Отдел биофотоники

Отдел биофотоники был образован в марте 2020 года из подразделений, ранее входивших в Отдел геномики и постгеномных технологий, Отдел пептидно-белковых технологий и Отдел биомолекулярной химии.

Отдел работает над фундаментальными и прикладными задачами в области биофотоники с использованием широкого спектра подходов: генной инженерии, направленной молекулярной эволюции, белковой химии, флуоресцентной микроскопии, рентгеноструктурного анализа белков, химического синтеза.

Основные направления:

  • Разработка технологий флуоресцентного мечения живых клеток и организмов
  • Развитие методов опто- и хемогенетики 
  • Определение кристаллических структур флуоресцентных белков 
  • Создание новых флуоресцентных белков 
  • Разработка методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения
  • Синтез флуоресцентных и флуорогенных соединений

Все публикации (показать избранные)

Лукьянов Константин Анатольевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. , комн.
  • Эл. почта: kluk@ibch.ru

Пространственная организация фотостабильного биомаркера нового типа - DiB1

Группа молекулярных меток для оптической наноскопии,  Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров

Методом рентгеноструктурного анализа c высоким разрешением 1.58Å установлена структура фотостабильного нековалентного комплекса бактериального липокалина Blc c синтетическим хромофором М739 (DiB1:M739).  

Установлены стереохимические детали связывания хромофора и на основе полученных структурных данных осуществлен дизайн двух новых генно-инженерных биомаркеров (зеленого и желтого) с повышенной аффинностью и яркостью.

Структурно-функциональная взаимосвязь красного флуоресцентного биомаркера FusionRed

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов,  Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров

Красный флуоресцентный белок FusionRed является эффективным мономерным малотоксичным биомаркером и широко используется для мечения биологических объектов в живых клетках и тканях. resolution. Методом рентгеноструктурного анализа в определена его структура при сверхвысоком разрешении 1.09Å. Установлено наличие двух альтернативных путей пост-трансляционной модификации белка с образованием зрелого хромофора (~60%) и интактной хромофоробразующей триады (~40%). Структурно обоснованная замена остатка Cys158 (стабилизирующего несозревшую форму за счет Н-связи) на объемный гидрофобный остаток Leu привела к 100% созреванию хромофора.

Публикации

  1. Muslinkina L, Pletnev VZ, Pletneva NV, Ruchkin DA, Kolesov DV, Bogdanov AM, Kost LA, Rakitina TV, Agapova YK, Shemyakina II, Chudakov DM, Pletnev S (2020). Two independent routes of post-translational chemistry in fluorescent protein FusionRed. Int J Biol Macromol 155, 551–559

Генетически кодируемый сенсор поли-АДФ-рибозы

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов

Поли-АДФ-рибозилирование - это обратимая посттрансляционная модификация белков и ДНК, которая играет важную роль в различных клеточных процессах, таких как реакция на повреждение ДНК, репликация, транскрипция и гибель клеток. В настоящей работе мы разработали первый полностью генетически кодируемый флуоресцентный сенсор поли-АДФ-рибозы (ПАР) на основе Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET).

Домен WWE убиквитинлигазы RNF146 E3, который распознает внутреннюю ПАР-специфическую структурную единицу изо-АДФ-рибозы, был использован в качестве модуля нацеливания на ПАР. Сенсор состоял из флуоресцентных белков Turquoise2 и Venus, каждый из которых был слит с доменом WWE. Этот двухчастный сенсор, названный sPARroW (sensor for PAR relying on WWE), позволял контролировать накопление и распад ПАР в живых клетках млекопитающих в ответ на различные стимулы, а именно на обработку перекисью водорода, УФ-облучение и гипертермию.

Универсальность возможных способов детекции сигнала сенсора (транслокация сигнала, либо ратиометрическая детекция FRET, либо визуализации FRET на основе детекции времени жизни флуоресценции) делает sPARroW легко применимым в различных биологических моделях и микроскопах.

Публикации

  1. Serebrovskaya EO, Podvalnaya NM, Dudenkova VV, Efremova AS, Gurskaya NG, Gorbachev DA, Luzhin AV, Kantidze OL, Zagaynova EV, Shram SI, Lukyanov KA (2020). Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Poly-ADP-Ribose. Int J Mol Sci 21 (14), 1–11

Гетеродимеризацию K/E-спиралей впервые применили для флуоресцентного мечения белков в живых клетках. 

