Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации

Руководитель: Кашеверов Игорь Евгеньевич, д. х. н.
iekash@ibch.ru+7(495)995-55-57#2118

лиганд-управляемые ионные каналы, Никотиновый холинорецептор, глициновый рецептор, компьютерное моделирование, конотоксины, синтез пептидных аналогов, радиолигандный анализ

Лаборатория организована в 2009 г. и возглавляется доктором химических наук И. Е. Кашеверовым.

Основными задачами лаборатории лиганд-рецепторных взаимодействий являются структурно-функциональные исследования некоторых Cys-петельных рецепторов (никотиновые, глициновый) с помощью пептидных лигандов природного происхождения и их искусственных аналогов, а также создание новых биологически активных пептидных соединений на основе известных холинергических лигандов.

В лаборатории проводятся работы по компьютерному дизайну новых соединений на базе структур известных холинергических лигандов (конотоксины разных классов) и моделей их комплексов с никотиновыми рецепторами или их гомологами (ацетилхолин-связывающие белки), химическому синтезу различных пептидных соединений и анализу их биологической активности с применением различных методов исследования (радиолигандный анализ, электрофизиология, плазмонный резонанс).

В лаборатории было синтезировано (в том числе и на основе дизайна с применением методов компьютерного моделирования) более 4-х десятков различных конотоксинов и их аналогов, часть из которых в дальнейшем модифицировалась радиоактивными и/или фотоактивируемыми метками. С помощью некоторых из них были структурно охарактеризованы лиганд-связывающие участки природного никотинового рецептора. С использованием другого аналога, оказавшегося более активным соединением, чем природный конотоксин, впервые была установлена кристаллическая структура ацетилхолин-связывающего белка в комплексе с пептидным антагонистом и выявлены ее принципиальные отличия от структуры комплексов с агонистами. Полученные данные стали основой для создания компьютерных моделей различных типов никотиновых холинорецепторов.

Часть представленной работы нашла отражение в недавно опубликованных обзорах: Tsetlin V., Utkin Y., Kasheverov I. (2009). Polypeptide and peptide toxins, magnifying lenses for binding sites in nicotinic acetylcholine receptors. Biochem Pharmacol. 78(7), 720—731 иKasheverov I.E., Utkin Y.N., Tsetlin V.I. (2009). Naturally occurring and synthetic peptides acting on nicotinic acetylcholine receptors. Curr Pharm Des. 15(21), 2430—2452.

Модель комплекса аналога α-конотоксина GI с природным холинорецептором Torpedo: предложены две возможные ориентации пептида в кармане связывания между a- и γ-субъединицами на основании данных метода фотоаффинной модификации. Kasheverov IE, et al. FEBS J. 273(7), 1373—1388 (2006).

 

Все публикации (показать избранные)

Загружаются...

Кашеверов Игорь Евгеньевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 33, комн. 236
  • Тел.: +7(495)995-55-57#2118
  • Эл. почта: iekash@ibch.ru

Предложен и синтезирован новый класс ингибиторов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов

Совместно с: Лаборатория молекулярной токсинологии

На основании  собственных и литературных данных, показывающих, что положительно заряженные аминокислотные остатки играют важную роль в активности α-конотоксинов, синтезирована серия пептидов, построенных исключительно из остатков  аргинина (R) и показано, что олигоаргинины  (R=6-18) являются ингибиторами различных подтипов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР), при этом R8  имеет  выраженную селективность к нейрональным α9/ α10, а R16 имеет наибольшее сродство к α7 нАХР. Ингибирующая активность установлена и у ряда положительно заряженных полимеров, которые, наряду с олигоаргининами используются для внутриклеточной доставки потенциальных лекарственных соединений, что должно учитываться в качестве возможных положительных и отрицательных эффектов.

