Группа молекулярных меток для оптической наноскопии

Отдел биофотоники

Руководитель: Мишин Александр Сергеевич, к. б. н.
mishin@ibch.ru+7(495)995-55-57#2518

SMLM; smFRET; наноскопия; флуоресцентное мечение

group1.png

 

В Группе ведутся работы по созданию репортерных систем, адаптированных для использования в прижизненной наноскопии. Группа образована в 2018 г.

  • метод Protein-PAINT:  обратимое взаимодействие генетически кодируемого белка-репортера и низкомолекулярного красителя, свободно проникающего через цитоплазматическую мембрану, позволяет достигнуть высокой фотостабильности и плотности мечения целевых структур. Созданы  зеленые, оранжевые,  а также красные пары флуороген-белок, подходящие для методов локализационной микроскопии (SMLM) а также STED

 

  • метод Protein-PAINT / IRES:  полностью генетически кодируемая версия protein-PAINT,  основанная на обратимом взаимодействии коротких пептидов  (K/E-спиралей). Созданная система увеличивает плотность мечения целевых структур при наноскопии в живых клетках
  • спонтанно мигающие флуоресцентные белки и красители
  • метки для STED и RESOLFT
  • люминисцентная микроскопия и имиджинг 

Все публикации (показать избранные)

Загружаются...

Мишин Александр Сергеевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 34, комн. 632
  • Тел.: +7(495)995-55-57#2518
  • Эл. почта: mishin@ibch.ru

К/E-спирали: флуоресцентное мечение белков и наноскопия Protein-PAINT

Совместно с: Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов

Гетеродимеризацию K/E-спиралей впервые применили для флуоресцентного мечения белков в живых клетках. 

Одна из специально подобранных α-спиралей (K или E) служит меткой для целевого белка, а другую помещают на генетически кодируемый флуоресцентный белок. За счет обратимого взаимодействия K и E-спиралей целевая белковая структура окрашивается, а непрерывный обмен флуоресцентных белков в составе комплекса на порядок увеличивает устойчивость к фотообесцвечиванию. 

Небольшой размер меток (всего 2-3 кДа) позволяет сохранить нативную динамику исследуемых белков. Вдобавок, такой метод дает возможность наблюдать белки практически сразу после их синтеза.

Наиболее интересным оказалось применение K/E-спиралей для Protein-PAINT – локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения, основанной на обратимом взаимодействующих метках. Непрерывный обмен флуоресцентных белков между целевой клеточной структурой и цитоплазматическим пулом обеспечивает стабильно высокую плотность мечения даже при продолжительной съемке. С помощью K/E-спиралей впервые удалось воплотить концепцию наноскопии Protein-PAINT с использованием только генетически кодируемых репортеров.

Публикации

  1. Perfilov MM, Gurskaya NG, Serebrovskaya EO, Melnikov PA, Kharitonov SL, Lewis TR, Arshavsky VY, Baklaushev VP, Mishin AS, Lukyanov KA (2020). Highly photostable fluorescent labeling of proteins in live cells using exchangeable coiled coils heterodimerization. Cell Mol Life Sci 77 (21), 4429–4440

Эксимер-FRET каскад в бинарных ДНК-зондах

Совместно с: Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза

Эффективность гибридизационного анализа с помощью флуоресцентных ДНК-зондов зачастую ограничивается низким соотношением сигнал/фон, которое может быть частично преодолено сложными методами усиления сигнала. Глубокое понимание механизмов тушения флуоресценции и передачи энергии в сложных ДНК-зондах, а также выбор оптимальных пар донор/акцептор наряду с рациональным дизайном могут значительно повысить эффективность работы ДНК-зондов. Мы предлагаем новые бинарные FRET-ДНК-зонды с эксимеробразующей пиреновой парой в качестве донора и красителем сульфо-Cy3 в качестве акцептора. Зонды продемонстрировали 75-кратное улучшение флуоресценции сульфо-Cy 3 при гибридизации с мишенью. Стоксов сдвиг 220 нм минимизирует перекрестные помехи. Однофотонный отсчёт времени позволил выявить два возбужденных состояния пиренового эксимера, из которых лишь одно непосредственно участвует в резонансном переносе энергии на сульфо-Cy3. Оптимизированные ДНК-зонды продемонстрировали высокую чувствительность с отличным соотношением сигнал/фон и были применены для визуализации 18S рРНК методом флуоресцентной гибридизации in situ в клетках HEK293T.

В статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology, ученые ИБХ РАН показали возможность создания растений, излучающих собственную видимую люминесценцию. Было обнаружено, что биолюминесценция некоторых грибов метаболически сходна с естественными процессами, характерными для растений. Интегрировав гены биолюминесцентной системы гриба Neonothopanus nambi в геном табака, ученые смогли создать растения, которые светятся намного ярче, чем это было возможно ранее. Созданные трансгенные растения светятся непрерывно на протяжении всего жизненного цикла и могут быть использованы в качестве системы для проведения биоимиджинга. В отличие от других широко используемых биолюминесцентных систем, например, светлячков, для поддержания биолюминесценции грибов не требуются уникальные химические реагенты.

Публикации

  1. Mitiouchkina T, Mishin AS, Somermeyer LG, Markina NM, Chepurnyh TV, Guglya EB, Karataeva TA, Palkina KA, Shakhova ES, Fakhranurova LI, Chekova SV, Tsarkova AS, Golubev YV, Negrebetsky VV, Dolgushin SA, Shalaev PV, Shlykov D, Melnik OA, Shipunova VO, Deyev SM, Bubyrev AI, Pushin AS, Choob VV, Dolgov SV, Kondrashov FA, Yampolsky IV, Sarkisyan KS (2020). Plants with genetically encoded autoluminescence. Nat Biotechnol 38 (8), 944–946

Пространственная организация фотостабильного биомаркера нового типа - DiB1

Совместно с: Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров

Методом рентгеноструктурного анализа c высоким разрешением 1.58Å установлена структура фотостабильного нековалентного комплекса бактериального липокалина Blc c синтетическим хромофором М739 (DiB1:M739).  

Установлены стереохимические детали связывания хромофора и на основе полученных структурных данных осуществлен дизайн двух новых генно-инженерных биомаркеров (зеленого и желтого) с повышенной аффинностью и яркостью.

Созданы новые метки и подходы к низкотоксичному флуоресцентному мечению белков в живых клетках

Совместно с: Группа химии гетероциклических соединений

Ультрафиолет, часто используемый во флуоресцентной микроскопии и наноскопии, чрезвычайно токсичен для клеток. Поэтому предпочтительно использование меток в зеленой и красной области спектра. 

Мы обнаружили способность флуоресцентного белка mAvicFP1 к спонтанному миганию под действием  менее токсичного синего света, и применили это свойство для наноскопии и слежения за одиночными молекулами меченых белков в живых клетках.

Флуороген-активирующие белки - это cистемы мечения нового поколения, состоящие из генетически кодируемого белка и обратимо связывающимся с ним флуорогена, добавляемого извне. Нами создан и применен в живых клетках новый красный флуороген N871b для белка-репортера FAST.