Одна из специально подобранных α-спиралей (K или E) служит меткой для целевого белка, а другую помещают на генетически кодируемый флуоресцентный белок. За счет обратимого взаимодействия K и E-спиралей целевая белковая структура окрашивается, а непрерывный обмен флуоресцентных белков в составе комплекса на порядок увеличивает устойчивость к фотообесцвечиванию. 

Небольшой размер меток (всего 2-3 кДа) позволяет сохранить нативную динамику исследуемых белков. Вдобавок, такой метод дает возможность наблюдать белки практически сразу после их синтеза.

Наиболее интересным оказалось применение K/E-спиралей для Protein-PAINT – локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения, основанной на обратимом взаимодействующих метках. Непрерывный обмен флуоресцентных белков между целевой клеточной структурой и цитоплазматическим пулом обеспечивает стабильно высокую плотность мечения даже при продолжительной съемке. С помощью K/E-спиралей впервые удалось воплотить концепцию наноскопии Protein-PAINT с использованием только генетически кодируемых репортеров.

Публикации

  1. Perfilov MM, Gurskaya NG, Serebrovskaya EO, Melnikov PA, Kharitonov SL, Lewis TR, Arshavsky VY, Baklaushev VP, Mishin AS, Lukyanov KA (2020). Highly photostable fluorescent labeling of proteins in live cells using exchangeable coiled coils heterodimerization. Cell Mol Life Sci 77 (21), 4429–4440

Короткий дуплексный модуль, соединенный с G-квадруплексами, увеличивает флуоресценцию синтетических аналогов хромофора GFP

Группа химии гетероциклических соединений,  Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем

Аптасенсоры стали популярными инструментами в биоаналитической химии и молекулярной биологии. Для повышения специфичности перспективные сигнальные элементы в аптасенсорах можно разделить на G-квадруплексную (G4) часть  и свободный флуоресцентный краситель, который разгорается при связывании с G4 частью. Однако существующие системы ограничены относительно низким усилением флуоресценции при связывании красителя. Мы присоединили дуплексные модули к G4 структурам, что предположительно вызывает образование связывающей краситель полости между двумя модулями. Скрининг множества синтетических аналогов хромофора GFP и вариация дуплексного модуля позволили отобрать красители, которые разгораются после образования комплекса с двухмодульными структурами и их РНК-аналогами до 20 раз по сравнению с G4 без дуплексного модуля. Мы продемонстрировали усиление флуоресценции красителя после связывания с модифицированными структурами TBA, LTR-III и Tel23a G4 и предполагаем, что такая архитектура коротких сигнальных элементов дуплекс-G4 будет способствовать разработке улучшенных аптасенсоров.

Эффективность гибридизационного анализа с помощью флуоресцентных ДНК-зондов зачастую ограничивается низким соотношением сигнал/фон, которое может быть частично преодолено сложными методами усиления сигнала. Глубокое понимание механизмов тушения флуоресценции и передачи энергии в сложных ДНК-зондах, а также выбор оптимальных пар донор/акцептор наряду с рациональным дизайном могут значительно повысить эффективность работы ДНК-зондов. Мы предлагаем новые бинарные FRET-ДНК-зонды с эксимеробразующей пиреновой парой в качестве донора и красителем сульфо-Cy3 в качестве акцептора. Зонды продемонстрировали 75-кратное улучшение флуоресценции сульфо-Cy 3 при гибридизации с мишенью. Стоксов сдвиг 220 нм минимизирует перекрестные помехи. Однофотонный отсчёт времени позволил выявить два возбужденных состояния пиренового эксимера, из которых лишь одно непосредственно участвует в резонансном переносе энергии на сульфо-Cy3. Оптимизированные ДНК-зонды продемонстрировали высокую чувствительность с отличным соотношением сигнал/фон и были применены для визуализации 18S рРНК методом флуоресцентной гибридизации in situ в клетках HEK293T.

В статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology, ученые ИБХ РАН показали возможность создания растений, излучающих собственную видимую люминесценцию. Было обнаружено, что биолюминесценция некоторых грибов метаболически сходна с естественными процессами, характерными для растений. Интегрировав гены биолюминесцентной системы гриба Neonothopanus nambi в геном табака, ученые смогли создать растения, которые светятся намного ярче, чем это было возможно ранее. Созданные трансгенные растения светятся непрерывно на протяжении всего жизненного цикла и могут быть использованы в качестве системы для проведения биоимиджинга. В отличие от других широко используемых биолюминесцентных систем, например, светлячков, для поддержания биолюминесценции грибов не требуются уникальные химические реагенты.

