Отдел молекулярной биологии и биотехнологии растений

Основными целями исследований отдела являются точная и своевременная диагностика фитопатогенов – составление репрезентативных коллекций патогенов, определение уникальных маркерных последовательностей ДНК, применение метода ПЦР, в том числе в количественном варианте (ПЦР в реальном времени), выделение и исчерпывающая характеризация бактериофагов и противомикробных пептидов, поражающих типичные фитопатогены, идентификация и функциональный анализ белков ядра и микроРНК, участвующих в ответе на стрессы, а также изучение их взаимодействия с белками патогенов, генов формирования древесины, ксилогенеза,метаболизма азота, редактирование генома растений с помощью CRISPR/Cas-технологии и разработка систем экспрессии рекомбинантных белков в растениях для получения экологически безопасных биотехнических растений с улучшенными потребительскими и агротехническими свойствами, повышения их устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам. В отделе реализуются темы ГЗ №№ 0101-2019-0005 и № 0101-2019-0037.

В отделе ведутся фундаментальные и прикладные исследования, результаты которых в перспективе можно будет применить в современном сельском хозяйстве, а именно:

  • Поиск ключевых белков и пептидов (с использованием методов протеомного анализа и изучения белок-белковых взаимодействий), контролирующих устойчивость растений к комплексным стрессам, вызываемым экологическими стрессами, вирусами и другими патогенами растений. Редактирование генома растений.
  • Разработка методов идентификации патогенов растений на основе ДНК-маркеров.Разработка биопрепаратов нового поколения для защиты растений от болезней и вредителей на основе пептидов растений и пауков. Изучение генетического разнообразия и молекулярных механизмов патогенеза токсигенных грибов рода Fusarium.
  • Геномика и протеомика бактериофагов как факторов контроля численности фитопатогенов.

 

Все публикации (показать избранные)

Завриев Сергей Кириакович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. БОН, комн. 405
  • Тел.: +7(495)995-55-57#2044
  • Эл. почта: szavriev@ibch.ru

Роль протеома и пептидома растений в ответе на стрессовые факторы

Лаборатория функциональной геномики и протеомики растений

Стрессовые факторы оказывают значительное влияние на растительный протеом и пептидом. Мы показали, что заражение картофеля вирусом Y в условиях теплового стресса вызывает значительные изменения протеома растений и приводит к снижению представленности ферментов метионинового цикла. Кроме того, деградация белков в стрессовых условиях также приводит к существенному изменению пула эндогенных пептидов. Одним из основных источников таких пептидов является хлоропластный протеом, подвергающийся активному ремоделированию в стрессовых условиях. Функции образующихся пептидов, могут быть связаны с регуляцией ответа растений на стрессовые факторы. Растения используют множество пептидных сигналов для регуляции иммунного ответа. Однако, их происхождение и эволюция еще слабо изучены. Мы идентифицировали гены секретируемых пептидов в геномах бриофитов и обнаружили, что паттерны иммунных пептидов отличаются у разных филогенетических групп. Специфичные для покрытосеменных регуляторные иммунные пептиды вызывают ответ на уровне АФК у мха P. patens.

Получение и анализ колонизированных сельскохозяйственных растений с повышенной устойчивостью к стрессовым факторам

Лаборатория биотехнологии растений

Показан положительный эффект колонизации растений томата (Lucopersicon esculentum Mill.) и табака (Nicotiana tabacum L.), бактериями Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter baumannii, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas putida, Methylovorus mays. У колонизированных растений повышалась скорость роста, урожайность и адаптационные способности. Впервые получены трансгенные растения рапса (Brassica napus), экспрессирующие антибактериальный пептид cecP1 и колонизированные ассоциативными микроорганизмами Pseudomonas aureofaciens или Methylovorus mesophilicum. Такой подход позволил повысить скорость роста по сравнению с трансгенными растениями и продемонстрировал повышенные адаптационные способности к неблагоприятным условиям. Созревание урожая семян колонизированного трансгенного рапса происходило быстрее, чем у трансгенных неколонизированных растений. Апробируется новый подход к более эффективному подбору колонизирующих микроорганизмов с учетом предварительной оценки их потенциальных симбиотических способностей, основанной на биоинформационном анализе бактериального генома. Наличие определенных генов в бактериях позволяет заранее предполагать их симбиотический потенциал. Принималось участие в анализе геномов бактерий из семейства Microbacteriaceae, образующих ассоциативные симбиотические сообщества с растениями и почвенных бактерий рода Achromobacter, способных метаболизировать глифосат и схожие фосфорорганические соединения в почве.

Показано сравнение устойчивости трансгенных колонизированных растений рапса по сравнению с контрольными.

