Лаборатория молекулярной биоинженерии

Лаборатория, занимающаяся комплексным молекулярно-биологическим исследованием вирусов бактерий (бактериофагов) была основана профессором Вадимом Викторовичем Месянжиновым в 1985 году в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР. В 1994-1997 гг. лаборатория базировалась в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, с 1997 года входит в состав коллектива ИБХ РАН. С 2013 года лабораторию возглавляет Константин Анатольевич Мирошников.

Бактериофаги – наиболее многочисленные существа в природе, их разнообразие оценивается в 1015 таксономических видов. Многие процессы, составляющие ныне классику молекулярной биологии, были детально изучены на бактериофагах в качестве объектов исследования. Возможности лаборатории позволяют проведение полного цикла работ в области генной инженерии: от выбора стратегии клонирования индивидуального гена и его химико-ферментативного синтеза до разработки метода выделения, очистки, полной физико-химической идентификации и исследования биологической активности, масштабирования экспрессии и стадии ферментации. В лаборатории разработан алгоритм исследования бактериофагов с привлечением современных методов геномики, структурной и функциональной протеомики и физико-химических методов определения структуры белков и белковых комплексов.

1. Геномика бактериофагов

С 1999 года лаборатория участвует в международной программе исследования бактериофагов Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) – чрезвычайно распространенная в почве и пресноводных водоемах бактерия, важная компонента в экосистемах. Бактериофаги, регулирующие баланс псевдомонадных популяций, соответственно, играют важную экологическую роль. Псевдомонады – условный патоген, способный вызывать внутрибольничные инфекции. Причём в силу природной и приобретенной антибиотикоустойчивости P.aeruginosa от этих инфекций достаточно сложно избавиться. Поэтому бактериофаги псевдомонад часто рассматриваются как дополнительный, и даже альтернативный метод терапии синегнойных инфекций. В настоящее время известно около 20 таксономических родов бактериофагов, инфицирующих псевдомонады, и их чисто постоянно растет. В зависимости от условий обитания штаммовое разнообразие P. aeruginosa весьма велико, соответственно, видовое разнообразие инфицирующих эти штаммы бактериофагов также открывает большие возможности для исследований. P. aeruginosa служит одним из модельных объектов исследования микробиома озера Байкал. Наша лаборатория участвовала в описании и утверждении родов phiKZ-подобных, KMV-подобных, PB1-подобных, М6-подобных бактериофагов Pseudomonas.

В настоящее время лаборатория ведет крупный проект по изучению и систематизации бактериофагов, инфицирующих сельскохозяйственные патогены. Так, энтеробактерии родов Pectobacterium и Dickeya вызывают черную ножку и мягкогнилостные бактериозы картофеля, которые приносят колоссальный урон картофелеводству. Для развития концепции биологической защиты урожая и контроля патогенов необходимо углубленное понимание генетической организации соответствующих бактериофагов. Секвенирование геномов бактериофагов проводится в сотрудничестве с ЦКП «Геном» ИБХФМ СО РАН (Новосибирск), Лимнологическим институтом СО РАН (Иркутск), Балтийским федеральным университетом им. И. Канта (Калининград), Katholieke Universiteit Leuven (Бельгия).

2. Протеомика бактериофагов. Функциональные белки (рецепторы, ферменты лизиса, шапероны)

Вирусы – мельчайшие представители живой природы, они отличаются небольшим и компактно организованным геномом. Однако до сих пор точная функция не менее трети генов вирусов до сих пор неизвестна. Выявление роли белков и пептидов, кодируемых генами бактериофагов – предмет интереса нашей лаборатории.