Публикации

  1. Mitiouchkina T, Mishin AS, Somermeyer LG, Markina NM, Chepurnyh TV, Guglya EB, Karataeva TA, Palkina KA, Shakhova ES, Fakhranurova LI, Chekova SV, Tsarkova AS, Golubev YV, Negrebetsky VV, Dolgushin SA, Shalaev PV, Shlykov D, Melnik OA, Shipunova VO, Deyev SM, Bubyrev AI, Pushin AS, Choob VV, Dolgov SV, Kondrashov FA, Yampolsky IV, Sarkisyan KS (2020). Plants with genetically encoded autoluminescence. Nat Biotechnol 38 (8), 944–946

Созданы новые метки и подходы к низкотоксичному флуоресцентному мечению белков в живых клетках

Группа химии гетероциклических соединений,  Группа молекулярных меток для оптической наноскопии

Ультрафиолет, часто используемый во флуоресцентной микроскопии и наноскопии, чрезвычайно токсичен для клеток. Поэтому предпочтительно использование меток в зеленой и красной области спектра. 

Мы обнаружили способность флуоресцентного белка mAvicFP1 к спонтанному миганию под действием  менее токсичного синего света, и применили это свойство для наноскопии и слежения за одиночными молекулами меченых белков в живых клетках.

Флуороген-активирующие белки - это cистемы мечения нового поколения, состоящие из генетически кодируемого белка и обратимо связывающимся с ним флуорогена, добавляемого извне. Нами создан и применен в живых клетках новый красный флуороген N871b для белка-репортера FAST. 

 

Флуоресцентный биомаркер с остатком Ala в третьей позиции хромофоробразующей триады. Рентгеноструктурные исследования.

Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров

Методом рентгеноструктурного анализа установлены пространственные структуры и структурно-функциональная взаимосвязь четырех флуоресцентных белков, LanFP6G, LanFP6A, LanFP10G и LanFP10A, из малоизученной группы хордовых (Branchiostoma floridae) с разрешением 1.20, 1.35, 1.30 и 1.81Å , соответственно. Впервые, в семействе GFP подобных белков установлена структура флуоресцентного LanFP10A, у которого в третьей позиции зрелого хромофора находится остаток Ala вместо строго консервативного остатка Gly.

Публикации

  1. Muslinkina L, Roldán-Salgado A, Gaytán P, Juárez-González VR, Rudiño E, Pletneva N, Pletnev V, Dauter Z, Pletnev S (2019). Structural Factors Enabling Successful GFP-Like Proteins with Alanine as the Third Chromophore-Forming Residue. J Mol Biol 431 (7), 1397–1408

Кристаллическая структура белкового ингибитора протеаз Alocasin из корневища Alocasia.

Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров

Пространственная структура β-структурного белка Alocasin из корней растения Alocasia установлена методом рентгеноструктурного анализа при разрешении 2.5Å. Alocasin проявляет сильную ингибиторную активность по отношению к трипсину и химотрипсину, а также к кишечной протеазе комара Aedes aegypti и в, этой связи, представляет интерес в качестве перспективного средства для борьбы с комарами.

Публикации

  1. Vajravijayan S, Pletnev S, Pletnev VZ, Nandhagopal N, Gunasekaran K (2018). Crystal structure of a novel Kunitz type inhibitor, alocasin with anti-Aedes aegypti activity targeting midgut proteases. Pest Manag Sci 74 (12), 2761–2772

Фотопереключаемые красные флуоресцентные белки для наноскопии в живых клетках

Лаборатория методов иммуносеквенирования,  Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов

Мы получили новые обратимо фотопереключаемые красные флуоресцентные белки на основе белка FusionRed. Флуоресценция этих белков, rsFusionRed1, 2 и 3, может быть “выключена” и “включена” облучением оранжевым и зеленым светом, соответственно. Это позволяет избежать облучения фототоксичным фиолетовым и синим светом, обычно используемым для других фотопереключаемых белков. Благодаря высокой яркости, высокой фотостабильности, быстрому фотопереключению и низкой фототоксичности возбуждающего света белки rsFusionRed представляют собой прекрасные метки для наноскопии живых клеток.