Публикации

  1. Lebedev D, Kryukova E, Ivanov I, Egorova N, Timofeev N, Spirova E, Tufanova E, Siniavin A, Kudryavtsev D, Kasheverov I, Zouridakis M, Katsarava R, Zavradashvili N, Iagorshvili I, Tzartos S, Tsetlin V (2019). Oligoarginine Peptides, a New Family of nAChR Inhibitors. Mol Pharmacol 96 (5), 664–673

Первый трехпетельный змеиный нейротоксин, различающий по аффинности и кинетике взаимодействия два участка связывания в мышечном никотиновом рецепторе

Совместно с: Лаборатория молекулярной токсинологии

Из яда крайта Bungarus candidus выделен и охарактеризован новый трехпетельный α-нейротоксин - αδ-бунгаротоксин, отличающийся от хорошо известного блокатора мышечных, α7 и α9α10 нейрональных подтипов никотиновых рецепторов α-бунгаротоксина 11 заменами из 74 аминокислотных остатков. Новый токсин также эффективно взаимодействовал с α7 рецептором с наномолярным сродством, но при этом продемонстрировал уникальное для трехпетельных токсинов различие в сродстве к двум разным участкам связывания на мышечном рецепторе (аффинность к α-δ сайту выше чем к α-γ сайту в 20 раз). Кроме того, новый токсин показал быструю кинетику ухода с одного из участков в отличие от необратимого связывания α-бунгаротоксина. Таким образом, открыт новый инструмент исследования мышечных никотиновых рецепторов с уникальным набором свойств.

Публикации

  1. Utkin YN, Kuch U, Kasheverov IE, Lebedev DS, Cederlund E, Molles BE, Polyak IL, Ivanov IA, Prokopev NA, Ziganshin RH, Jornvall H, Alvelius G, Chanhome L, Warrell DA, Mebs D, Bergman T, Tsetlin VI (2019). Novel Long-chain Neurotoxins from Distinguish the Two Binding Sites in Muscle-type Nicotinic Acetylcholine Receptors. Biochem J 476 (8), 1285–1302

Впервые обнаружена молекулярная мишень действия орфанного нейропептида млекопитающих – ноцистатина, связанная с процессами болевой чувствительности.

Совместно с: Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Ноцистатин - эндогенный нейропептид, вырабатываемый нейронами в центральной и периферической нервной системе - до настоящего времени относился к классу сиротских белков, для которых не была явно определена молекулярная мишень действия. В лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН в экспериментах in vitro было показано, что ноцистатин возбуждает мембранные ионные каналы ASIC в нейронах центральной и периферической нервной системы, при этом возникающий ионный ток сопоставим по основным параметрам с тем, который возникает при закислении внеклеточной среды. Пептид способен активировать все подтипы кислото-чувствительных каналов, и его действие является концентрационно зависимым. Антагонисты ASIC ингибируют вызываемый аппликацией ноцистатина ток. Более того, активированные ноцистатином каналы десенсетизируются и теряют способность в дальнейшем реагировать на кислоту, поэтому в низкой дозе пептид ингибирует (подавляет), а в высокой – стимулирует работу каналов ASIC. Этим объясняется его двойственное действие на болевую чувствительность, где он выступает и как генератор болевых сигналов и как тормозящий агент одновременно. Ни один известный ранее лиганд ионных каналов ASIC не имеет подобных свойств.

Таким образом, обнаружен новый лиганд ионных каналов ASIC, физиологическая значимость которого в жизнедеятельности животных и человека ранее никак не ассоциировалась с регулированием работы этого рецептора. Поскольку каналы ASIC, прежде всего, участвуют в возникновении чувства боли, это открытие может послужить для разработки принципиально новых обезболивающих и противовоспалительных лекарств. Помимо этого, каналы ASIC участвуют в процессах, связанных с обучением, памятью и нейропластичностью, что позволяет предположить возможную вовлеченность ноцистатина в процессы регулирования высшей нервной деятельности и нейродегенерации. В этом аспекте изучение таких процессов с измерением и регулированием уровня эндогенного нейропептида – перспективная задача фундаментальных исследований.

Статья с результатами первых экспериментов опубликована в журнале Biomolecules.