Основными объектами протеомных исследований служат ключевые структурные и функциональные белки, осуществляющие инфекционный цикл бактериофага:

  • Рецепторные хвостовые белки. Инфекционный цикл бактериофага начинается со специфического присоединения вируса к поверхности бактерии и активного внедрения вирусной ДНК в цитоплазму. Присоединение осуществляется за счет белков хвостовых шипов и фибрилл бактериофага. Белки хвостовых шипов имеют очень прочные тримерные структуры с оригинальными белковыми фолдами и часто обладают дополнительной ферментативной активностью для разрушения защитных экзополисахаридов бактерий. Изучение ферментативных механизмов, субстратной специфичности и структуры таких белков имеет важное значение как для фундаментального понимания биологии бактериофагов, так и для прикладного применения рекомбинантных белков в белковой инженерии и для борьбы с бактериальными биопленками. Исследования проводятся в сотрудничестве с Институтом органической химии им. Зелинского РАН, Институтом микробиологии им. Виноградского РАН, Институтом биохимии им. Баха РАН, University of Texas Galveston (США), Universidade de Santiago de Compostela (Испания).
  • Цитолитические ферменты (эндолизины). На завершающем этапе инфекционного цикла ферменты бактериофага разрушают хозяйскую клетку, облегчая выход дочернего поколения вирусов. Такие ферменты очень разнообразны по своим свойствам, структуре и субстратной специфичности. Рекомбинантные эндолизины нередко рассматриваются как «энзибиотики», противомикробные препараты для лечения антибиотикоустойчивых разновидностей патогенных бактерий. Исследования проводятся в сотрудничестве с Химическим и Биологическим факультетами МГУ, Институтом кристаллографии РАН, University of Texas ElPaso, Purdue University (США), Katholieke Universiteit Leuven (Бельгия).
  • Молекулярные шапероны. Одна из важнейших проблем рекомбинантных технологий – сложности с получением целевого белка с природной пространственной структурой. Сворачивание полипептидной цепи белка в биологически активную форму (фолдинг) – часто неспонтанный процесс, который требует участия дополнительных факторов. Белки - ассистенты фолдинга, по первому описанному представителю этого класса, называют шаперонами. Хотя бактериофаги, как и все вирусы, зависимы от метаболических систем клетки-хозяина, в ряде фаговых геномов были обнаружены гены, кодирующие шапероны. Вероятно, эти гены были получены бактериофагами в результате горизонтального переноса и приспособлены для своих нужд. Исследование таких белков полезно для понимания механизмов фолдинга, который часто называют «третьей составляющей генетического кода». Также у белков бактериофагов часто встречаются «внутренние шапероны» – энергетически избыточные домены. Помимо быcтрого и спонтанного сворачивания в целевую структуру, такие домены («фолдоны» направляют сворачивание в нужную форму, присоединенную к ним часть полипептидной цепи. Использование шаперонов и фолдонов – привлекательный инструмент белковой инженерии. С его помощью был получен и исследован ряд белков, ранее неспособным к формированию активной структуры при синтезе в бактериальной клетке. Исследования проводятся в сотрудничестве с биологическим факультетом МГУ, Институтом кристаллографии РАН, University of Texas ElPaso (США).

 

3. Практическое применение бактериофагов (медицина, сельское хозяйство)

Россия – одна из немногих стран в мире, где препараты бактериофагов выпускаются промышленно и применяются в практической медицине в качестве антимикробных препаратов. Однако стандарты производства были разработаны более 30 лет назад, и перед изготовителями стоят задачи приведения препаратов в соответствие с современными требованиями, сформулированными научным и медицинским сообществами. Лаборатория молекулярной биоинженерии взаимодействует в разработке составов фаговых коктейлей и технологии производства и контроля с производителем медицинских фагопрепаратов ФГУП НПО «Микроген».

Также привлекательной стратегией представляется применение бактериофагов в сельском хозяйстве для борьбы с бактериозами растений. Взаимодействие в областях диагностики патогенов, подбора бактериофагов и производства препарата сельскохозяйственного назначения происходит с крупным научно-производственным агрохолдингом «Агропарк Рогачёво» (Московская обл.)

