В статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology, ученые ИБХ РАН показали возможность создания растений, излучающих собственную видимую люминесценцию. Было обнаружено, что биолюминесценция некоторых грибов метаболически сходна с естественными процессами, характерными для растений. Интегрировав гены биолюминесцентной системы гриба Neonothopanus nambi в геном табака, ученые смогли создать растения, которые светятся намного ярче, чем это было возможно ранее. Созданные трансгенные растения светятся непрерывно на протяжении всего жизненного цикла и могут быть использованы в качестве системы для проведения биоимиджинга. В отличие от других широко используемых биолюминесцентных систем, например, светлячков, для поддержания биолюминесценции грибов не требуются уникальные химические реагенты.

Среди кислоточувствительных ионных каналов (ASIC) субъединицы ASIC1a и ASIC3 являются наиболее привлекательными фармакологическими мишенями. Ингибирование этих каналов специфичными лигандами -  прямой путь к лечению социально значимых заболеваний, таких как хроническая и патологическая боль, инсульт, балезнь Паркинсона. Растительный лигнан Севанол,  выделенный ранее из темьяна, ингибирует активность изоформ ASIC1a и ASIC3 и оказывает значительное обезболивающее и противовоспалительное действие. Однако, его синтез сложен и содержит много стадий. Проведенные структурно-функциональные исследования позволили минимизировать структуру Севанола с сохранением как анальгетической активности на животных моделях, так и ингибирующее действие на ASIC. На структурном уровне было предсказано наличие сайта связывания Севанола в центральном вестибюле ASIC1a и показана его конкуренция за этот участок связывания с FRRF-амидным пептидом. Разработанные аналоги Севанола оказывали значительное обезболивающее и противовоспалительное действие при различных способах введения - внутривенное или внутримышечное (парентеральные способы), а также интраназальное или пероральное (неинвазивные способы). Разработанные методики синтеза аналогов позволяют уже сегодня начать внедрение этих потенциальных лекарственных средств в практические исследования, так как отсутствие выявленных побочных действий на данный момент и способ действия через желудочно-кишечный тракт являются важными конкурентными преимуществами новых молекул над существующими анальгетическими препаратами. Работа опубликована в журнале Pharmaceuticals (Basel).

Авторы: Осмаков Д.И, Владимиров А.А., Кошелев С.Г, Андреев Я.А., Козлов С.А. – лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН, Белозерова О.А., Кульбитский В.С.- лаборатория химии метаболических путей ИБХ РАН, Чугунов А.О., Ефремов Р.Г. - лаборатории моделирования биомолекулярных систем ИБХ РАН, Паликов В.А., Паликова Ю.А., Шайхутдинова Э.Р., Дьяченко И.А. - лаборатория биологических испытаний ФИБХ РАН, Гвозль А.Н. - ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства"

Впервые определены структуры трех ключевых низкомолекулярных компонентов биолюминесцентной системы морских полихет Odontosyllis undecimdonta: люциферина, оксилюциферина (Green), а также продукта неспецифического окисления люциферина (Pink) кислородом. Установлено, что эти соединения имеют крайне необычный гетероциклический скелет, содержащий три атома серы с различными степенями окисления. Предложены химические механизмы ферментативного (люминесцентного) и неферментативного оксиления люциферина Odontosyllis. Более того, выявлено, что оксилюциферин Odontosyllis является единственным из известных для морских люминесцентных организмов первичным эмиттером зеленого света.

Ученые Института биоорганической химии РАН и ФИЦ Красноярский научный центр СО РАН вместе с российскими и иностранными коллегами полностью описали механизм, позволяющий грибам светиться в темноте. Испускание света обеспечивают всего четыре фермента, перенос которых в любые другие организмы делает их светящимися. Чтобы это проиллюстрировать, авторы создали светящиеся в темноте дрожжи.Теоретическая и экспериментальная части работы поддержаны грантами Российского научного фонда. Результаты исследования опубликованы в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences

Расшифровка механизма свечения грибов стала возможной благодаря многолетним предшествующим исследованиям. Еще в начале XIX века было установлено, что источник свечения гниющего дерева – грибница. В 2009 году Андерсон Оливейра и Кассиус Стевани, соавторы настоящей работы, определилили, что все светящиеся грибы испускают свет благодаря единому механизму, а в 2015-2017 годах российские ученые под руководством Ильи Ямпольского совершили ряд ключевых открытий, в том числе определили структуру люциферина – молекулы, окисление которой приводит к испусканию света.