Публикации

  1. Pigoleva SV, Zakharchenko NS, Furs OV, Tarlachkov SV, Funtikova TV, Filonov AE, Aripovskii AV, Dyachenko OV, Buryanov YI, Shevchuk TV (2020). Effects of Associative Microorganisms on Plant Growth and Resistance to Xenobiotics and Phytopathogens. APPL BIOCHEM MICRO+ 56 (4), 473–482

Молекулярные механизмы действия сократительных «нанопружин»

Лаборатория молекулярной биоинженерии

Хвосты бактериофагов морфотипа Myoviridae, пиоцины R-типа и бактериальные системы секреции типа 6 представляют собой сложные «молекулярные пружины». Эти многобелковые комплексы специфически распознают рецепторы на поверхности бактерии и, сокращаясь, протыкают ее клеточную стенку. С разрешением 3.5 A определена структура пиоцина R2 с реконструкцией конформационных перестроений, сопровождающих сокращение. Связывание хвостовых комплексов с поверхностью клетки часто сопровождается ферментативной модификацией рецептора, что обеспечивает необратимую адсорбцию. Для ряда бактериофагов Pectobacterium методом ЯМР показано, что адсорбция сопровождается деацетилированием боковых цепей О-полисахарида.

Публикации

  1. Shneider MM, Lukianova AA, Evseev PV, Shpirt AM, Kabilov MR, Tokmakova AD, Miroshnikov KK, Obraztsova EA, Baturina OA, Shashkov AS, Ignatov AN, Knirel YA, Miroshnikov KA (2020). Autographivirinae Bacteriophage Arno 160 Infects Pectobacterium carotovorum via Depolymerization of the Bacterial O-Polysaccharide. Int J Mol Sci 21 (9),
  2. Ge P, Scholl D, Prokhorov NS, Avaylon J, Shneider MM, Browning C, Buth SA, Plattner M, Chakraborty U, Ding K, Leiman PG, Miller JF, Zhou HZ (2020). Action of a minimal contractile bactericidal nanomachine. Nature 580 (7805), 658–662
  3. Lukianova AA, Shneider MM, Evseev PV, Shpirt AM, Bugaeva EN, Kabanova AP, Obraztsova EA, Miroshnikov KK, Senchenkova SN, Shashkov AS, Toschakov SV, Knirel YA, Ignatov AN, Miroshnikov KA (2020). Morphologically Different Pectobacterium brasiliense Bacteriophages PP99 and PP101: Deacetylation of O-Polysaccharide by the Tail Spike Protein of Phage PP99 Accompanies the Infection. Front Microbiol 10, 3147

Роль протеома и пептидома растений в ответе на стрессовые факторы

Стрессовые факторы оказывают значительное влияние на растительный протеом и пептидом. Мы показали, что заражение картофеля вирусом Y в условиях теплового стресса вызывает значительные изменения протеома растений и приводит к снижению представленности ферментов метионинового цикла. Кроме того, деградация белков в стрессовых условиях также приводит к существенному изменению пула эндогенных пептидов. Одним из основных источников таких пептидов является хлоропластный протеом, подвергающийся активному ремоделированию в стрессовых условиях. Функции образующихся пептидов могут быть связаны с регуляцией ответа растений на стрессовые факторы. Растения используют множество пептидных сигналов для регуляции иммунного ответа. Однако, их происхождение и эволюция еще слабо изучены. Мы идентифицировали гены секретируемых пептидов в геномах бриофитов и обнаружили, что паттерны иммунных пептидов отличаются у разных филогенетических групп. Специфичные для покрытосеменных регуляторные иммунные пептиды вызывают ответ на уровне АФК у мха P. patens.

 

Создание интрагенных растений картофеля, проявляющих устойчивость к вирусу PVY вследствие целевого нокдауна семейства генов факторов инициации трансляции eIF4E

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений

РНК вирусы растений для трансляции собственной РНК в растительных клетках рекрутируют факторы трансляции своих хозяев. Создание дефицита определенных факторов инициации трансляции, является одним из способов защиты растений от вирусной инфекции. Посредством RNAi регуляции экспрессии семейства генов, кодирующих факторы eIF4E, а именно благодаря 6-10 кратному снижению экспрессии гомологов SteIF4E1 и SteIF4E2, удалось существенно понизить восприимчивость растений картофеля к заражению PVY, считающимся самым вредоносным вирусом картофеля. Встраиваемая в геном картофеля hpRNAi кассета состояла только из регуляторных последовательностей (промотор, интрон, терминатор) и участков генома (инвертированные фрагменты SteIF4E1) картофеля, что позволило получить интрагенные растения, не содержащие какие-либо маркерные или селективные последовательности вирусного/бактериального происхождения. Для достижения устойчивости использовали тканеспецифичный промотор StLhca3 картофеля, обеспечивающий интерференционную активность преимущественно в листьях (являются основной мишенью для вируса), благодаря чему удалось избежать негативного эффекта «выключения» eIF4E генов на жизнедеятельность растений и клубнеобразование картофеля.