Избранные публикации

  1. Arbatsky NP, Shneider MM, Dmitrenok AS, Popova AV, Shagin DA, Shelenkov AA, Mikhailova YV, Edelstein MV, Knirel YA (2018). Structure and gene cluster of the K125 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii MAR13-1452. Int J Biol Macromol 117 (0), 1195–1199
  2. Buth SA, Shneider MM, Scholl D, Leiman PG (2018). Structure and analysis of R1 and R2 pyocin receptor-binding fibers. Viruses 10 (8),
  3. Kasimova AA, Kenyon JJ, Arbatsky NP, Shashkov AS, Popova AV, Shneider MM, Knirel YA, Hall RM (2018). Acinetobacter baumannii K20 and K21 capsular polysaccharide structures establish roles for UDP-glucose dehydrogenase Ugd2, pyruvyl transferase Ptr2 and two glycosyltransferases. Glycobiology  (0),
  4. Sykilinda NN, Nikolaeva AY, Shneider MM, Mishkin DV, Patutin AA, Popov VO, Boyko KM, Klyachko NL, Miroshnikov KA (2018). Structure of an Acinetobacter broad-range prophage endolysin reveals a C-terminal α-helix with the proposed role in activity against live bacterial cells. Viruses 10 (6),
  5. Kurochkina LP, Semenyuk PI, Sykilinda NN, Miroshnikov KA (2018). The unique two-component tail sheath of giant Pseudomonas phage PaBG. Virology 515 (0), 46–51
  6. Olszak T, Shneider MM, Latka A, Maciejewska B, Browning C, Sycheva LV, Cornelissen A, Danis-Wlodarczyk K, Senchenkova SN, Shashkov AS, Gula G, Arabski M, Wasik S, Miroshnikov KA, Lavigne R, Leiman PG, Knirel YA, Drulis-Kawa Z (2017). The O-specific polysaccharide lyase from the phage LKA1 tailspike reduces Pseudomonas virulence. Sci Rep 7 (1), 16302
  7. Kenyon JJ, Shashkov AS, Senchenkova SN, Shneider MM, Liu B, Popova AV, Arbatsky NP, Miroshnikov KA, Wang L, Knirel YA, Hall RM (2017). Acinetobacter baumannii K11 and K83 capsular polysaccharides have the same 6-deoxy-L-talose-containing pentasaccharide K units but different linkages between the K units. Int J Biol Macromol 103 (0), 648–655
  8. Prokhorov NS, Riccio C, Zdorovenko EL, Shneider MM, Browning C, Knirel YA, Leiman PG, Letarov AV (2017). Function of bacteriophage G7C esterase tailspike in host cell adsorption. Mol Microbiol 105 (3), 385–398
  9. Semenyuk PI, Kurochkina LP, Gusev NB, Izumrudov VA, Muronetz VI (2017). Chaperone-like activity of synthetic polyanions can be higher than the activity of natural chaperones at elevated temperature. Biochem Biophys Res Commun 489 (2), 200–205
  10. Popova AV, Lavysh DG, Klimuk EI, Edelstein MV, Bogun AG, Shneider MM, Goncharov AE, Leonov SV, Severinov KV (2017). Novel Fri1‐like viruses infecting Acinetobacter baumannii—vB_AbaP_AS11 and vB_AbaP_AS12— characterization, comparative genomic analysis, and host‐recognition strategy. Viruses 9 (7),
  11. Taylor NMI, Prokhorov NS, Guerrero-Ferreira RC, Shneider MM, Browning C, Goldie KN, Stahlberg H, Leiman PG (2016). Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature 533 (7603), 346–352
  12. Shashkov AS, Kenyon JJ, Senchenkova SN, Shneider MM, Popova AV, Arbatsky NP, Miroshnikov KA, Volozhantsev NV, Hall RM, Knirel YA (2016). Acinetobacter baumannii K27 and K44 capsular polysaccharides have the same K unit but different structures due to the presence of distinct wzy genes in otherwise closely related K gene clusters. Glycobiology 26 (5), 501–508
