Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем

Отдел функционирования живых систем

Руководитель: Аралов Андрей Владимирович, к. х. н.
Baruh238@mail.ru+7(926)6062910

РНК, ДНК, G-квадруплекс, i-мотив, антисмысловые олигонуклеотиды, зонды, pH сенсоры, модификация, флуоресценция

Основные направления исследований группы включают:

  • дизайн и синтез нуклеотидных модификаций для регулирования свойств канонических и неканонических вторичных структур нуклеиновых кислот; 
  • разработку нуклеотидных модификаций, пригодных в антисенс- и RNAi технологиях;
  • синтез и скрининг зондов/лигандов для детекции и изменения физико-химических параметров неканонических вторичных структур нуклеиновых кислот;
  • разработку и исследование свойств олигонуклеотидных модификаций, связывающихся с ионами металлов;
  • исследование физико-химических свойств модификаций, возникающих в живых организмах под воздействием мутагенных факторов окружающей среды;
  • дизайн и синтез противовирусных соединений.

Неканонические структуры ДНК широко применяются для регуляции экспрессии генов, в ДНК нанотехнологии и в разработке сенсоров на основе ДНК. В частности, особое внимание в последнее время уделяется I-мотивам, которые представляют собой два интеркалированных параллельных дуплекса, удерживаемых вместе за счет образования гемипротонированных пар цитозин-цитозин. Поскольку образование данных пар и, соответственно, i-мотивов происходит в достаточно узком диапазоне pH (3.0-6.5), существует необходимость в инструментах, позволяющих осуществлять «тонкую настройку» свойств данных неканонических структур.

Мы осуществили рациональный дизайн новой замещенной феноксазиновой модификации и исследовали ее свойства в составе модельных и геномных последовательностей, способных образовывать i-мотивы. Было показано, что включение данной модификации обеспечивает значительную термическую стабилизацию и также позволяет изменять значение pH перехода, представляющего собой важный параметр, например, при дизайне pH сенсоров и зондов для детекции низкомолекулярных лигандов, катионов и белков. Результаты исследования опубликованы в журнале Nucleic Acids Research (10.1093/nar/gky121).

Все публикации (показать избранные)

Загружаются...

Аралов Андрей Владимирович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 51, комн. 454
  • Тел.: +7(926)6062910
  • Эл. почта: Baruh238@mail.ru

Геномные ДНК i-мотивы в качестве быстрых сенсоров, реагирующих на микроизменения pH вблизи физиологически релевантных значений

Мы разработали простые и надежные сенсоры для измерения внутриклеточного pH на основе ДНК i-мотивов (iMs), обнаруженных в генах, связанных с нейродегенерацией или канцерогенезом. Данные iM, по-видимому, являются геномными регуляторными элементами и могут модулировать транскрипцию в ответ на изменения pH. Учитывая присущую им чувствительность к незначительным изменениям pH в пределах физиологического диапазона, данные неканонические структуры ДНК можно использовать в качестве основного элемента сенсора без дополнительных модулей, за исключением флуоресцентных меток или тушителей. Мы отобрали несколько iM, которые демонстрировали быструю кинетику фолдинга/расплетения. Используя метод остановленного потока и метод FRET-плавления/отжига, мы подтвердили, что скорость зависимых от температуры переходов iM-оцДНК коррелируют со скоростью pH переходов. Таким образом, мы предлагаем анализ гистерезиса на основе FRET в качестве экспресс-метода выбора сенсоров с заданными кинетическими характеристиками. Для лидерного быстродействующего сенсора мы оптимизировали схему мечения и провели внутриклеточную калибровку. В отличие от обычно используемых низкомолекулярных индикаторов pH, данный сенсор эффективно транспортировался на ядра клеток. Благодаря подходящим кинетическим характеристикам сенсор можно использовать для мониторинга динамики протонов в ядре. Наши результаты свидетельствуют о том, что дизайн с применением геномных последовательностей является продуктивным подходом к разработке биосовместимых молекулярных инструментов.

