Лаборатория фармакокинетики

В лаборатории ведутся работы по нескольким направлениям исследований: структурно-функциональное исследование зрительных сигнальных белков и разработка новых подходов к лечению рассеянного склероза.

Под руководством Дмитрия Валерьевича Зинченко проводится структурно-функциональное исследование зрительных сигнальных белков. Система фототрансдукции была использована как модельная система для изучения трансмембранной передачи химического сигнала – одного из ключевых элементов клеточной регуляции, лежащего в основе действия гормонов, нейромедиаторов, биологически активных белков и пептидов.

В последние годы коллективом Лаборатории проведены структурно-функциональные исследования молекулы рековерина. Показано, что клеточной мишенью молекулы рековерина является родопсинкиназа. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза сотрудники получили различные мутантные формы рековерина, что позволило провести функциональное картирование молекулы рековерина и выяснить роли отдельных аминокислотных остатков. Также сотрудники получили мутантные формы с модифицированными кальций связывающими EF-hand центрами, которые позволили собрать данные о механизме связывания ионов кальция отдельными  участками рековерина и выявить роль кальций связывающих EF-hand центров в процессе связывания белка с фоторецепторной мембраной и в процессе ингибирования фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой.

Сейчас продолжается комплексное исследование механизмов, лежащих в основе регуляции функциональной активности не только рековерина и некоторых других нейрональных кальциевых сенсоров (НКС) в условиях, моделирующих различные состояния, возникающие внутри фоторецепторной клетки. Показано, что особенности структурной организации С-концевого сегмента НКС определяют механизм, в соответствии с которым достигается селективность Са2+-зависимого действия каждого из белков семейства. Сотрудники исследовали влияние окислительных модификаций НКС по консервативному остатку цистеина, в том числе, димеризации НКС с образованием дисульфидной связи, на функционирование этих белков. Продолжается исследование механизма регуляции функционирования НКС за счет взаимодействия с каркасным белком из рафт-структур кавеолином-1. Показано, что транслокация рековерина в фоторецепторные рафт-структуры, содержащие кавеолин-1, повышает Са2+-чувствительность регуляторной активности белка, адаптируя ее к физиологическому диапазону изменения концентрации катиона в фоторецепторной клетке.

По этому направлению ведутся исследования в области молекулярных механизмов зрения около 15 лет. За это время Лаборатория провела совместных работ с лабораторией зрительной рецепции НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ и лабораторией новых методов в биологии ИБП РАН. Новые исследования проводятся также в тесном сотрудничестве с этими коллективами.

Межлабораторные рабочие группы под руководством Алексея Викторовича Данилковича и Игоря Петровича Удовиченко занимаются разработкой новых подходов для получения терапевтических средств для лечения рассеянного склероза, биогенных субстратов, – биогелей на основе сомоорганизующихся пептидных фибрил, применимых для тканезаместительной терапии и в качестве искуственного депо для перманентной дозоконтролируемой доставки лекарственных средств в организм.

Рассеянный склероз (РС) – хроническое, прогрессирующее аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (ЦНС) с множественной симптоматикой, характеризующееся демиелинизацией белого вещества (аксонов мозга). Очаги демиелинизации в центральной  нервной системе вызывают аксональную дегенерацию, что является причиной развития  стойкой патологии центральной нервной системы, приводящей к ранней инвалидности больных. Разрабатывая новые подходы для получения терапевтических средств для РС, сотрудники Лаборатории занимались поиском и анализом потенциальных структур, представляющих из себя вещества пептидной немиелиновой природы. Поскольку в  развитии РС  доминирующую роль играют иммунологические процессы, то требуются лекарственные средства, позволяющие модулировать функциональное состояние аутоиммунных клеток, активность которых вызывает аутоиммунное заболевание.

В ходе работы сотрудники обнаружили, что пептид A8AMS, гомологичный участку VH  домена IgG человека, способен при стимуляции КонА ингибировать пролиферативную активность праймированных лимфоцитов из  аутбредных крыс линии Dark Agouti (DA) с  экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЭАЭ), – животной  модели РС. Лимфоциты, выделенные из животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломелитом, использовали в культуре клеток для исследования действия различных  концентраций экспериментального пептида A8AMS на клетки при инкубации в течение 72 ч. Жизнеспособные клетки детектировали с помощью витального агента AlamarBlue.

К потенциальным ограничениям и рискам разрабатываемого лекарственного средства относится возможная токсичность разрабатываемого лекарственного  средства, но, в отличие  от «малых молекул» фарминдустрии, пептидная природа сводит эти риски к минимуму, с учетом того, что структура лекарственного средства присутствует у человека как составная  часть  молекул нескольких типов антител и не является чужеродной. Более того, использование современных методов моделирования биологических структур и расчёта их термодинамических характеристик с использованием элементов многофакторного анализа позволяет создавать целый набор пептидных молекул с заданными свойствами, учитывая высокую степень индивидуальных особенностей организма человека.