  13. Molugu SK, Hildenbrand ZL, Morgan DG, Sherman MB, He L, Georgopoulos C, Sernova NV, Kurochkina LP, Mesyanzhinov VV, Miroshnikov KA, Bernal RA (2016). Ring Separation Highlights the Protein-Folding Mechanism Used by the Phage EL-Encoded Chaperonin. Structure 24 (4), 537–546
  14. Semenyuk PI, Orlov VN, Sokolova OS, Kurochkina LP (2016). New GroEL-like chaperonin of bacteriophage OBP Pseudomonas fluorescens suppresses thermal protein aggregation in an ATP-dependent manner. Biochem J 473 (15), 2383–2393
  15. Buth SA, Menin L, Shneider MM, Engel J, Boudko SP, Leiman PG (2015). Structure and biophysical properties of a triple-stranded beta-helix comprising the central spike of bacteriophage T4. Viruses 7 (8), 4676–4706
  16. Kudryashova KS, Chertkov OV, Nikitin DV, Pestov NA, Kulaeva OI, Efremenko AV, Solonin AS, Kirpichnikov MP, Studitsky VM, Feofanov AV (2015). Preparation of mononucleosomal templates for analysis of transcription with RNA polymerase using spFRET.  (0), 395–412
  17. Korneev KV, Arbatsky NP, Molinaro A, Palmigiano A, Shaikhutdinova RZ, Shneider MM, Pier GB, Kondakova AN, Sviriaeva EN, Sturiale L, Garozzo D, Kruglov AA, Nedospasov SA, Drutskaya MS, Knirel YA, Kuprash DV (2015). Structural relationship of the lipid A acyl groups to activation of murine toll-like receptor 4 by lipopolysaccharides from pathogenic strains of Burkholderia mallei, Acinetobacter baumannii, and Pseudomonas aeruginosa. Front Immunol 6 (0), 595
  18. Legotsky SA, Vlasova KY, Priyma AD, Shneider MM, Pugachev VG, Totmenina OD, Kabanov AV, Miroshnikov KA, Klyachko NL (2014). Peptidoglycan degrading activity of the broad-range Salmonella bacteriophage S-394 recombinant endolysin. B SOC CHIM BIOL 107 (0), 293–299
  19. Habann M, Leiman PG, Vandersteegen K, Van den Bossche A, Lavigne R, Shneider MM, Bielmann R, Eugster MR, Loessner MJ, Klumpp J (2014). Listeria phage A511, a model for the contractile tail machineries of SPO1-related bacteriophages. Mol Microbiol 92 (1), 84–99
  20. Shneider MM, Buth SA, Ho BT, Basler M, Mekalanos JJ, Leiman PG (2013). PAAR-repeat proteins sharpen and diversify the type VI secretion system spike. Nature 500 (7462), 350–353
  21. Shirshikov FV (2013). Physicochemical properties of the antitumor ribonucleases.  (0), 32
  22. Shirshikov FV (2013). Evolutionary role of the hydrophobic segment of bacillar ribonucleases.  (0), 31
  23. Shirshikov FV (2013). On the molecular basis of the onconase and barnase cytotoxicity. FEBS J 280 (0), 545–6
  24. Sycheva LV, Shneider MM, Sykilinda NN, Ivanova MA, Miroshnikov KA, Leiman PG (2012). Crystal structure and location of gp131 in the bacteriophage phiKZ virion. Virology 434 (2), 257–264
  25. Kurochkina LP, Semenyuk PI, Orlov VN, Robben J, Sykilinda NN, Mesyanzhinov VV (2012). Expression and functional characterization of the first bacteriophage-encoded chaperonin. J Virol 86 (18), 10103–10111
  26. Browning C, Shneider MM, Bowman VD, Schwarzer D, Leiman PG (2012). Phage pierces the host cell membrane with the iron-loaded spike. Structure 20 (2), 326–339
  27. Aksyuk AA, Kurochkina LP, Fokine A, Forouhar F, Mesyanzhinov VV, Tong L, Rossmann MG (2011). Structural conservation of the myoviridae phage tail sheath protein fold. Structure 19 (12), 1885–1894