Разработка растительной экспрессионной системы дляполучения рекомбинантного артемизинина с использованием методовсинтетической биологии.

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений

Артемизинин – терпеновый лактон, содержащийся в растении полынь однолетняя (Artemisia annua) и обладающий высокой антималярийной активностью. В настоящее время комбинированные с артемизинином лекарственные средства являются наиболее эффективными препаратами для лечения малярии, использование таких препаратов является стандартом лечения во всем мире. Целью исследования являлось получение растений хризантемы, трансформированных генами пути биосинтеза артемизинина и анализ накопления рекомбинантного артемизинина в полученных растениях.

В результате агробактериальной трансформации были получены трансгенные линии с генами биосинтеза артемизинина. Таким образом, нами впервые в растениях хризантем был реконструирован биосинтетический путь артемизинина. В результате масс-спектрометрического анализа показано его накопление в листовых тканях трансгенных растений. Полученные результаты будут использованы в дальнейших исследованиях по разработке гетерологичных экспрессионных систем для производства артемизинина и других небелковых веществ.

В статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology, ученые ИБХ РАН показали возможность создания растений, излучающих собственную видимую люминесценцию. Было обнаружено, что биолюминесценция некоторых грибов метаболически сходна с естественными процессами, характерными для растений. Интегрировав гены биолюминесцентной системы гриба Neonothopanus nambi в геном табака, ученые смогли создать растения, которые светятся намного ярче, чем это было возможно ранее. Созданные трансгенные растения светятся непрерывно на протяжении всего жизненного цикла и могут быть использованы в качестве системы для проведения биоимиджинга. В отличие от других широко используемых биолюминесцентных систем, например, светлячков, для поддержания биолюминесценции грибов не требуются уникальные химические реагенты.

Публикации

  1. Mitiouchkina T, Mishin AS, Somermeyer LG, Markina NM, Chepurnyh TV, Guglya EB, Karataeva TA, Palkina KA, Shakhova ES, Fakhranurova LI, Chekova SV, Tsarkova AS, Golubev YV, Negrebetsky VV, Dolgushin SA, Shalaev PV, Shlykov D, Melnik OA, Shipunova VO, Deyev SM, Bubyrev AI, Pushin AS, Choob VV, Dolgov SV, Kondrashov FA, Yampolsky IV, Sarkisyan KS (2020). Plants with genetically encoded autoluminescence. Nat Biotechnol 38 (8), 944–946

Изучена структуры и функций сенсора щелочи IRR с помощью панели моноклональных антител

Группа молекулярной физиологии,  Лаборатория молекулярной диагностики,  Лаборатория клеточной биологии рецепторов

-Получены шесть мышиных моноклональных антител против рекомбинантного эктодомена IRR.

-Определены  сайты связывания полученных антител с IRR. 

-Показано, что антитело 4D5 способно активировать IRR при нейтральном значении рН, а антитело 4С2 ингибирует активацию IRR щелочной средой. 

Проведенное исследование является первым описанием объектов белковой природы, способных регулировать активность сиротского рецептора IRR, а также подтверждает, что активация щелочной средой является неотъемлемым свойством этой рецепторной тирозинкиназы.

Создание безмаркерных растений томата с тканеспецифичной экспрессией гетерологичного целевого белка на основе системы рекомбинации и оригинального промотора.

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений

Клонирован и детально  изучен светоиндуцибельный плодоспецифичный промотор томата ELIP, использованный в дальнейшем для создания безмаркерных цисгенных растений томата на основе системы рекомбинации MF1 с плодоспецифической экспрессией гетерологичного белка тауматина