Известно, что некоторые полярные и амилоидогенные пептиды способны проявлять в водных растворах склонность к самоорганизации, формируя наноструктуры в виде фибрилл длиною в сотни нанометров. Изучение и определение факторов,  оказывающих влияние на процесс самоорганизации молекул пептидов, является важной задачей в свете поиска подходов к профилактике и лечению заболеваний, сопровождаемых накоплением в тканях и клетках амилоидных телец, создания новых материалов для медицины, в том  числе — получения биогелей с целью их использования в тканевой инженерии и в качестве имплантируемого контейнера, позволяющего реализовать доз-контролируемую доставку лекарственных средств. Этим вопросом также занимается межлабораторная группа.

В экспериментах in vitro показано (рис. 1, a-b),  что в ходе самоорганизации ионных пептидов формируется пространственная сеть из искусственных волокон, в которых молекулы пептидов ориентированы перпендикулярно продольной оси филамента, диаметр которых зависит от размера боковых заместителей соответствующих аминокислотных остатков (рис. 1, c-d). Поскольку все детали процесса самоорганизации комплекса молекул пептидов на стадии инициации, особенно начальные этапы сборки протофиламента, до конца не выяснены, нами были изучены характеристики разно размерных комплексов антипараллельных пептидов H-(RADA)4-OH и H-(RLDL)4-OH с целью определения пространственной организации протофиламента.

unnamed.jpg

Рис. 1. Атомно-силовое детектирование линейных размеров фибрилл, образованных самоорганизующимися пептидами H-(RADA)4-OH (a,c); и H-(RLDL)4-OH (b,d). Распределение величин поперечных размеров фибрилл каждого вида отражает различия размеров групп боковых заместителей аминокислотных остатков в составе пептидов.

В результате молекулярной стыковки пространственных структур пептидов H-(RLDL)4-OH в b-конформации были получены стабильные комплексы: димер, тетрамер, тетрамер-«лист» и октамер, для которых рассчитаны соответствующие МД-траектории длительностью по10 нс в каждом случае.

Сравнительный анализ характеристик пептидных комплексов показал, что все структуры, за исключением комплекса тетрамер-«лист», стабилизированы в b-конформации (рис.2). Также отмечено, что димер молекул H-(RLDL)4-OH в явном водном окружении значительно более устойчив в b-конформации (рис.3), чем димер пептида H-(RADA)4-OH . Это позволило сделать вывод о том, что формирование антипараллельных димеров в b-конформации можно рассматривать как первую стадию процесса самоорганизации молекул H-(RLDL)4-OH в воде. Данному выводу полностью соответствуют результаты сравнительного анализа величин свободных энергий Гиббса пептидных структур.

unnamed.jpg

Рис. 2. Изменение длин (L) непрерывных сегментов последовательности - числа аминокислотных остатков в -конформации для комплексов антипараллельных пептидов H-(RLDL)4-OH на отрезке времени 10 нс (по данным МД: AMBER ff03, 300K).

 

unnamed.jpg

Рис. 3а. Свободная энергия (PBSA) мономеров и комплексов пептидов на экспериментальном отрезке времени 10 нс в условиях явного водного окружения (AMBER ff03, 300K). Комплексы пептидов H-(RLDL)4-OH.

unnamed.jpg

Рис. 3б. Комплексы пептидов H-(RADA)4-OH. РЕЗУЛЬТАТ: В случае H-(RLDL)4-OH свободная энергия октамера меньше, чем сумма энергий компонентов, слагающих пептидный комплекс. В случае H-(RADA)4-OH свободная энергия додекамера меньше, чем сумма энергий компонентов, слагающих пептидный комплекс. ВЫВОД: Возможность самоорганизации рассматриваемых пептидов с образованием антипараллельных комплексов термодинамически обоснована.

Характерная топология и стабильность пептидов H-(RLDL)4-OН в составе комплексов димера, тетрамера и октамера характеризует основные стадии процесса самоорганизации молекул ионных пептидов в воде, что в конечном итоге обеспечивает образование наноструктур в виде филаментов. 

Лаборатория химии белка основана в 1990 году.

ФИОДолжностьКонтакты
Зинченко Дмитрий Валерьевич, к.б.н.зав. лаб.
Муранова Татьяна Анатольевна, к.х.н.с.н.с.
Данилкович А.В., к.х.н.н.с.
Удовиченко И.П., к.х.н.н.с.

Ранее здесь работали

Липкин Валерий Михайлович, Чл.-корр. РАН, проф., д.х.н.
Матвеев С.В., к.ф.-м.н.
Владимиров Василий Игоревич
Загрузка...
Загрузка...

Зинченко Дмитрий Валерьевич

Пущино (Моск. обл.), проспект Науки, 6 — На карте

Загрузка...