Мы разработали новый метод мечения целевых белков в живой клетке, названный Protein-PAINT. Метод основан на обратимом связывании белкового домена с флуорогенным красителем, что приводит к многократному увеличению интенсивности его флуоресценции. На основе результатов компьютерного молекулярного докинга, мы получили три мутантных варианта бактериального липокалина Blc с различным сродством к флуорогену. Было показано, что флуороген быстро проникает в живые клетки и вызывает окрашивание целевых белков, слитых с мутантными Blc. Новый метод обеспечивает на порядок большую фотостабильность сигнала, по сравнению с флуоресцентными белками. Protein-PAINT также позволяет проводить долговременную флуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения живых клеток как в режиме детекции одиночных молекул, так и в режиме STED.

Структура паналя, ранее предполагаемого предшественника люциферина грибов, была определена в 1988 году Накамурой и коллегами [Nakamura H, Kishi Y, Shimomura O. Tetrahedron 1988, 44, 1597]. Паналь представляет собой бициклический сесквитерпен кадаланового типа. Нами был осуществлен полный синтез терпенового ядра паналя с использованием реакции Дильс-Альдера, восстановления по Барбье и метатезиса в качестве ключевых превращений.

Впервые определена структура оксилюциферина высших грибов. Предложен уникальный механизм биолюминесценции, включающий в себя отщепление молекулы углекислого газа по схеме ретро-[4+2]-циклоприсоединения. Механизм подтвержден экспериментами с О-18. Также получен ряд аналогов люциферина грибов, обладающих отличающимся спектром биолюминесценции.

На примере зеленого флуоресцентного белка GFP впервые удалось экспериментально определить так называемый “ландшафт приспособленности” целого белка. Уникальный подход, разработанный в ходе работы, позволил соотнести функцию (флуоресценцию) и аминокислотную последовательность для нескольких десятков тысяч случайных мутантных вариантов с выявлением множества эпистатических (влияющих друг на друга) замен. Характеризация ландшафта приспособленности GFP делает возможным компьютерное предсказание свойств новых мутаций во флуоресцентных белках, а также имеет большое значение в различных областях науки, например, молекулярной эволюции и белковой инженерии.

С помощью расчетов возможных путей передачи электрона от возбужденного хромофора GFP к внешним молекулам и последующей экспериментальной проверки этих предположений удалось создать мутантные варианты с нарушением данных путей и, соответственно, повышенной фотостабильностью. Разработанный подход является новым в актуальной проблеме направленного создания фотостабильных вариантов флуоресцентных белков.

Рисунок. (А) Схема ландшафта приспособленности GFP по результатам анализа 51000 мутантов. Последовательность GFP представлена как круг, где каждая колонка соответствует одному аминокислотному остатку. Зеленым обозначены флуоресцентные варианты, черным – нефлуоресцентные. Цифры слева обозначают количество внесенных аминокислотных замен. Сайты с позитивным и негативным эпистатическим влиянием показаны зелеными и черными линиями, соответственно. Схема показывает узость пика ландшафта приспособленности GFP: 3/4 одиночных замен приводит к уменьшению яркости флуоресценции, а половина мутантов с 4-мя заменами полностью теряют флуоресценцию. (Б) Перенос электрона в GFP. Вверху - схема расчетного пути переноса электрона от хромофора на молекулу внешнего акцептора через тирозин-145 в качестве промежуточного акцептора. Внизу – кривые фотообесцвечивания EGFP и его вариантов с заменой тирозина-145 на фенилаланин или лейцин в присутствии окислителя в среде, демонстрирующие многократное увеличение фотостабильности мутантных вариантов благодаря блокировке пути переноса электрона. 

Определена структура оксилюциферина – продукта окислительного декарбоксилирования люциферина червя Fridericia heliota под действием кислорода в присутствии люциферазы. Определен механизм биолюминесценции: он включает стадию активации карбоксильной группы лизина с образованием промежуточного аденилата, циклизацию в оксетанон и распад до возбужденной молекулы оксилюциферина.

Впервые определена структура люциферина биолюминесцентных грибов. Также определен механизм биосинтеза люциферна грибов - гидроксилирование вторичного метаболита грибов гиспидина НАДФ-Н-зависимым ферментом. Люциферин  (3-гидроксигиспидин) является субстратом фермента люциферазы в реакции биолюминесценции. Структуры люциферина и его предшественника доказаны с помощью методов ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Показано, что люциферин является общим субстратом биолюминесценции для ряда высших грибов.