  28. Kurochkina LP, Aksyuk AA, Sachkova MY, Sykilinda NN, Mesyanzhinov VV (2009). Characterization of tail sheath protein of giant bacteriophage φKZ Pseudomonas aeruginosa. Virology 395 (2), 312–317
  29. Ceyssens PJ, Miroshnikov K, Mattheus W, Krylov V, Robben J, Noben JP, Vanderschraeghe S, Sykilinda N, Kropinski AM, Volckaert G, Mesyanzhinov V, Lavigne R (2009). Comparative analysis of the widespread and conserved PB1-like viruses infecting Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol 11 (11), 2874–2883
  30. Aksyuk AA, Leiman PG, Shneider MM, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (2009). The Structure of Gene Product 6 of Bacteriophage T4, the Hinge-Pin of the Baseplate. Structure 17 (6), 800–808
  31. Lecoutere E, Ceyssens PJ, Miroshnikov KA, Mesyanzhinov VV, Krylov VN, Noben JP, Robben J, Hertveldt K, Volckaert G, Lavigne R (2009). Identification and comparative analysis of the structural proteomes of φKZ and EL, two giant Pseudomonas aeruginosa bacteriophages. Proteomics 9 (11), 3215–3219
  32. Aksyuk AA, Leiman PG, Kurochkina LP, Shneider MM, Kostyuchenko VA, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (2009). The tail sheath structure of bacteriophage T4: A molecular machine for infecting bacteria. EMBO J 28 (7), 821–829
  33. Fokine A, Miroshnikov KA, Shneider MM, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (2008). Structure of the bacteriophage φKZ lytic transglycosylase gp144. J Biol Chem 283 (11), 7242–7250
  34. Ceyssens PJ, Mesyanzhinov V, Sykilinda N, Briers Y, Roucourt B, Lavigne R, Robben J, Domashin A, Miroshnikov K, Volckaert G, Hertveldt K (2008). The genome and structural proteome of YuA, a new Pseudomonas aeruginosa phage resembling M6. J Bacteriol 190 (4), 1429–1435
  35. Fokine A, Battisti AJ, Bowman VD, Efimov AV, Kurochkina LP, Chipman PR, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (2007). Cryo-EM Study of the Pseudomonas Bacteriophage φKZ. Structure 15 (9), 1099–1104
  36. Leiman PG, Shneider MM, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (2006). Evolution of Bacteriophage Tails: Structure of T4 Gene Product 10. J Mol Biol 358 (3), 912–921
  37. Kurochkina LP, Vishnevskiy AY, Zhemaeva LV, Sykilinda NN, Strelkov SV, Mesyanzhinov VV (2006). Structure, stability, and biological activity of bacteriophage T4 gene product 9 probed with mutagenesis and monoclonal antibodies. J Ultrastruct Mol Struct Res 154 (2), 122–129
  38. Hertveldt K, Lavigne R, Pleteneva E, Sernova N, Kurochkina L, Korchevskii R, Robben J, Mesyanzhinov V, Krylov VN, Volckaert G (2005). Genome comparison of Pseudomonas aeruginosa large phages. J Mol Biol 354 (3), 536–545
  39. Fokine A, Kostyuchenko VA, Efimov AV, Kurochkina LP, Sykilinda NN, Robben J, Volckaert G, Hoenger A, Chipman PR, Battisti AJ, Rossmann MG, Mesyanzhinov VV (2005). A three-dimensional cryo-electron microscopy structure of the bacteriophage φKZ head. J Mol Biol 352 (1), 117–124
  40. Kostyuchenko VA, Chipman PR, Leiman PG, Arisaka F, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (2005). The tail structure of bacteriophage T4 and its mechanism of contraction. Nat Struct Mol Biol 12 (9), 810–813
