Лаборатория молекулярных технологий

Центральным направлением наших исследований является использование синтетической биологии для исследований редокс-регуляции нейронов и других клеток, а также для разработки молекулярных инструментов для оптогенетики и метаболической инженерии.

Живые системы отличаются направленным транспортом электронов через редокс пары. В каждой живой клетке электроны транспортируются от первичных источников (пища) к акцепторам (молекулярный кислород и другие терминальные акцепторы, строительные блоки макромолекул). Транспорт идет через систему редокс пар, некоторые из которых, как например NADH/NAD+ or NADPH/NADP+, выступают в роли «электронной валюты», депонируя электроны и обслуживая реакции окисления и восстановления. В свою очередь, молекулярный кислород не только служит терминальным акцептором электронов в дыхательных цепях, но и выступает глобальным регулятором метаболических и сигнальных процессов посредством активных форм кислорода. Не будет преувеличением сказать, что состояние редокс пар и концентрация и локализация редокс-мессенджеров регулируют все процессы в клетке.

Один из главных вопросов в наших исследованиях: как ключевые АФК и редокс-пары (например H2O2, NADP+/NADPH) регулируют функционирование нейронов. Особый интерес в этой области представляет селективный мониторинг и модуляция редокс-процессов в синапсах. Мониторинг редокс-регуляции осуществляется с помощью направленной экспрессии генетически кодируемых сенсоров в пре- и постсинаптических терминалях нейронов. Модуляция осуществляется с помощью инструментов метаболической инженерии, для которых также возможна синаптическая локализация. Разрабатываемые нами молекулярные инструменты метаболической инженерии основаны на ферментах из бактерий, архей и дрожжей, использующих субстраты, нехарактерные для клеток позвоночных. Экспрессируя эти ферменты в различных модельных объектах, от культивируемых нейронов до животных (рыба Danio rerio, мышь), в комбинации с генетически кодируемыми флуоресцентными сенсорами, мы пытаемся понять редокс-регуляцию нейронов.

Другим направлением наших исследований является разработка новых подходов оптогенетической стимуляции нейронов. Нами используются термочувствительные катионные каналы из змей для термогенетической активации нейронов с помощью ИК-лазеров. Каналы семейства TRP имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными для оптогенетики каналородопсинами: гораздо более высокая проводимость, активация ИК-излучением, гораздо глубже проникающим в ткань по сравнению с видимым светом. Каналы TRPA1 из змей успешно используются нами для активации нейронов в культуре и для управления поведенческими реакциями рыбы Danio.

Нами разрабатываются новые методы микроскопии сверхвысокого разрешения, позволяющие наблюдать за динамикой сигнальных процессов в клетках. До недавнего времени субдифракционная микроскопия позволяла наблюдать лишь за структурой внутриклеточных филаментов и других надмолекулярных комплексов. Нам впервые удалось использовать биосенсор в качестве флуорофора для сверхразрешающей микроскопии (Mishina et al, Nano Letters 2015). Это позволило получить информацию об истинных размерех микродоменов пероксида водорода в клетке. В настоящее время мы тестируем еще ряд подходов к извлечению информации о динамических процессах из субдифракционных изображений.

Ф.И.О.ДолжностьКонтакты
Белоусов Всеволод Вадимович, д. б. н.зав. лаб.belousov@ibch.ru+7(495)336-82-33
Мишина Наталия Михайловна, к. б. н.с.н.с.natsafr@yandex.ru+7()
Подгорный Олег Владимировичс.н.с.
Кельмансон Илья Владимирович, к. б. н.н.с.ikelmanson@gmail.com
Марквичева Ксения Николаевна, к. б. н.н.с.
Богданова Юлия Антоновнам.н.с.bogdanova.biochem@gmail.com
Потехина Екатерина Сергеевна, к. б. н.м.н.с.potekh@mail.ru
Шишова Ксения Владимировнам.н.с.
Фетисова Елена Сергеевнастуд.fetisova.el.s@gmail.com+7()
Ревазян Арам Самвеловичинж.-иссл.aram93-95@mail.ru
Басс Дина Юрьевнаинженерbass.dina2014@yandex.ru+7()
Иваненко Александр Вячеславовичинженерszd95@yandex.ru+7()
Смолярова Дарья Дмитриевнаинженер

Ранее здесь работали:

Билан Дмитрий Сергеевич, к. б. н.с.н.с.d.s.bilan@gmail.com
Ермакова Юлия Геннадьевна, к. б. н.с.н.с.ermakova.iylia@yandex.ru
Кудрявцева Елена Иосифовна, к. б. н.н.с.ekudryavtseva2000@yahoo.com
Рощина Марина Анатольевнан.с.
Матлашов Михаил Егоровичасп.matlashowww@mail.ru
Шохина Арина Геннадиевнаасп.a.g.shokhina@yandex.ru

Все публикации (показать избранные)

Загружаются...