Короткие рамки считывания кодируют регуляторные микробелки у растений

Лаборатория функциональной геномики и протеомики растений

В организмах живых существ есть небольшие участки ДНК размером до 300 пар нуклеотидов, которые могут потенциально кодировать маленькие белки. Короткие рамки считывания найдены в ДНК всех организмов, однако их обычно отбрасывают при биоинформатическом анализе генома. Это приводит к тому, что кодирующий потенциал геномов остается неизученным, а биологическая роль продуктов считывания этих коротких рамок зачастую недооценивается. Мы обнаружили приблизительно 70 тысяч маленьких рамок считывания на различных типах молекул РНК модельного растения — мох Physcomitrella patens. Более 5000 из них оказались консервативными, то есть мало изменявшимися в процессе эволюции у всех организмов, поэтому они встречались не только у мха. Для поиска транслирующихся коротких рамок был использован масс-спектрометрический анализ. После жесткой фильтрации, для дальнейшего анализа использовали 46 транслирующихся рамок, находящихся на разных типах РНК, включая длинные некодирующие РНК. По некоторым коротким рамкам были получены мутантные линии со сверхэкспрессией или нокаутом пептидов. Оказалось, что выбранные для проверки микробелки участвуют в регуляции развития и роста мха. При «выключении» найденных генов, например отвечающих за синтез пептидов psep3 и psep25, наблюдалось снижение роста растения, а их избыточная работа приводила к разнообразным внешним эффектам или появлению новых гаметофоров — частей, несущих половые органы. В настоящее время научный интерес к теме начал стремительно расти, особенно из-за того, что причина некоторых заболеваний человека лежит в нарушении альтернативных рамок считывания.

Публикации

  1. Fesenko I, Kirov I, Kniazev A, Khazigaleeva R, Lazarev V, Kharlampieva D, Grafskaia E, Zgoda V, Butenko I, Arapidi G, Mamaeva A, Ivanov V, Govorun V (2019). Distinct types of short open reading frames are translated in plant cells. Genome Res 29 (9), 1464–1477

Получение и анализ безмаркерных масличных растений Camelina sativa, экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина Р1

Лаборатория биотехнологии растений

Получены и исследованы безмаркерные масличные трансгенные растения камелины (Camelina sativa (L.) Crantz), с синтетическим геном антимикробного пептида цекропина Р1 под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Для трансформации растений был использован агробактериальный бинарный вектор, не содержащий селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Скрининг безмаркерных трансформантов проводили по детектированию цекропина Р1 по его антибактериальной активности и с помощью иммуноферментного анализа. Полученные растения проявляют повышенную устойчивость к инфекции бактерией Erwinia carotovora, грибом Fusarium graminearum и к окислительному стрессу в условиях заражения. Анализ жирнокислотного состава семян нетрансгенных и трансгенных линий камелины, экспрессирующих ген сесР1, показал повышенное количество α-линоленовой кислоты по сравнению с семенами немодифицированных растений. Полученные растения перспективны для использования в сельскохозяйственной биотехнологии.

Разнообразие родопсинов в культивируемых микроорганизмах семейства Geodermatophilaceae, ассоциированных с неводными местами обитания

Лаборатория биотехнологии растений

Обнаружено большое количество различных родопсинов в культивируемых бактериях, выделенных из жарких и засушливых экологических ниш. Всего выявлен 31 ген родопсина в 51 проанализированном геноме штаммов, принадлежащих к семейству Geodermatophilaceae. В целом, 88% штаммов, несущих родопсины, выделены из неводных сред. Было обнаружено, что 82% штаммов, принадлежащих к роду Geodermatophilus, имеют по меньшей мере один ген по сравнению с 38% штаммов других родов, которые содержат родопсины. Анализ ключевых аминокислот выявил две группы изучаемых белков: DTE (предположительно протонный насос) и NDQ (предположительно натриевый насос). Протонные насосы были разделены на две подгруппы (DTEW и DTEF) в соответствии с филогенетическим анализом и наличием высококонсервативного триптофана или фенилаланина в положении 182. Среди всех изученных родопсинов подтип DTEF является наиболее уникальным, и обнаружен только в этом семействе.

На рисунке показано филогенетическое дерево белковых последовательностей родопсинов, обнаруженных у бактерий семейства Geodermatophilaceae.

Публикации

  1. Tarlachkov SV, Shevchuk TV, Montero-Calasanz MDC, Starodumova IP (2019). Diversity of rhodopsins in cultivated bacteria of the family Geodermatophilaceae associated with non-aquatic environments. Bioinformatics 36 (6), 1668–1672

Кластер дифференциально экспрессируемых белков метионинового цикла в сортах картофеля, контрастных в ответе на комбинированный стресс

Лаборатория функциональной геномики и протеомики растений,  Лаборатория молекулярных основ стрессоустойчивости растений

Сравнительный количественный протеомный анализ сортов картофеля Гала и Чикаго, контрастных в ответе на биотический стресс (инфекция Y вирусом картофеля, YВК) и абиотический тепловой стресс (повышение температуры до 28°С) выявил кластер дифференциально экспрессируемых белков-участников метионинового цикла. Известно, что метилирование РНК/ДНК является важным фактором, влияющим на устойчивость растений к вирусной инфекции и возможно, толерантность к абиотическим стрессам.

