение внеклеточного рН методом FLIM

Совместно с: Группа молекулярной физиологии,  Лаборатория молекулярной тераностики

-На основе ранее описанного рН-сенсора SypHer3s  создан сенсор внеклеточного слабощелочного рН SypHerExtra, представляющий собой SypHer3s с трансмембранным доменом нейрексина-1. 

-Продемонстрировано, что при возбуждении на длине волны 445 нм время жизни флуоресценции сенсоров SypHer3s и SypHerExtra зависит от значения рН.

-Показано, что указанные сенсоры позволяют определять значения внутриклеточного и внеклеточного рН соответственно в диапазоне от рН 6.5 до 9.5 с помощью метода FLIM в различных биологических системах.

Получение и характеристика генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров внеклеточного рН

Совместно с: Лаборатория молекулярной тераностики,  Группа молекулярной физиологии

Флуоресцентные белки в последнее время стали неотъемлемым инструментом для прижизненной визуализации различных процессов, протекающих в живых системах, начиная от отдельных органелл и заканчивая целыми организмами. Они позволяют наблюдать экспрессию белков, их локализацию, а также пригодны для мониторинга биохимических процессов в клетках. Как правило, флуоресцентные белки имеют рН-зависимые спектральные свойства, что позволяет конструировать на их основе генетически кодируемые рН-сенсоры для решения различных биологических задач. В данной работе мы получили набор сенсоров внеклеточного рН на основе белка SypHer3S, имеющего рН чувствительность в диапазоне значений рН от 7.4 до 9.0. Для этого были созданы химерные конструкции SypHer3S с различными трансмембранными доменами мембранных рецепторов, позволяющих направлять данный белок на внешнюю сторону цитоплазматической мембраны. Была охарактеризована их субклеточная локализация и подобран наиболее успешный вариант химерного рН-сенсора для измерения внеклеточного значения рН.

Физиологическая роль рецептора IRR в развитие лягушки Xenopus laevis

Совместно с: Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза,  Группа молекулярной физиологии

Рецептор подобный-рецептору инсулина (IRR), в отличие от своих близких гомологов, рецептор инсулина (IR) и рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR) могут быть активированы слабощелочной внеклеточной средой. В отличие от повсеместно экспрессируемых IR и IGF-IR, IRR обнаруживается в определенных наборах клеток только в некоторых тканях, большинство из которых подвергаются воздействию экстракорпоральных жидкостей с экстремальным pH. Передача сигналов IR и IGF-IR важна для роста и развития в эмбриогенезе рыбок или лягушек. Напротив, роль активации IRR во время эмбриогенеза неизвестна, хотя ооциты лягушки имеют сильную экспрессию IRR. Чтобы решить эту проблему, мы исследовали функцию IRR во время развития Xenopus laevis посредством морфолино-опосредованного селективного нокдауна IRR. Мы продемонстрировали, что ингибирование экспрессии IRR у Xenopus laevis приводит к задержке развития, но этот фенотип может быть восстановлен путем инкубации эмбрионов в щелочной среде. Кроме того, используя последовательность РНК общей РНК, мы показали, что ингибирование IRR резко изменило транскриптом эмбриона и частично восстановилось после обработки щелочью. Мы идентифицировали несколько сотен генов (eomes, frzb, pax6 и др.), экспрессия которых изменяется после нокдауна IRR и восстанавливается под воздействием щелочи. Наши результаты ясно демонстрируют, что IRR играет ранее неизвестную важную роль в эмбриогенезе и росте лягушек.

Исследование внеклеточной части рецептора IRR методом малоугольного рентгеновского рассеяния и атомно-силовой микроскопией

Совместно с: Группа молекулярной физиологии

Активация IRR может быть достигнута за счет увеличения внеклеточного значения рН. Поскольку активация IRR определяется его внеклеточной частью (эктодоменом), очистка и изучение структуры эктодомена IRR (ectoIRR) представляет особый интерес для понимания фундаментальной основы механизма щелочной чувствительности. Эта работа посвящена определению возможных конформационных перестроек в эктодомене IRR, вызванных изменением рН, с использованием малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS). SAXS является особенно полезным инструментом для исследования некристаллизующихся белков, структурной организации многодоменных белков и позволяет моделировать структуру из субъединиц, для которых доступны кристаллические структуры или другие модели составляющих доменов.

Из данных, полученных в экспериментах SAXS, можно сделать вывод, что белок (растворимый IRR-эктодомен) в растворе существует в виде димера, имеющего молекулярную массу, близкую к той, которая рассчитана из аминокислотной последовательности с вкладом гликозилирования, но мы не смогли найти существенные различия в рассеянии рентгеновских лучей между рН 7,0 и рН 9,0

Чтобы получить подробную структурную организацию ectoIRR мы использовали гибридное моделирование с помощью программного обеспечения CORAL. Доступная рентгеновская кристаллическая структура с высоким разрешением эктодомена рецептора инсулина как ближайшего гомолога IRR была разделена на отдельные поддомены. Всего в CORAL смоделированы две полипептидные цепи (димер ectoIRR) и затем выполнен поиск оптимальных положений и ориентации жестких поддоменов. Моделирование дает хорошее соответствие с χ2 = 1.3, что подтверждает, что выбранная схема моделирования с двумя доменами на цепочку была адекватной.