Белоусов Всеволод Вадимович

Визуализация работы антиоксидантных систем хемогенетическими методами

Пероксид водорода образуется под действием ряда ферментов и выполняет сигнальные функции локально в тех компартментах, в которых образуется. Его диффузия внутри клетки ограничена действием антиоксидантных систем, Это способствует возникновению локально повышенных концентраций АФК, достаточных для осуществления регуляторных функций, при этом не вызывающих повреждений.  На данный момент не был до конца ясен вклад каждой отдельной антиоксидантной системы в этот процесс. Визуализация работы антиоксидантных систем достаточно сложна: ферменты, генерирующие пероксид водорода, имеют свой паттерн локализации, также как и основные члены антиоксидантных систем, при этом оба паттерна малоизучены. 

Для решения этой проблемы в лаборатории Белоусова использовали принципы хемогенетики и синтетической биологии.  Фермент оксидаза Д-аминокислот (ДААО), осуществляющий окислительное дезаминирование Д-аминокислот с образованием пероксида водорода в качестве побочного продукта,  уже с успехом использовался для контролируемой продукции H2O2 в различных типах клеток, а также in vivo. С помощью специального пептидного сигнала этот фермент направляли в клеточное ядро, а чувствительный к пероксиду водорода биосенсор HyPer3  - в матрикс митохондрий. Оба компартмента сохраняли свои позиции в клетке на протяжении времени, достаточного для визуализации градиента пероксида водорода. Данный градиент формировался после активации ДААО добавкой Д-аминокислоты в результате действия антиоксидантных систем, препятствовавших диффузии образующегося H2O2. Далее, используя специфичные ингибиторы, было показано, что ключевую роль в ограничении диффузии пероксида водорода в цитоплазме клеток HeLa Kyoto играет тиоредоксиновый путь. При этом одинаково важны оказываются как тиоредоксинредуктазы в цитоплазме, так и в митохондриях. Созданная система позволяет в будущем изучать вклады антиоксидантных ферментов в формирование локального редокс-баланса в различных типах клеток, а также осуществлять простые скрининги веществ, воздействующих на антиоксидантные системы клеток.

Публикации

  1. Mishina NM, Bogdanova YA, Ermakova YG, Panova AS, Kotova DA, Bilan D, Steinhorn B, Arnér ESJ, Michel T, Belousov V (2019). Which antioxidant system shapes intracellular H2O2 gradients? Antioxid Redox Signal 31 (9), 664–670

Генетически кодируемый индикатор Grx1-roCherry на основе красного флуоресцентного белка для регистрации редокс-статуса пула глутатиона

Совместно с: Группа метаболических основ патологии

Мы разработали генетически кодируемый биосенсор для регистрации редокс-состояния пула глутатиона (соотношение 2GSH/GSSG) на основе красного флуоресцентного белка mCherry. Структура флуоресцентного белка содержит пару редокс-активных аминокислотных остатков цистеина, которые вовлечены в реакции тиол-дисульфидного обмена внутриклеточных систем. Флуоресцентный сигнал биосенсора отражает редокс-состояние глутатиона в исследуемой системе благодаря спектральному различию окисленной и восстановленной форм белка. Для улучшения кинетических свойств биосенсора в его структуру был добавлен человеческий глутаредоксин-1. Биосенсор Grx1-roCherry является надежным инструментом исследования динамики изменения соотношения 2GSH/GSSG в реальном времени в различных биологических системах, в том числе в комбинации с другими спектрально различающимися версиями в режиме мультипараметрической микроскопии.

Флуоресцентный pH-сенсор для рекордно точного наблюдения за процессами в клетке

Этот «молекулярный pH-метр» является усовершенствованной версией рН-сенсоров семейства SypHer, разработанных ранее в лаборатории. Сенсор позволяет количественно измерять рН в живых системах разной степени сложности. SypHer3s методами генетической инженерии может быть доставлен живую клетку и, благодаря своей беспрецедентно высокой яркости, может использоваться в микроскопии высокого разрешения: например, для точных наблюдений за колебаниями кислотности в клетках или даже в целых организмах — в статье впервые измерен рН в различных тканях эмбриона рыбки данио-рерио. 