Расшифрованы молекулярные основы биолюминесценции Odontosyllis

Совместно с: Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория химии метаболических путей

Впервые определены структуры трех ключевых низкомолекулярных компонентов биолюминесцентной системы морских полихет Odontosyllis undecimdonta: люциферина, оксилюциферина (Green), а также продукта неспецифического окисления люциферина (Pink) кислородом. Установлено, что эти соединения имеют крайне необычный гетероциклический скелет, содержащий три атома серы с различными степенями окисления. Предложены химические механизмы ферментативного (люминесцентного) и неферментативного оксиления люциферина Odontosyllis. Более того, выявлено, что оксилюциферин Odontosyllis является единственным из известных для морских люминесцентных организмов первичным эмиттером зеленого света.

Публикации

  1. Kotlobay AA, Dubinnyi MA, Purtov KV, Guglya EB, Rodionova NS, Petushkov VN, Bolt YV, Kublitski VS, Kaskova ZM, Ziganshin RH, Nelyubina YV, Dorovatovskii PV, Eliseev IE, Branchini BR, Bourenkov G, Ivanov IA, Oba Y, Yampolsky IV, Tsarkova AS (2019). Bioluminescence chemistry of fireworm Odontosyllis. Proc Natl Acad Sci U S A 116 (38), 18911–18916

Характеристика сайтов связывания "анальгетических" конотоксинов на никотиновом рецепторе и его моделях

Синтезирована линейка Cys-Cys изомеров «анальгетических» конотоксинов RgIA и GeXIVA, действующих через орто- или аллостерический сайты связывания α9/α10 никотинового холинорецептора, соответственно. Изучение их методом прямого или конкурентного радиолигандного анализа на водорастворимых моделях этого рецептора – ацетилхолин-связывающем белке и рекомбинантном внеклеточном домене α9 субъединицы рецептора, показало, что они эффективно с микромолярным сродством взаимодействуют только с ортостерическим сайтом связывания этих моделей.

Первые рекомбинантные трехпетельные токсины гадюк – антагонисты никотиновых холинорецепторов мышечного и нейронного типа

Совместно с: Лаборатория молекулярной диагностики,  Отдел «Учебно-научный центр»,  Лаборатория молекулярной токсинологии

Одним из основных компонентов ядов змей семейства Elapidae являются трехпетельные токсины, которые обладают различными видами биологической активности, включая ингибирование синаптической передачи за счет блокирования холинорецепторов никотинового типа. Трехпетельные токсины до сих пор не обнаружены в ядах змей семейства Viperidae, хотя кодирующие их мРНК найдены в ядовитых железах змей этого семейства. Нами впервые проведена экспрессия в клетках E. coli генов двух трехпетельных токсинов TFT-AF и TFT-VN, последовательности которых установлены на основании последовательностей кДНК из ядовитых желез гадюк Azemiops feae и Vipera nikolskii, соответственно. Исследование биологической активности полученных токсинов проведено с помощью методов электрофизиологии, кальциевого имиджинга и радиолигандного анализа. Нами впервые показано, что трехпетельные токсины гадюк являются антагонистами никотиновых холинорецепторов как нейронного, так и мышечного типа.

Дизайн антимикробного пептида с пониженной гемолитической активностью на основе комбинирования фрагментов (мотивов) пептидов из яда пауков. С помощью молекулярной динамики в крупнозернистом приближении оценена глубина проникновения природных пептидов (Ltc1, Oxt 4a) из яда паука в мембрану эритроцитов. Искусственный пептид  (P5) сформирован из фрагментов, не проникающих глубоко в такую мембрану (в круге - см. Рис.), или пептида, глубоко проникающего, и, следовательно, гемолитически активного, но с пониженной за счет аминокислотной замены L/K степенью гидрофобности (в эллипсе).

Разработка новой методики на основе кальциевого имиджинга и функциональная характеристика с ее помощью α7/α9 мутантов нАХР.

Совместно с: Лаборатория молекулярной токсинологии

На основании метода кальциевого имиджинга была разработана новая методика, позволяющая достаточно эффективно экспрессировать в клеточных линиях функционально активные «трудные» подтипы никотиновых рецепторов (нАХР). Методика включает  в себя коэкспресиию с соответствующим подтипом рецептора шаперона и флуоресцентного кальциевого сенсора Case12.  Данная методика позволила получить 6 мутантных форм α7 нАХР с выбранными одиночными заменами аминокислотных остатков из α9 подтипа нАХР. Все полученные мутанты вместе с исходными рецепторами были проанализированы на сродство к ацетилхолину и эпибатидину с помощью разработанной методики. Это позволило выявить две ключевые мутации - L119D и F187S, определяющие селективность к указанным лигандам этих подтипов нАХР. Компьютерное моделирование показало существенное изменение расположение молекул лигандов в участках связывания именно этих двух мутантных форм рецептора, объясняя полученные данные.   