В растениях восприимчивого сорта Чикаго снижено количество пяти белков (на схеме выделены зеленым цветом), участвующих в процессе метилирования. Напротив, в растениях устойчивого сорта Гала увеличено количество цистатион β-лиазы и SAM метилтрансферазы (на схеме отмечены красным цветом), участвующих в превращении S-аденозилметионина - донора метильной группы. Проанализированы уровни экспрессии генов некоторых из белков метионинового цикла методом количественной ПЦР в реальном времени. Сравнение полученных данных с результатами протеомного анализа показало, что снижение количества белков метионинового цикла у восприимчивого сорта Чикаго происходит на трансляционном, а не на транскрипционном уровне. Предположено, что воприимчивость к стрессам растений картофеля сорта Чикаго может быть связано с пониженным уровнем белков, участвующих в метилировании.

Испытание на лабораторных животных рекомбинантного вакцинного белка М2е-RTB, полученного в растениях Ряски малой.

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений

В соответствии с планом научно-исследовательской работы в 2018г был проведен молекулярно-биологический анализ растений ряски малой, и впервые получены линии ряски – продуценты рекомбинантного вакцинного белка М2е-RTB. Полученным в растениях Ряски рекомбинантным белком М2е-RTB орально иммунизировали мышей, показана индукция антител к пептиду М2е вируса гриппа птиц.

«Разработка систем синтеза рекомбинантных белков на основе растительных экспрессионных платформ (биофарминг)». № 01201352434

Hовый антивирусный механизм растений, основанный на взаимодействии субъядерных структур и вирусного белка.

Лаборатория функциональной геномики и протеомики растений,  Лаборатория молекулярных основ стрессоустойчивости растений

Ядрышки и тельца Кахаля (ТК) являются суб-ядерными доменами с хорошо известными ролями в метаболизме РНК и сборке РНК-белковых комплексов. Однако эти структуры также участвуют и в других важных аспектах функционирования клетки. В сотрудничестве с Институтом имени Джеймса Хаттона (Великобритания) описан ранее неизвестный механизм, с помощью которого эти структуры и их компоненты регулируют защитный ответ растения на атаку патогена. Показано, что основные белки ТК - коилин и ядрышка - фибрилларин взаимодействуют с поли(АДФ-рибозо)полимеразой (PARP) и модифицируют ее функцию, а это взаимодействие модулируется белком 16К вируса погремковости табака.

Наши результаты демонстрируют, что PARP - ядерный белок, который модифицирует функцию и субклеточную локализацию различных ядерных «целевых» белков (акцепторов) путем присоединения к ним цепей АДФ-рибозы (PAR). Для ре-активации целевых белков, PARP перемещает их из ядрышка и хроматина в ТК для удаления и рециркуляции PAR (рис.1a). При заражении вирусом погремковости табака (TRV) растение запускает защитные ответы, включающие избыточное накопление активных форм кислорода (ROS), увеличения уровня транскриптов PR-1a (патоген-ассоциированного белка, PR) и отложение каллозы (маркеры противовирусного защитного ответа). В ходе вирусной инфекции белок 16К синтезируется в цитоплазме и нацеливается на ядро клетки (рис.1б).  В ядре (ТК и нуклеоплазме) вирусный белок 16К взаимодействует с коилином и релокализует его в ядрышко, что, в свою очередь приводит к задержке PARP в данном субъядерном домене, предотвращая его перемещение из ядрышка в ТК для удаления и рециркуляции PAR. Это приводит к избыточному накоплению PAR/модифицированных PAR белков и значительному усилению защитных реакций растения, таких как экспрессия гена PR-1a и отложение каллозы. По-видимому, отложение каллозы напрямую ограничивает транспорт вируса во вновь образованные листья (рис. 1в).

Выявление новых таксонов в составе рода Fusarium c использованием комплексного подхода

Лаборатория молекулярной диагностики

Был проведён комплексный анализ таксономического статуса и характеристик ряда коллекционных штаммов грибов рода Fusarium. Применение мультилокусного филогенетического анализа, морфологической характеристики и исследование токсинообразования позволили обнаружить ряд культур, предположительно представляющих собой новые, ранее не охарактеризованные виды. Наиболее ярким примером такого штамма является штамм F-846, первоначально идентифицированный как F.poae. Он формировал отдельную ветвь на филогенетических деревьях, построенных с использованием последовательностей 5 маркерных генов. Исследование с использованием методов ВЭЖХ продемонстрировало, что штамм F-846 способен к синтезу ДОН и его ацетилированных производных. Микроскопический анализ подтвердил, что данный штамм, по всей видимости, представляет собой новый вид рода Fusarium.