Публикации

  1. Pennacchietti F, Serebrovskaya EO, Faro AR, Shemyakina II, Bozhanova NG, Kotlobay AA, Gurskaya NG, Bodén A, Dreier J, Chudakov DM, Lukyanov KA, Verkhusha VV, Mishin AS, Testa I (2018). Fast reversibly photoswitching red fluorescent proteins for live-cell RESOLFT nanoscopy. Nat Methods 15 (8), 601–604

Пространственная структура и структурно-функциональная взаимосвязь зеленого флуоресцентного белка WasCFP.

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров

Методом рентгеноструктурного анализа установлена пространственная структура рН зависимого зеленого флуоресцентного белка WasCFP с хромофором на основе Trp при экстремально низком значении pH 2.0 с разрешением 1.3Å (ранее нами были установлены структуры при рН 10.0, 8.0 и 5.5). Показано, что последовательное изменение рН с 10.0 до 2.0 сопровождается плавными изменениями спектральных свойств коррелирующими с синхронными изменениями конформаций боковых цепей остатков в области хромофора. Влияние взаимодействия хромофора с ключевыми аминокислотными остатками из ближайшего окружения исследовано методом квантовой химии.

Пространственная организации и структурно-функциональная взаимосвязь флуоресцентных белков

Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров

Подпись к рисунку: A) Совмещенные структуры флуоресцентных белков ближнего инфракрасного диапазона –  miRFP703 (показан зеленым цветом) and miRFP709 (розовым) с хромофором  в центре в связывающей полости. (B) Спектры эмиссии miRFP703 (показан зеленым цветом), miRFP709 (красным), miRFP709/Y210F (розовым)

Методом рентгеноструктурного анализа установлены пространственные структуры и изучена структурно-функциональная взаимосвязь трех новых ярких генно-инженерных биомаркеров (на основе растительных фоторецепторов - фитохромов) дальне-красного и ближнего инфракрасного диапазонов, обеспечивающих высокую проницаемость излучения через биологические ткани - miRFP670 (lэм ~670нм), miRFP703 (703нм) and miRFP709 (709 нм) с разрешением 1.33, 1.35 и 1.34Å, соответственно.

Публикации

  1. Baloban M, Shcherbakova DM, Pletnev S, Pletnev VZ, Lagarias JC, Verkhusha VV (2017). Designing brighter near-infrared fluorescent proteins: Insights from structural and biochemical studies. Chem Sci 8 (6), 4546–4557

Мы разработали новый метод мечения целевых белков в живой клетке, названный Protein-PAINT. Метод основан на обратимом связывании белкового домена с флуорогенным красителем, что приводит к многократному увеличению интенсивности его флуоресценции. На основе результатов компьютерного молекулярного докинга, мы получили три мутантных варианта бактериального липокалина Blc с различным сродством к флуорогену. Было показано, что флуороген быстро проникает в живые клетки и вызывает окрашивание целевых белков, слитых с мутантными Blc. Новый метод обеспечивает на порядок большую фотостабильность сигнала, по сравнению с флуоресцентными белками. Protein-PAINT также позволяет проводить долговременную флуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения живых клеток как в режиме детекции одиночных молекул, так и в режиме STED.

Глубокий структурно-функциональный анализ влияния аминокислотных замен на фотофизические свойства зеленых флуоресцентных белков

Группа синтетической биологии,  Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов

На примере зеленого флуоресцентного белка GFP впервые удалось экспериментально определить так называемый “ландшафт приспособленности” целого белка. Уникальный подход, разработанный в ходе работы, позволил соотнести функцию (флуоресценцию) и аминокислотную последовательность для нескольких десятков тысяч случайных мутантных вариантов с выявлением множества эпистатических (влияющих друг на друга) замен. Характеризация ландшафта приспособленности GFP делает возможным компьютерное предсказание свойств новых мутаций во флуоресцентных белках, а также имеет большое значение в различных областях науки, например, молекулярной эволюции и белковой инженерии.

С помощью расчетов возможных путей передачи электрона от возбужденного хромофора GFP к внешним молекулам и последующей экспериментальной проверки этих предположений удалось создать мутантные варианты с нарушением данных путей и, соответственно, повышенной фотостабильностью. Разработанный подход является новым в актуальной проблеме направленного создания фотостабильных вариантов флуоресцентных белков.