Данные, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM), также хорошо согласуются с результатами структурного анализа SAXS. Эксперименты AFM эктодомена IRR, адсорбированного на поверхности атомарно-плоской слюды, показали структуру, аналогичную структуре, наблюдаемой SAXS, без существенных различий между рН 7,0 и pH 9,0.

Профиль экспрессии генов в почках мышей, нокаутных по гену insrr

Совместно с: Группа молекулярной физиологии

Рецепор, подобный инсулиновому рецептору (insulin receptor-related receptor, IRR), – это «сиротская» рецепторная тирозинкиназа, которая принадлежит к мини-семейству рецептора инсулина, включающему два его гомолога:  рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR) и рецептор инсулина (IR). Биохимический анализ показал, что активация IRR гидроксил-анионом аналогична активации рецептора лигандом и определяется структурой внеклеточного домена IRR. IRR обнаруживается в отдельных популяциях клеток почек, желудка, поджелудочной железы, а также в части симпатических и холинергических нейронов. Наибольшее количество IRR выявлено в почках, где он обнаруживается лишь в бета-вставочных клетках – субпопуляции эпителиальных клеток, выстилающих дистальные канальцы. Для выявления конкретных молекулярных и клеточных механизмов функционирования IRR в почках и с целью выявления роли IRR в регуляции работы почек в живом организме нами был проведен сравнительный анализ транскриптомов из почек мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену insrr. Достоверное изменение (увеличение экспрессии более чем в 1.5 раза в нокаутных животных) было выявлено для транскриптов двух генов hsd3b2 и igf2. Полученные результаты позволяют предположить, что линия IRR-нокаутных мышей может найти применение в качестве животной модели для изучения роли этих генов в почках.

Публикации

  1. Deyev IE, Shayahmetova DM, Zhenilo SV, Radionov NV, Petrenko AG (2018). Profile of Gene Expression in the Kidneys of Mice with the insrr Gene Knockout. Russ. J. Bioorganic Chem. 44 (2), 256–260

Щелочной рН индуцирует IRR-опосредованное фосфорилирование IRS-1 и изменению актинового цитоскелета в линии бета-клеток поджелудочной железы

Совместно с: Группа молекулярной физиологии

Секреция слабощелочного (рН 8,0-8,5) сока в кишечник является одной из ключевых функций поджелудочной железы. Известно, что система поджелудочной железы, содержащая щелочной сок, может соприкасаться с эндокринными клетками островков поджелудочной железы. Ранее мы идентифицировали рецептор IRR, который экспрессируется в островках Лангерганса в качестве сенсора слабощелочного внеклеточного рН. В этом исследовании мы проанализировали влияние щелочной среды на линию бета-клеток поджелудочной железы MIN6. Была обнаружена активация эндогенного IRR, но не рецептора инсулина, которая может быть ингибирована с помощью ингибитора linsitinib. Автофосфорилирование IRR также приводило к фосфорилированию субстрата 1 рецептора инсулина (IRS-1), основного адаптера в сигнальном пути инсулина,  и также блокировалось ингибитором linsitinib. Однако, в отличие от стимуляции инсулина, в результате щелочной обработки не было обнаружено фосфорилирования белка киназы B (Akt / PKB). Мы также наблюдали повышение экспрессии нескольких генов раннего ответа (EGR2, IER2, FOSB, EGR1 и NPAS4) при щелочной обработке клеток MIN6. Щелочная среда, но не инсулин, также вызывала ремоделирование актинового цитоскелета, которое блокировалось предварительной инкубацией с ингибитором linsitinib. Мы предлагаем, чтобы активация IRR щелочью могла быть частью локальной петли сигнализации между экзокринной и эндокринной частями поджелудочной железы.

Сайт-направленный мутагенез в фибронектиновых повторах в рецепторе IRR

Совместно с: Группа молекулярной физиологии

Ранее мы продемонстрировали, что активация IRR определяется его внеклеточной областью, включает в себя несколько доменов и показывает положительную кооперативность с двумя синергетическими сайтами. Теперь мы рассмотрели роль FnIII повторов в рН-чувствительности IRR с помощью анализа точечных мутантов и химер IRR с рецептором инсулина (IR). Мы показали, что первый сайт активации включает в себя неупорядоченный участок (646-716) в домене FnIII-2 на С-конце IRR-альфа-субъединицы вместе с близко расположенными остатками L135, G188, R244, H318, K319 доменов L1 и C второй субъединицы. Второй сайт включает в себя остаток T582 домена FnIII-1 в верхней части пирамиды лямбда-формы IRR вместе с M406, V407, D408 из домена L2 во второй субъединице. Также была оценена возможная важность гликозилирования IRR для его активации. Обычно IRR менее гликозилирован, чем IR и IGF-IR. Замена доменов FnIII-2 и FnIII-3 в IRR на гомологичные домены из IR приводит к сдвигу массы β-субъединицы с 68 кДа для IRR до примерно 100 кДа из-за увеличения гликозилирования и отсутствию рН-чувствительность у этой химеры. Однако мутации четырех аспарагиновых остатков (сайтов гликозилирования в этой химере) приводили к уменьшению гликозилирования химер и к частичному восстановлению рН-чувствительности. Таким образом, мы предполагаем, что обширное гликозилирование FnIII-2 / 3 доменов обеспечивает стерическое препятствие для щелочной активации эктодомена IRR.