Публикации

  1. Turaev AV, Isaakova EA, Severov VV, Bogomazova AN, Zatsepin TS, Sardushkin MV, Aralov AV, Lagarkova MA, Pozmogova GE, Varizhuk AM (2020). Genomic DNA i-motifs as fast sensors responsive to near-physiological pH microchanges. Biosens Bioelectron , 112864

Феноксазиновый остов для дизайна агентов взаимодействующих с G-квадруплексами

Совместно с: Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий

G-квадруплексы (G4) представляют собой один класс неканонических вторичных структур нуклеиновых кислот, которые в настоящее время рассматриваются как многообещающие и привлекательные мишени для противораковой, противовирусной и антибактериальной терапии. Мы исследовали новый феноксазиновый остов на основе i-Clamp для создания стабилизирующих G4 лигандов. Длина протонированных аминоалкильных линкеров («рукавов») лиганда на основе феноксазина была оптимизирована in silico. Были синтезированы два двухлинкерных лиганда, различающихся взаимной ориентацией линкеров, и один однолинкерный лиганд. Двухлинкерные лиганды значительно увеличивали термическую стабильность G-квадруплексных структур (увеличивали температуру плавления до 20 ° C) и проявляли селективность по отношению к G4 по сравнению с дуплексной ДНК. Лиганды выглядят многообещающими для биологических исследований, и феноксазиновый остов может стать отправной точкой для разработки новых G4-взаимодействующих соединений.

Публикации

  1. Tsvetkov VB, Varizhuk AM, Lizunova SA, Nikolenko TA, Ivanov IA, Severov VV, Belyaev ES, Shitikov EA, Pozmogova GE, Aralov AV (2020). Phenoxazine-based scaffold for designing G4-interacting agents. Org Biomol Chem 18 (31), 6147–6154

Короткий дуплексный модуль, соединенный с G-квадруплексами, увеличивает флуоресценцию синтетических аналогов хромофора GFP

Совместно с: Группа химии гетероциклических соединений

Аптасенсоры стали популярными инструментами в биоаналитической химии и молекулярной биологии. Для повышения специфичности перспективные сигнальные элементы в аптасенсорах можно разделить на G-квадруплексную (G4) часть  и свободный флуоресцентный краситель, который разгорается при связывании с G4 частью. Однако существующие системы ограничены относительно низким усилением флуоресценции при связывании красителя. Мы присоединили дуплексные модули к G4 структурам, что предположительно вызывает образование связывающей краситель полости между двумя модулями. Скрининг множества синтетических аналогов хромофора GFP и вариация дуплексного модуля позволили отобрать красители, которые разгораются после образования комплекса с двухмодульными структурами и их РНК-аналогами до 20 раз по сравнению с G4 без дуплексного модуля. Мы продемонстрировали усиление флуоресценции красителя после связывания с модифицированными структурами TBA, LTR-III и Tel23a G4 и предполагаем, что такая архитектура коротких сигнальных элементов дуплекс-G4 будет способствовать разработке улучшенных аптасенсоров.

Цианиновые красители на основе бензотиазола – флуоресцентные «разгорающиеся» зонды для детекции дуплексов и квадруплексов ДНК

Получены аналоги бензотиазолового оранжевого (БО) с одним, двумя или тремя метилбензотиазолилметилиденовыми заместителями в 1-метилпиридиниевом кольце. Проанализированы параметры флуоресценции известных и новых красителей в комплексах с различными структурами ДНК, включая G-квадруплексы (G4) и i-мотивы (IM). Все красители эффективно различали G4 и оц-ДНК. Би- и тризамещенные производные имели в основном сходные распределения относительных интенсивностей флуоресценции. Монозамещенные производные показали повышенную чувствительность к параллельным G4. Все красители были особенно чувствительны к структуре G4 с дополнительным дуплексным модулем (тромбин-связывающий аптамер TBA31). В частности, БО показал значительное (160-кратное) увеличение квантового выхода флуоресценции в комплексе с TBA31 по сравнению со свободным красителем. Моно/дизамещенные производные показали свою применимость в качестве зондов для отслеживания образования G4.