 

Рисунок. (А) Схема ландшафта приспособленности GFP по результатам анализа 51000 мутантов. Последовательность GFP представлена как круг, где каждая колонка соответствует одному аминокислотному остатку. Зеленым обозначены флуоресцентные варианты, черным – нефлуоресцентные. Цифры слева обозначают количество внесенных аминокислотных замен. Сайты с позитивным и негативным эпистатическим влиянием показаны зелеными и черными линиями, соответственно. Схема показывает узость пика ландшафта приспособленности GFP: 3/4 одиночных замен приводит к уменьшению яркости флуоресценции, а половина мутантов с 4-мя заменами полностью теряют флуоресценцию. (Б) Перенос электрона в GFP. Вверху - схема расчетного пути переноса электрона от хромофора на молекулу внешнего акцептора через тирозин-145 в качестве промежуточного акцептора. Внизу – кривые фотообесцвечивания EGFP и его вариантов с заменой тирозина-145 на фенилаланин или лейцин в присутствии окислителя в среде, демонстрирующие многократное увеличение фотостабильности мутантных вариантов благодаря блокировке пути переноса электрона. 

Публикации

  1. Sarkisyan KS, Bolotin DA, Meer MV, Usmanova DR, Mishin AS, Sharonov GV, Ivankov DN, Bozhanova NG, Baranov MS, Soylemez O, Bogatyreva NS, Vlasov PK, Egorov ES, Logacheva MD, Kondrashov AS, Chudakov DM, Putintseva EV, Mamedov IZ, Tawfik DS, Lukyanov KA, Kondrashov FA (2016). Local fitness landscape of the green fluorescent protein. Nature 533 (7603), 397–401
  2. Bogdanov AM, Acharya A, Titelmayer AV, Mamontova AV, Bravaya KB, Kolomeisky AB, Lukyanov KA, Krylov AI (2016). Turning on and off Photoinduced Electron Transfer in Fluorescent Proteins by π-Stacking, Halide Binding, and Tyr145 Mutations. J Am Chem Soc 138 (14), 4807–4817
  3. Acharya A, Bogdanov AM, Grigorenko BL, Bravaya KB, Nemukhin AV, Lukyanov KA, Krylov AI (2017). Photoinduced chemistry in fluorescent proteins: Curse or blessing? Chem Rev 117 (2), 758–795

Метод определения активности нонсенс-опосредованной деградации мРНК в единичных живых клетках с помощью флуоресцентных белков

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов

Нонсенс-опосредованная деградация мРНК (NMD) является эволюционно консервативным механизмом распознавания и уничтожения транскриптов, несущих преждевременный стоп-кодон. Исследования последних лет показали, что NMD играет важную роль в глобальной регуляции экспрессии генов. Мы разработали новый репортер активности NMD, основанный на флуоресцентных белках. Особенностью данного репортера является возможность количественной оценки активности NMD на уровне единичных живых клеток, что не достигается ни одним из других известных методов. Используя NMD-репортер, мы обнаружили сильные различия активности NMD между линиями клеток млекопитающих. Также, мы впервые обнаружили явление существенной гетерогенности NMD внутри одной линии (например, HEK293, Jurkat, HaCaT), с выявлением субпопуляций клеток с высокой и низкой активностью NMD. Разработанный метод открывает принципиально новые возможности изучения как механизмов регуляции NMD, так и влияния низкой активности NMD на паттерн генной экспрессии и физиологическое состояние клетки.

Новый фототоксичный флуоресцентный биомаркер с Trp-содержащим хромофором

Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров

Методом рентгеноструктурного анализа установлены пространственные структуры двух новых фототоксичных оранжевых флуоресцентых белков (ФБ) – димерного KillerOrange и мономерного mKillerOrange при разрешении 1.81Å и 1.57 Å, соответственно. Это первые белковые фотосенситазеры на основе триптофан содержащего хромофора (Gln65-Trp66-Gly67), проявляющие флуоресценцию в оранжевой области спектра. Структуры обоих ФБ имеют внутренний проходящий вдоль оси β-бочонка канал с цепочкой связанных водородными связями молекул воды, обеспечивающей транспорт фотоиндуцированных реакционных форм кислорода.  Trp66 хромофора у KillerOrange/mKillerOrange принимает необычную высокоэнергетичную транс-цис конформацию, стабилизированную Н-связью с ближайшим остатком Gln159. Найденный транс-цис изомер является первым примером среди всех известных изомеров установленных для хромофоров на основе Trp. Предполагается, что это конформационное состояние является ключевым структурным фактором для генерации яркой оранжевой эмиссии и фототоксичности.