Кроме того, с помощью SypHer3s удалось продемонстрировать функциональную неоднородность митохондрий в разных компартментах нейронов. В теле нейрона митохондрии малоактивны, в то время как в синапсах они начинают активно откачивать протоны из матрикса, создавая электрохимический градиент, необходимый для синтеза АТФ. Следить за этими процессами удобно с помощью рН сенсора, направленного в митохондрии. По словам Всеволода Белоусова, «складывается впечатление, что разные части нейрона получают энергию по-разному: тело живет за счет гликолиза, а синапсы — за счет окислительного фосфорилирования».

Хемогенетическая модель сердечной недостаточности

Окислительный стресс является, по сути, дисбалансом потоков электронов внутри клетки: утечка электронов из каскадов метаболических и электрохимических реакций на кислород ведут к образованию активных форм кислорода и окислительному повреждению молекулярных структур в клетке. В норме такие утечки компенсируются работой эффективных антиоксидантных ферментов и систем репарации и биосинтеза. Однако если утечек слишком много, или если антиоксидантные системы испытывают недостаток «топлива», окислительное повреждение может накапливаться и приводить к некорректной работе клетки или органа. Это состояние и называется окислительным стрессом.

Существует множество научных данных разной степени достоверности о том, что окислительный стресс лежит в основе множества патологий, в первую очередь заболеваний сердечно-сосудистой системы, где кислород является «центральной» молекулой. Однако практически любая патология имеет сложную структуру, в которую вовлечено огромное количество различных метаболических и сигнальных процессов. Зачастую невозможно понять, является тот или иной процесс причиной или следствием патологии. Окислительный стресс является здесь типичным примером. Является ли он причиной или хотя бы неотъемлемым компонентом сердечной патологии, или вторичным процессом, возникающим на поздних стадиях заболевания в ходе рассогласования каких-то других процессов? Ответить на этот вопрос было невозможно без создания новых модельных организмов, в которых ученые могли бы «включать» окислительный стресс в здоровом сердце и потом наблюдать, развивается ли патология и насколько она похожа на болезнь, развивающуюся «естественным» путем.

Исследователи из ИБХ РАН вместе с коллегами из Гарварда создали такую модель, используя принципы синтетической биологии: перенося молекулярные блоки из одних организмов в другие с целью создания живых систем с новыми свойствами. Одним из направлений синтетической биологии является хемогенетика: внедрение в клетку генов, кодирующих белки, функционирующие в присутствии определенных химических веществ. Чтобы исследовать окислительный стресс на сердце, исследователи использовали оксидазу D-аминокислот (DAAO) — фермент, который был клонирован из дрожжей. Известно, что DAAO продуцирует пероксид водорода (H2O2) только в присутствии D-аминокислот, что приводит к окислительному стрессу. Но так как клетки млекопитающих используют почти исключительно L-аминокислоты, а не их D-стереоизомеры, фермент DAAO остается неактивным в клетках сердца до того момента как исследователи вводят в организм животного аминокислоту D-аланин. Команда исследователей использовала вирус для доставки DAAO в сердца крыс, а затем животных поили в течение нескольких недель питьевой водой, содержащей D-аланин. Затем сердца животных исследовали, используя эхокардиографию для измерения сердечной функции и размера сердца. Кроме того, исследователи измеряли маркеры воспалительного и адаптивного стресса.

Оказалось, что окислительный стресс вызывает у животных дилатационную кадиомиопатию — заболевание, при котором происходит растяжение полостей сердца. У животных значительно повышался уровень маркеров кардиомиопатии, таких как предсердный натрийуретический пептид и кардио-тропонин I. При этом не наблюдалось фиброза сердечной ткани, что свидетельствует о том, что либо фиброз не ассоциирован с окислительным стрессом, либо он возникает на более поздних стадиях патологии.

Публикации

  1. Steinhorn B, Sorrentino A, Badole S, Bogdanova Y, Belousov V, Michel T (2018). Chemogenetic generation of hydrogen peroxide in the heart induces severe cardiac dysfunction. Nat Commun 9 (1), 4044