Раннее выявление и идентификация основных грибных фитопатогенов для оценки резистентности новых генотипов лесных древесных растений

Группа лесной биотехнологии

Растущее значение лесных плантаций повышает спрос на устойчивые к фитопатогенам формы лесных древесных растений. В данной работе описан эффективный метод раннего выявления и идентификации основных грибных фитопатогенов в посадочном материале березы повислой (Betula pendula) и березы пушистой (B. pubescens) на основе оценки размеров внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) в кластере генов рДНК 18S-5.8 S-28S, видоспецифичных для большинства микромицетов. Электрофоретический анализ локусов ITS1 и ITS2 позволил выявить преобладающие фитопатогенные виды грибов березы пушистой и повислой in planta. Этот новый молекулярно-генетический метод может быть использован для скрининга генотипов березы и других лесных древесных растений на наличие различных грибных патогенов при оценке устойчивости к болезням. Эта информация может оказаться полезной при селекции новых генотипов лесных древесных растений, в том числе трансгенных клонов с измененным составом древесины. На рисунке приведен пример двух компьютерных электрофореграмм с несколькими пиками, соответствующими фрагментам ДНК (ампликонам) полученных с образцов ДНК инфицированных листьев (А) и стеблей (В) березы повислой. Каждый пик соответствует определенному фитопатогену. Фрагменты ДНК получены при ПЦР с использованием праймеров ITS1-ITS2 и последующим разделением капиллярным гель-электрофорезом с использованием ABI Prism 310 Genetic Analyzer. Коричневые пики представляют собой фрагменты ДНК стандарта размера GeneScan™ 500 LIZ™.

Устойчивость растений, экспрессирующих ген антимикробного пептида бомбинина, к фитопатогенам

Лаборатория биотехнологии растений

Получены и исследованы трансгенные растения с искусственным геном антимикробного пептида бомбинина. Растения проявляли устойчивость к инфекции бактерией Erwinia carotovora и грибом Rhizoctonia solani. Использование растений табака, экспрессирующих ген антимикробного пептида бомбинина, перспективно в сельскохозяйственной биотехнологии для защиты растений.

Изучение молекулярно-биологических механизмов и разработка методов молекулярной селекции для получения растений с/х культур, устойчивых к стрессовым факторам внешней среды и с улучшенным качеством урожая

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений

Проведен анализ наследования трансгенных признаков в потомстве 54 первичных трансгенных линий Т0 мягкой пшеницы, содержащих гены устойчивости к гербициду bar и солевому стрессу hvnxh2 или agnhx. Выявлено 165 популяций T2-T3 наследующих гены стрессоустойчивости как гомозиготные аллели. Молекулярно-биологическим анализом подтверждена экспрессия генов солеустойчивости в гомозиготном потомстве 16-ти линий Т0. Для изучения постранскрипционного регулирования сроков созревания плодов 27 трансгенных линий яблони адаптированных к условиям ex vitro, которые содержат кассеты экспрессии для подавления синтеза этилена, были успешно привиты на подвои с целью ускорения их цветения и плодоношения.

Изучение молекулярно-биологических механизмов и разработка методов молекулярной селекции для получения растений с/х культур, устойчивых к стрессовым факторам внешней среды и с улучшенным качеством урожая, № 0101-2014-0047, № 01201352435

 

Естественный трансмембранный домен пептидогликан-гидролазы Acinetobacter способствует бактериолитической активности фермента

Лаборатория молекулярной биоинженерии

Ферменты, которые разрушают клеточную стенку бактерий, в свете возрастающей антибиотикоустойчивости патогенных микроорганизмов, считаются перспективными антибактериальными препаратами. Белки, гидролизующие пептидогликан (основной материал клеточной стенки), достаточно распространены в природе и кодируются в геномах многих бактерий (аутолизины) и бактериофагов (эндолизины). Основное препятствие для внедрения таких белков в практику – неспособность проникать через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий. Для осуществления этой функции либо используются дополнительные вещества, разрыхляющие мембрану, либо в полипептидную цепь фермента путем генной инженерии добавляется трансмембранный домен, обеспечивающий транспорт полученного химерного белка через мембрану бактерии. Такие белки называются «Артилизины» (ARTIficial LYSIN – «искусственный фермент»). При анализе бактериальных геномов нами был обнаружен фермент с предсказанной пептидогликан-гидролазной функцией, у которого на С-конце имеется последовательность, образующая положительно заряженную α-спираль с возможной трансмембранной функцией. Полученный рекомбинантный белок (AcLys) способен проявлять бактериолитическую активность на широком спектре грамотрицательных бактерий без добавления разрыхлителей мембран. Кристаллы белка AcLys были получены в условиях микрогравитации. Пространственная структура белка, полученная методом рентгеновской кристаллографии с разрешением 1.2 Å, показала наличие α-спирали (α8), не нарушающей целостность белковой глобулы и, вероятно, играющей активную роль в «лизисе снаружи». Исследование таких «природных артилизинов» способствуют рациональному дизайну «ферментативных антибиотиков».

