В статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology, ученые ИБХ РАН показали возможность создания растений, излучающих собственную видимую люминесценцию. Было обнаружено, что биолюминесценция некоторых грибов метаболически сходна с естественными процессами, характерными для растений. Интегрировав гены биолюминесцентной системы гриба Neonothopanus nambi в геном табака, ученые смогли создать растения, которые светятся намного ярче, чем это было возможно ранее. Созданные трансгенные растения светятся непрерывно на протяжении всего жизненного цикла и могут быть использованы в качестве системы для проведения биоимиджинга. В отличие от других широко используемых биолюминесцентных систем, например, светлячков, для поддержания биолюминесценции грибов не требуются уникальные химические реагенты.

Ученые Института биоорганической химии РАН и ФИЦ Красноярский научный центр СО РАН вместе с российскими и иностранными коллегами полностью описали механизм, позволяющий грибам светиться в темноте. Испускание света обеспечивают всего четыре фермента, перенос которых в любые другие организмы делает их светящимися. Чтобы это проиллюстрировать, авторы создали светящиеся в темноте дрожжи.Теоретическая и экспериментальная части работы поддержаны грантами Российского научного фонда. Результаты исследования опубликованы в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences

Расшифровка механизма свечения грибов стала возможной благодаря многолетним предшествующим исследованиям. Еще в начале XIX века было установлено, что источник свечения гниющего дерева – грибница. В 2009 году Андерсон Оливейра и Кассиус Стевани, соавторы настоящей работы, определилили, что все светящиеся грибы испускают свет благодаря единому механизму, а в 2015-2017 годах российские ученые под руководством Ильи Ямпольского совершили ряд ключевых открытий, в том числе определили структуру люциферина – молекулы, окисление которой приводит к испусканию света.

Мы разработали новый метод мечения целевых белков в живой клетке, названный Protein-PAINT. Метод основан на обратимом связывании белкового домена с флуорогенным красителем, что приводит к многократному увеличению интенсивности его флуоресценции. На основе результатов компьютерного молекулярного докинга, мы получили три мутантных варианта бактериального липокалина Blc с различным сродством к флуорогену. Было показано, что флуороген быстро проникает в живые клетки и вызывает окрашивание целевых белков, слитых с мутантными Blc. Новый метод обеспечивает на порядок большую фотостабильность сигнала, по сравнению с флуоресцентными белками. Protein-PAINT также позволяет проводить долговременную флуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения живых клеток как в режиме детекции одиночных молекул, так и в режиме STED.

На примере зеленого флуоресцентного белка GFP впервые удалось экспериментально определить так называемый “ландшафт приспособленности” целого белка. Уникальный подход, разработанный в ходе работы, позволил соотнести функцию (флуоресценцию) и аминокислотную последовательность для нескольких десятков тысяч случайных мутантных вариантов с выявлением множества эпистатических (влияющих друг на друга) замен. Характеризация ландшафта приспособленности GFP делает возможным компьютерное предсказание свойств новых мутаций во флуоресцентных белках, а также имеет большое значение в различных областях науки, например, молекулярной эволюции и белковой инженерии.

С помощью расчетов возможных путей передачи электрона от возбужденного хромофора GFP к внешним молекулам и последующей экспериментальной проверки этих предположений удалось создать мутантные варианты с нарушением данных путей и, соответственно, повышенной фотостабильностью. Разработанный подход является новым в актуальной проблеме направленного создания фотостабильных вариантов флуоресцентных белков.

Рисунок. (А) Схема ландшафта приспособленности GFP по результатам анализа 51000 мутантов. Последовательность GFP представлена как круг, где каждая колонка соответствует одному аминокислотному остатку. Зеленым обозначены флуоресцентные варианты, черным – нефлуоресцентные. Цифры слева обозначают количество внесенных аминокислотных замен. Сайты с позитивным и негативным эпистатическим влиянием показаны зелеными и черными линиями, соответственно. Схема показывает узость пика ландшафта приспособленности GFP: 3/4 одиночных замен приводит к уменьшению яркости флуоресценции, а половина мутантов с 4-мя заменами полностью теряют флуоресценцию. (Б) Перенос электрона в GFP. Вверху - схема расчетного пути переноса электрона от хромофора на молекулу внешнего акцептора через тирозин-145 в качестве промежуточного акцептора. Внизу – кривые фотообесцвечивания EGFP и его вариантов с заменой тирозина-145 на фенилаланин или лейцин в присутствии окислителя в среде, демонстрирующие многократное увеличение фотостабильности мутантных вариантов благодаря блокировке пути переноса электрона.