Публикации

  1. Shelukhina I, Spirova E, Kudryavtsev D, Ojomoko L, Werner M, Methfessel C, Hollmann M, Tsetlin V (2017). Calcium imaging with genetically encoded sensor Case12: Facile analysis of α7/α9 nAChR mutants. PLoS One 12 (8), e0181936

Cинтезирован SLURP-1 (81 аминокислотный остаток, 5 дисульфидов), идентичный по аминокислотной последовательности эндогенному белку человека, отличающийся от всех известных рекомбинантных белков по

Совместно с: Лаборатория молекулярной токсинологии

Синтезирован  SLURP-1 (81 аминокислотный остаток, 5 дисульфидов), идентичный по аминокислотной последовательности эндогенному токсино-подобному белку человека. По данным 1Н-ЯМР он имеет ту же структуру, что и рекомбинантный rSLURP-1, несущий дополнительный N-концевой Met0, несколько отличается по молекулярной динамике и существенно по биологической активности в отношении различных подтипов никотиновых рецепторов. То есть необходимо максимальное приближение к структуре природного белка для установления механизмов его эндогенной активности и выбора последующих медицинских применений.

Публикации

  1. Durek T, Shelukhina IV, Tae HS, Thongyoo P, Spirova EN, Kudryavtsev DS, Kasheverov IE, Faure G, Corringer PJ, Craik DJ, Adams DJ, Tsetlin VI (2018). Interaction of Synthetic Human SLURP-1 with the Nicotinic Acetylcholine Receptors. Sci Rep 7 (1), 16606

Открыты первые пептидные лиганды, потенцирующие ответ TRPA1 рецепторов на агонисты, проявляющие обезболивающий и противовоспалительный эффекты.

Совместно с: Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Из морских анемон видов Metridium senile и Urticina eques выделены и охарактеризованы анальгетические пептиды Мs9а-1 и Ueq 12-1. Пептид Мs9а-1 содержит 35 аминокислотных остатков, а его пространственная структура стабилизирована двумя дисульфидными мостиками подобно ранее описанным  пептидам из морских анемон. Ueq 12-1 состоит из 45 аминокислотных остатков, включая 10 остатков цистеина с необычным распределением, образующих 5 дисульфидных связей, и является уникальным среди многообразия известных пептидов морских анемон. Являясь по сути принципиально новой обнаруженной пространственной структурой, пространственная укладка части полипептидной цепи молекулы Ueq 12-1 похожа на альфа дефензины млекопитающих. Возможно, именно поэтому пептид также обладает слабым антимикробным действием на грамм-положительные бактерии. Структурно непохожие друг не друга пептиды Мs9а-1 и Ueq 12-1 имеют схожий механизм действия и одну биологическую мишень. В тестах in vitro на ооцитах лягушки Xenopus laevis и клетках млекопитающих, экспрессирующих рецептор TRPA1, оба пептида усиливали действие прямых агонистов, таких как AITC и диклофенак. В тестах in vivo на мышах введение пептидов внутривенно давало значительный анальгетический и противовоспалительный эффект, при этом сами пептиды при введении не вызывали ни болевых ощущений ни тепловую гиперчувствительность. Обнаруженные эффекты пептидов связаны с тем, что при взаимодействии с TRPA1 пептиды делают рецептор более восприимчивым к распознаванию своих агонистов (потенцирующее действие), таким образом, при появлении эндогенных раздражителей, таких как, например, медиаторы воспаления, происходит десенситизация TRPA1-экспрессирующих нейронов. Способность этих веществ избирательно усиливать активность белка TRPA1 открывает новые возможности фундаментальных исследований и служит основой создания лекарств от боли и воспаления.