Первые рекомбинантные трехпетельные токсины гадюк – антагонисты никотиновых холинорецепторов мышечного и нейронного типа

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий,  Лаборатория молекулярной диагностики,  Отдел «Учебно-научный центр»,  Лаборатория молекулярной токсинологии

Одним из основных компонентов ядов змей семейства Elapidae являются трехпетельные токсины, которые обладают различными видами биологической активности, включая ингибирование синаптической передачи за счет блокирования холинорецепторов никотинового типа. Трехпетельные токсины до сих пор не обнаружены в ядах змей семейства Viperidae, хотя кодирующие их мРНК найдены в ядовитых железах змей этого семейства. Нами впервые проведена экспрессия в клетках E. coli генов двух трехпетельных токсинов TFT-AF и TFT-VN, последовательности которых установлены на основании последовательностей кДНК из ядовитых желез гадюк Azemiops feae и Vipera nikolskii, соответственно. Исследование биологической активности полученных токсинов проведено с помощью методов электрофизиологии, кальциевого имиджинга и радиолигандного анализа. Нами впервые показано, что трехпетельные токсины гадюк являются антагонистами никотиновых холинорецепторов как нейронного, так и мышечного типа.

Сорт березы пушистой (Betula pubescens Ehrh.) Белрос-3

Группа лесной биотехнологии

Береза является основной лесообразующей лиственной породой Российской Федерации, занимая 15% площади лесопокрытых земель. До настоящего времени в Государственном реестре селекционных достижений не зарегистрировано ни одного сорта березы. Впервые в России создан сорт березы пушистой, который отличается от неселекционных генотипов высокой стабильностью различных ростовых характеристик, повышенной продуктивностью и увеличенными размерами древесного волокна. Генотип может быть использован в плантационных насаждениях интенсивного типа.

Субклеточная локализация и детекция белка ОРТ6 вируса табачной мозаики с помощью иммуноэлектронной микроскопии

Лаборатория молекулярной диагностики

В предшествующих исследованиях было показано, что геномы ряда тобамовирусов в дополнение к генам белка оболочки, транспортного белка и цистрону, кодирующему различные домены РНК_полимеразы, содержат слабо консервативный короткий ген ОРТ6 . В данной работе с помощью биохимических и иммунологических методов было доказано, что в зараженных двумя изолятами вируса табачной мозаики (ВТМ, штамм U1) растениях действительно накапливается пептид ОРТ6. При этом в отличие от скоплений вирусных частиц, обнаруженных в цитоплазме клеток, продукт ОРТ6 выявлен в основном в ядрах, что соответствует ранее опубликованным данным по временной экспрессии изолированной ОРТ6 штамма U1. Кроме того, нами получены новые данные, подтверждающие существование генов OРТ6 в ви ромах целого ряда тобамовирусов.

Публикации

  1. Erokhina TN, Lazareva EA, Richert-Pöggeler KR, Sheval EV, Solovyev AG, Morozov SY (2017). Subcellular localization and detection of Tobacco mosaic virus ORF6 protein by immunoelectron microscopy. Biochemistry (Mosc) 82 (1), 60–66

Получен ковалентный конъюгат ДНК-антитело для использования в иммуно-ПЦР

Лаборатория молекулярной диагностики

Конъюгат антитела и одноцепочечного олигонуклеотида был получен с использованием биоортогональной реакции азид-алкинового циклоприсоединения, промотируемого напряжением. Антитело модифицировали сульфотетрафторфениловым эфиром азидокапроновой кислоты; для модификации олигонуклеотида с введенной при синтезе аминогруппой использовали N-гидроксисукцинимидный эфир дибензоциклоактина. Получены конъюгаты со степенью меченья 1-3 олигонуклеотида на антитело.