  41. Fokine A, Leiman PG, Shneider MM, Ahvazi B, Boeshans KM, Steven AC, Black LW, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (2005). Structural and functional similarities between the capsid proteins of bacteriophages T4 and HK97 point to a common ancestry. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (20), 7163–7168
  42. Leiman PG, Chipman PR, Kostyuchenko VA, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (2004). Three-dimensional rearrangement of proteins in the tail of bacteriophage T4 on infection of its host. Cell 118 (4), 419–429
  43. Fokine A, Chipman PR, Leiman PG, Mesyanzhinov VV, Rao VB, Rossmann MG (2004). Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4. Proc Natl Acad Sci U S A 101 (16), 6003–6008
  44. Rossmann MG, Mesyanzhinov VV, Arisaka F, Leiman PG (2004). The bacteriophage T4 DNA injection machine. Curr Opin Struct Biol 14 (2), 171–180
  45. Leiman PG, Kanamaru S, Mesyanzhinov VV, Arisaka F, Rossmann MG (2003). Structure and morphogenesis of bacteriophage T4. Cell Mol Life Sci 60 (11), 2356–2370
  46. Lavigne R, Burkaltseva MV, Robben J, Sykilinda NN, Kurochkina LP, Grymonprez B, Jonckx B, Krylov VN, Mesyanzhinov VV, Volckaert G (2003). The genome of bacteriophage φKMV, a T7-like virus infecting Pseudomonas aeruginosa. Virology 312 (1), 49–59
  47. Leiman PG, Shneider MM, Kostyuchenko VA, Chipman PR, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (2003). Structure and location of gene product 8 in the bacteriophage T4 baseplate. J Mol Biol 328 (4), 821–833
  48. Boudko SP, Londer YY, Letarov AV, Sernova NV, Engel J, Mesyanzhinov VV (2002). Domain organization, folding and stability of bacteriophage T4 fibritin, a segmented coiled-coil protein. 269 (3), 833–841
  49. Kanamaru S, Leiman PG, Kostyuchenko VA, Chipman PR, Mesyanzhinov VV, Arisaka F, Rossmann MG (2002). Structure of the cell-puncturing device of bacteriophage T4. Nature 415 (6871), 553–557
  50. Mesyanzhinov VV, Robben J, Grymonprez B, Kostyuchenko VA, Bourkaltseva MV, Sykilinda NN, Krylov VN, Volckaert G (2002). The genome of bacteriophage φKZ of Pseudomonas aeruginosa. J Mol Biol 317 (1), 1–19
  51. Leiman PG, Kostyuchenko VA, Shneider MM, Kurochkina LP, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (2000). Structure of bacteriophage T4 gene product 11, the interface between the baseplate and short tail fibers. J Mol Biol 301 (4), 975–985
  52. Kostyuchenko VA, Navruzbekov GA, Kurochkina LP, Strelkov SV, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG (1999). The structure of bacteriophage T4 gene product 9: The trigger for tail contraction. Structure 7 (10), 1213–1222
  53. Poglazov BF, Efimov AV, Marco S, Carrascosa J, Kuznetsova TA, Aijrich LG, Kurochkina LP, Mesyanzhinov VV (1999). Polymerization of bacteriophage T4 tail sheath protein mutants truncated at the C-termini. J Ultrastruct Mol Struct Res 127 (3), 224–230
  54. Watkins SJ, Mesyanzhinov VV, Kurochkina LP, Hawkins RE (1997). The 'adenobody' approach to viral targeting: Specific and enhanced adenoviral gene delivery. Gene Ther 4 (10), 1004–1012

Мирошников Константин Анатольевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 33, комн. 526
  • Тел.: +7(495)3355588
  • Эл. почта: Kmi@bk.ru