Публикации

  1. Turaev AV, Tsvetkov VB, Tankevich MV, Smirnov IP, Aralov AV, Pozmogova GE, Varizhuk AM (2019). Benzothiazole-based cyanines as fluorescent “light-up” probes for duplex and quadruplex DNA. Biochimie 162, 216–228

Молекулярные инструменты для стабилизации неканонических вторичных структур нуклеиновых кислот

Разработаны лиганды и модификации нуклеиновых оснований для стабилизации неканонических вторичных структур нуклеиновых кислот.

Публикации

  1. Schönrath I, Tsvetkov VB, Zatsepin TS, Aralov AV, Müller J (2019). Silver(I)-mediated base pairing in parallel-stranded DNA involving the luminescent cytosine analog 1,3-diaza-2-oxophenoxazine. J Biol Inorg Chem 24 (5), 693–702
  2. (книга) Zatsepin TS, Varizhuk AM, Dedkov VG, Shipulin GA, Aralov AV (2019). Oligonucleotide Primers with G8AE-Clamp Modifications for RT-qPCR Detection of the Low-Copy dsRNA. Methods Mol Biol 1973, 281–297
  3. Tsvetkov VB, Zatsepin TS, Turaev AV, Farzan VM, Pozmogova GE, Aralov AV, Varizhuk AM (2019). DNA i-Motifs With Guanidino-i-Clamp Residues: The Counterplay Between Kinetics and Thermodynamics and Implications for the Design of pH Sensors. Comput Struct Biotechnol J 17, 527–536

Новые противовирусные нуклеозидные производные для ингибирования репродукции вируса клещевого энцефалита и вируса варицелла-зостер

Совместно с: Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза

Был получен ряд аналогов эффективного противовирусного периленового нуклеозида, dUY11, с метилтиометильной (МТМ), азидометильной (AZM) и HO-С1-4-алкил-1,2,3-триазол-1,4-диильными группами в 3`-O-положении, а также два продукта реакции безмедного алкин-азидного циклоприсоединения AZM производного, и исследована их активность относительно вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Четыре соединения показали EC50 ≤10 нМ, таким образом, являясь наиболее эффективными ингибиторами ВКЭ на сегодняшний день. Кроме того, эти нуклеозиды обладают большей липофильностью (clogP) и повышенной растворимостью в водном ДМСО по сравнению с исходным dUY11.

Феноксазиновый остов широко используется для стабилизации дуплексов нуклеиновых кислот, как часть флуоресцентных зондов для исследования структуры, узнавания и метаболизма нуклеиновых кислот и т.д. Мы осуществили синтез феноксазиновых нуклеозидных производных и исследовали их противовирусную активность относительно панели структурно разнообразных вирусов: оболочечных ДНК герпесвирусов: вируса варицелла-зостер (ВЗВ) и цитомегаловируса человека; оболочечного РНК вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), а также необолочечных РНК энтеровирусов. Изучаемые соединения эффективно подавляли репродукцию ДНК и РНК вирусов в культуре клеток. 3-(2’-Дезокси-β-D-рибофуранозил)-1,3-диаза-2-оксофеноксазин оказался мощным ингибитором репликации ВЗВ с большей активностью по отношению к штамму дикого типа, по сравнению со штаммом с дефицитом тимидинкиназы (EC50 0,06 и 10 мкМ, соответственно). Данное соединение не проявляло цитотоксичности на всех изучаемых клеточных линиях. Несколько перспективных соединений показали активность относительно ВКЭ (EC50 0.35-0.91 мкМ), но активность сопровождалась выраженной цитотоксичностью. Данные соединения можно рассматривать в качестве отправной точки для дальнейшей оптимизации структуры антигерпесвирусных или антифлавивирусных соединений.

Публикации

  1. Proskurin GV, Orlov AA, Brylev VA, Kozlovskaya LI, Chistov AA, Karganova GG, Palyulin VA, Osolodkin DI, Korshun VA, Aralov AV (2018). 3′-O-Substituted 5-(perylen-3-ylethynyl)-2′-deoxyuridines as tick-borne encephalitis virus reproduction inhibitors. Eur J Med Chem 155, 77–83