Отдел метаболизма и редокс-биологии

Научные исследования отдела метаболизма и редокс-биологии направлены на расшифровку роли ключевых интермедиатов окислительно-восстановительных процессов в физиологии и патологии, и на создании синтетических подходов к управлению свойствами живых систем. Сотрудниками отдела разрабатываются генетически кодируемые сенсоры для биоимиджинга метаболитов в клетке в режиме реального времени; молекулярные инструменты метаболической инженерии, с помощью которых можно направленно изменять уровень ключевых метаболитов в клетке; создаются новые подходы к управлению активностью широкого спектра органов и тканей с целью коррекции различных патологий. С помощью этих методов сотрудники отдела изучают метаболические основы ишемических патологий мозга и диабета 2 типа, роль антиоксидантных систем в адаптации раковых клеток к окислительному стрессу, а также создают молекулярно-оптические системы контроля сердечного ритма и секреции инсулина. К наиболее перспективным направлениям развития отдела относятся:

  • Создание новых биосенсоров ключевых метаболитов на основе флуоресцентных белков, интегрированных в прокариотические белковые сенсорные домены. В настоящее время спектр метаболитов, на которые созданы биосенсоры, по прежнему ограничен.
  • Создание новых инструментов метаболической инженерии на основе прокариотических ферментов, утилизирующих нехарактерные для эукариот субстраты, такие как D-аминокислоты. Будучи помещенными внутрь эукариотической клетки, эти ферменты позволяют контролировать ключевые узлы метаболических сетей и, тем самым, исследовать их роль в нормальном и патологическом функционировании клетки или органа.
  • Оптическое картирование метаболических изменений при ишемии-реперфузии мозга. Подход, разработанный сотрудниками отдела, позволяет наблюдать в режиме реального времени изменения метаболических параметров мозга экспериментальных животных при инсульте с помощью биосенсоров и имплантированных в мозг оптических волокон.
  • Термогенетическая стимуляция активности органов и тканей с помощью термочувствительных ионных каналов семейства TRP и различных средств контролируемой доставки в ткань тепловой энергии (ИК-излучение, сфокусированный ультразвук).

Все публикации (показать избранные)

Белоусов Всеволод Вадимович

Визуализация работы антиоксидантных систем хемогенетическими методами

Лаборатория молекулярных технологий

Пероксид водорода образуется под действием ряда ферментов и выполняет сигнальные функции локально в тех компартментах, в которых образуется. Его диффузия внутри клетки ограничена действием антиоксидантных систем, Это способствует возникновению локально повышенных концентраций АФК, достаточных для осуществления регуляторных функций, при этом не вызывающих повреждений.  На данный момент не был до конца ясен вклад каждой отдельной антиоксидантной системы в этот процесс. Визуализация работы антиоксидантных систем достаточно сложна: ферменты, генерирующие пероксид водорода, имеют свой паттерн локализации, также как и основные члены антиоксидантных систем, при этом оба паттерна малоизучены. 

Для решения этой проблемы в лаборатории Белоусова использовали принципы хемогенетики и синтетической биологии.  Фермент оксидаза Д-аминокислот (ДААО), осуществляющий окислительное дезаминирование Д-аминокислот с образованием пероксида водорода в качестве побочного продукта,  уже с успехом использовался для контролируемой продукции H2O2 в различных типах клеток, а также in vivo. С помощью специального пептидного сигнала этот фермент направляли в клеточное ядро, а чувствительный к пероксиду водорода биосенсор HyPer3  - в матрикс митохондрий. Оба компартмента сохраняли свои позиции в клетке на протяжении времени, достаточного для визуализации градиента пероксида водорода. Данный градиент формировался после активации ДААО добавкой Д-аминокислоты в результате действия антиоксидантных систем, препятствовавших диффузии образующегося H2O2. Далее, используя специфичные ингибиторы, было показано, что ключевую роль в ограничении диффузии пероксида водорода в цитоплазме клеток HeLa Kyoto играет тиоредоксиновый путь. При этом одинаково важны оказываются как тиоредоксинредуктазы в цитоплазме, так и в митохондриях. Созданная система позволяет в будущем изучать вклады антиоксидантных ферментов в формирование локального редокс-баланса в различных типах клеток, а также осуществлять простые скрининги веществ, воздействующих на антиоксидантные системы клеток.

Публикации

  1. Mishina NM, Bogdanova YA, Ermakova YG, Panova AS, Kotova DA, Bilan D, Steinhorn B, Arnér ESJ, Michel T, Belousov V (2019). Which antioxidant system shapes intracellular H2O2 gradients? Antioxid Redox Signal 31 (9), 664–670

Генетически кодируемый индикатор Grx1-roCherry на основе красного флуоресцентного белка для регистрации редокс-статуса пула глутатиона

Лаборатория молекулярных технологий,  Группа метаболических основ патологии

Мы разработали генетически кодируемый биосенсор для регистрации редокс-состояния пула глутатиона (соотношение 2GSH/GSSG) на основе красного флуоресцентного белка mCherry. Структура флуоресцентного белка содержит пару редокс-активных аминокислотных остатков цистеина, которые вовлечены в реакции тиол-дисульфидного обмена внутриклеточных систем. Флуоресцентный сигнал биосенсора отражает редокс-состояние глутатиона в исследуемой системе благодаря спектральному различию окисленной и восстановленной форм белка. Для улучшения кинетических свойств биосенсора в его структуру был добавлен человеческий глутаредоксин-1. Биосенсор Grx1-roCherry является надежным инструментом исследования динамики изменения соотношения 2GSH/GSSG в реальном времени в различных биологических системах, в том числе в комбинации с другими спектрально различающимися версиями в режиме мультипараметрической микроскопии.