Биологическая активность экстракта цекропин Р1 экспрессирующих растений каланхоэ

Лаборатория биотехнологии растений

В экспериментах на растениях и животных исследован водный экстракт полученных в лаборатории растений каланхоэ перистого (Kalanchoe pinnata L.), экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина P1 (сесР1). Экстракт эффективно индуцирует ризогенез у каллусов трудных для дифференцировки in vitro растений Mesembryanthemum crystallinum. Обнаружена высокая ранозаживляющая (рис. 1) и антимикробная активность экстракта сесР1-растений, превосходящая эффективность антибиотика цефазолина в отношение возбудителей гнойных инфекций Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa (рис. 2) и противогрибкового препарата клотримазола в отношение высоковирулентного клинического изолята Candida albicans. Полученные результаты указывают на перспективность использования сесР1-растений каланхоэ в экспериментальной биологии и фармакологии.

Лаборатория молекулярных основ стрессоустойчивости растений была создана в 2017 году, после получения профессором M. Тальянским мегагранта правительства РФ для проведения работ по теме:«Новые функции клеточного ядра и комплексная устойчивость растений картофеля к болезням и физиологическим стрессам». Деятельность лаборатории направлена на получение всесторонних знаний о механизмах комплексных стрессов в растениях и идентификацию ключевых целевых генов, необходимых для защиты растений от влияния различных стрессов на рост, развитие и продуктивность растений.

Изучение экспрессии генов трихотеценового кластера у грибов Fusarium graminearum и F. ussurianum в различных условиях культивирования и их токсигенности

Лаборатория молекулярной диагностики

Была изучена динамика экспрессии генов трихотеценового кластера, включающего в себя 12 генов, ответственных за регуляцию и отдельные этапы биосинтеза микотоксинов. Для этого были выбраны токсигенных штаммы F. graminearum (Ст-6 и Ст-9) и F. ussurianum (g. 120 и g. 267). Продемонстрировано наличие 3-х групп генов, отличающихся друг от друга по уровням и временным параметрам экспрессии. Особое внимание нами было уделено двум генам, функциональное значение которых на сегодняшний день не вполне ясно –TRI9 и TRI14. Показано, что экспрессия этих двух генов сохранялась на низком уровне в течение всего процесса культивирования. Впервые расшифрованы нуклеотидные последовательности и определены вероятные структуры белков, кодируемых геном TRI14 у видов F. poae, F. sambucinum, F. langsethiae, F. venenatum, F. cerealis.

Определение структуры элиситорного белка CS20EP из штамма CS-20 гриба Fusarium oxysporum

Лаборатория молекулярной диагностики

На основе предварительных данных об N-концевой аминокислотной последовательности белка, экспрессируемого штаммом  CS-20 гриба F. oxysporum, была определена структура его кДНК. С помощью методов биоинформатического анализа предсказана полная аминокислотная последовательность белка CS20EP, расчётная  масса которого соответствовала полученным ранее данным MALDI-TOF (~10 кDa). Продемонстрировано, что белок CS20EP обладает элиситорной активностью, стимулируя защитную реакцию растений томата в ответ на их заражение вирулентным штаммов F. oxysporum, вызывающим сосудистый вилт и некроз проводящих тканей. Показано, что изучаемый белок имеет ряд структурных отличий от сходных по последовательности белков вирулентных штаммов F. oxysporum и других видов рода Fusarium.  Последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок CS20EP, депонирована в базу данных GenBank NCBI (accession number KR028481).

Изучение разнообразия токсигенных грибов рода Fusarium на территории России молекулярно-генетическими методами и поиск новых высокополиморфных маркеров для их специфической диагностики и идентификации

Лаборатория молекулярной диагностики

Впервые определены и представлены в международных базах данных частичные последовательности генов фратаксина и фосфатпермеазы основных возбудителей фузариоза, распространённых на территории России и установлен филогенетический потенциал этих локусов

Исследования по созданию банка гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости человека

Лаборатория молекулярной диагностики

Получены клоны гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к трем различным вариантам антигенов главного комплекса гистосовместимости человека 1 класса. 5 клонов гибридом продуцируют моноклональные антитела к HLA-A03, 9 клонов – к HLA-A11 и 6 клонов – к HLA-B51. Все полученные клоны гибридом продуцируют моноклональные антитела класса IgG. Отечественных аналогов выше указанных моноклональных антител не обнаружено.

Получение растений с повышенной экспрессией HBsAg в качестве съедобной вакцины против гепатита В

Лаборатория биотехнологии растений

Создана новая экспрессионная система для повышенного синтеза белков в растениях под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S), содержащего 4 энхансерных последовательности CaMV 35S и нетранслируемую лидерную последовательность Ω РНК вируса табачной мозаики. В опытах на лабораторных животных продемонстрирована иммуногенность клубней картофеля, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Повышенный синтез целевых белков позволяет использование трансгенных растений в качестве съедобной вакцины против гепатита В без дополнительных инъекций рекомбинантной вакцины.