Хемогенетическая модель сердечной недостаточности

Лаборатория молекулярных технологий

Окислительный стресс является, по сути, дисбалансом потоков электронов внутри клетки: утечка электронов из каскадов метаболических и электрохимических реакций на кислород ведут к образованию активных форм кислорода и окислительному повреждению молекулярных структур в клетке. В норме такие утечки компенсируются работой эффективных антиоксидантных ферментов и систем репарации и биосинтеза. Однако если утечек слишком много, или если антиоксидантные системы испытывают недостаток «топлива», окислительное повреждение может накапливаться и приводить к некорректной работе клетки или органа. Это состояние и называется окислительным стрессом.

Существует множество научных данных разной степени достоверности о том, что окислительный стресс лежит в основе множества патологий, в первую очередь заболеваний сердечно-сосудистой системы, где кислород является «центральной» молекулой. Однако практически любая патология имеет сложную структуру, в которую вовлечено огромное количество различных метаболических и сигнальных процессов. Зачастую невозможно понять, является тот или иной процесс причиной или следствием патологии. Окислительный стресс является здесь типичным примером. Является ли он причиной или хотя бы неотъемлемым компонентом сердечной патологии, или вторичным процессом, возникающим на поздних стадиях заболевания в ходе рассогласования каких-то других процессов? Ответить на этот вопрос было невозможно без создания новых модельных организмов, в которых ученые могли бы «включать» окислительный стресс в здоровом сердце и потом наблюдать, развивается ли патология и насколько она похожа на болезнь, развивающуюся «естественным» путем.

Исследователи из ИБХ РАН вместе с коллегами из Гарварда создали такую модель, используя принципы синтетической биологии: перенося молекулярные блоки из одних организмов в другие с целью создания живых систем с новыми свойствами. Одним из направлений синтетической биологии является хемогенетика: внедрение в клетку генов, кодирующих белки, функционирующие в присутствии определенных химических веществ. Чтобы исследовать окислительный стресс на сердце, исследователи использовали оксидазу D-аминокислот (DAAO) — фермент, который был клонирован из дрожжей. Известно, что DAAO продуцирует пероксид водорода (H2O2) только в присутствии D-аминокислот, что приводит к окислительному стрессу. Но так как клетки млекопитающих используют почти исключительно L-аминокислоты, а не их D-стереоизомеры, фермент DAAO остается неактивным в клетках сердца до того момента как исследователи вводят в организм животного аминокислоту D-аланин. Команда исследователей использовала вирус для доставки DAAO в сердца крыс, а затем животных поили в течение нескольких недель питьевой водой, содержащей D-аланин. Затем сердца животных исследовали, используя эхокардиографию для измерения сердечной функции и размера сердца. Кроме того, исследователи измеряли маркеры воспалительного и адаптивного стресса.

Оказалось, что окислительный стресс вызывает у животных дилатационную кадиомиопатию — заболевание, при котором происходит растяжение полостей сердца. У животных значительно повышался уровень маркеров кардиомиопатии, таких как предсердный натрийуретический пептид и кардио-тропонин I. При этом не наблюдалось фиброза сердечной ткани, что свидетельствует о том, что либо фиброз не ассоциирован с окислительным стрессом, либо он возникает на более поздних стадиях патологии.

Публикации

  1. Steinhorn B, Sorrentino A, Badole S, Bogdanova Y, Belousov V, Michel T (2018). Chemogenetic generation of hydrogen peroxide in the heart induces severe cardiac dysfunction. Nat Commun 9 (1), 4044

Флуоресцентный pH-сенсор для рекордно точного наблюдения за процессами в клетке

Лаборатория молекулярных технологий

Этот «молекулярный pH-метр» является усовершенствованной версией рН-сенсоров семейства SypHer, разработанных ранее в лаборатории. Сенсор позволяет количественно измерять рН в живых системах разной степени сложности. SypHer3s методами генетической инженерии может быть доставлен живую клетку и, благодаря своей беспрецедентно высокой яркости, может использоваться в микроскопии высокого разрешения: например, для точных наблюдений за колебаниями кислотности в клетках или даже в целых организмах — в статье впервые измерен рН в различных тканях эмбриона рыбки данио-рерио. 

Кроме того, с помощью SypHer3s удалось продемонстрировать функциональную неоднородность митохондрий в разных компартментах нейронов. В теле нейрона митохондрии малоактивны, в то время как в синапсах они начинают активно откачивать протоны из матрикса, создавая электрохимический градиент, необходимый для синтеза АТФ. Следить за этими процессами удобно с помощью рН сенсора, направленного в митохондрии. По словам Всеволода Белоусова, «складывается впечатление, что разные части нейрона получают энергию по-разному: тело живет за счет гликолиза, а синапсы — за счет окислительного фосфорилирования».