Пресс-центр / новости / Отчеты /

Информация о ходе выполнения проекта Мероприятия 4.6.5. «Обеспечение реализации мероприятий Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий» Минобрнауки России по Соглашению № 075-15-2021-1049 (внутренний номер 15.ИП.21.0002)

За отчетный период 1-го этапа (28.09.2021 – 31.12.2021) в рамках выполнения соглашения были проведены следующие работы:

• Создание лаборатории по направлению генетики и нанотераностики.
• Дизайн и получение компонентов мРНК-вакцины. Синтез мРНК, содержащей антигены SARS-CoV-2 и гены репортеры. Оптимизация состава липидных частиц. Разработка методики синтеза катионных липидов, несущих холиновую группу и ионизируемого липоидов.
• Сбор биообразцов крови пациентов, переболевших COVID-19, вакцинированных и здоровых доноров.
• Получение экспрессионных конструкций, трансфекция и получение рекомбинантных штаммов-продуцентов для наработки различных вариантов антитела HFB30132A IgA-изотипа. Наработка экспериментальных образцов мономеров антитела HFB30132A IgA-изотипа в клетках CHO.
• Получение экспрессионных конструкций, трансформация и получение рекомбинантных штаммов-продуцентов таргетных пептидов и гибридных белков; разработка методов получения таргетных анти-SARS-CoV-2 пептидов и гибридных белков.
• Разработка методики получения производных амикумацина с улучшенными свойствами (большей стабильностью и/или активностью) и проведение их синтеза.
• Разработка биоинформатических методов для оценки интегральной способности молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) человека первого и второго классов к презентации линейных пептидов вируса SARS-CoV-2.
• Отработка условий инкапсуляции индивидуальных B-клеток в капли эмульсии; отработка условий ПЦР индивидуальных B-клеток в каплях эмульсии.
• Сбор биоматериала из различных источников для поиска продуцирующих антибиотические вещества штаммов микроорганизмов. Получение репортерных клеток на основе грамм-отрицательных бактерий и/или грибов. Микрофлюидный высокопроизводительный скрининг образцов микробиоты из различных источников. Анализ геномов и транскриптомов существующих коллекций микроорганизмов и беспозвоночных животных, поиск аналогов известных β-шпилечных АМП.
• Получение экспрессионных конструкций, трансформация и получение штамма-продуцента рекомбинантной протеазы коронавируса Mpro. Молекулярный дизайн пептидов и флуорогенных субстратов, соответствующих субстратной специфичности протеазы Mpro коронавируса, исходя из литературных данных. Отбор низкомолекулярных веществ – потенциальных ингибиторов основной SARS протеазы Mpro с применением сверхвысокорепрезентативных ДНК-баркодированных химических библиотек класса DECL. отработка условий тестирования эффективности анти-COVID-19 препаратов с использованием трансгенных мышиных моделей (C57BL/6J-TgTn(CAG-human ACE2-IRES-Luciferase-WPRE-polyA) и др.).
• Разработка схем синтеза и получение новых аналогов N-гидроксицитидина (NHC), модифицированных по гетероциклическому и/или сахарному остаткам. Проверка полученных соединений на противовирусную активность с использованием панели ДНК и РНК вирусов, включая SARS-CoV-2, и восприимчивых культур клеток.
• Рациональный дизайн, синтез генов и сборка экспрессионных генетических конструкций для наработки различных вариантов антитела HFB30132A IgA-изотипа, генов таргетных анти SARS-CoV-2 пептидов и гибридных белков (таргетный пептид-барназа), гена протеазы коронавируса Мpro.
• Синтез генов и сборка генетических конструкций для синтеза мРНК, содержащих антигены SARS-CoV-2.
• Секвенирование и сборка геномов отобранных штаммов, продуцирующих антибиотические соединения, отобранных в ходе реализации этапа 1.
• Иммунизация мышей антигенами SARS-CoV-2 и отбор биообразцов крови, лимфоузлов и селезенки.

 

В результате выполнения работ первого этапа работ по Соглашению № № 075-15-2021-1049 о предоставлении субсидии получены нижеследующие основные результаты:

1. Создана Лаборатория онконанотераностики (приказ №150 от 30.12.2021).
2. Проведен дизайн генетических конструкций для синтеза мРНК. Отработана схема синтеза репортерных мРНК, кодирующих люциферазу светлячка, а также мРНК, являющейся основой вакцины Pfizer и содержащей S-2P антиген SARS-CoV-2. Разработаны подходы к эффективному синтезу компонентов кэпа гуанидинового типа: гуанозин-5'-монофосфата и пирофосфата гуанозина, структуры подтверждена данными масс- и/или ЯМР-спектроскопии. Оптимизированы условия инкапсуляции модельной мРНК в липидные наночастицы и разработаны методы их характеризации. Показано, что в оптимальных условиях при использовании микрофлюидной системы можно получить стабильные липидные частицы со средним размером 85 ± 10 нм, инкапсуляцией мРНК 77±5% при финальной концентрации 14±5 мкг/мл. Разработаны методики синтеза холиновых эфиров насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, с помощью которых можно синтезировать препаративные количества катионных липидов. Промежуточные продукты синтеза, а именно – диметиламиноэтиловые эфиры жирных кислот, могут быть использованы в составе липидных наночастиц в качестве ионизируемых липидов. Разработана четырехстадийная методика синтеза ионизируемого липоида фирмы Pfizer (ALC-0315) в количестве, достаточном для использования в последующих сравнительных экспериментах (0,63 г). Схема и методика синтеза катионных липидов, несущих холиновую группу и ионизируемого липоидов приводится в виде отдельного документа в составе отчетной документации.
3. Для разработки экспресс-технологии получения терапевтических антител были определены 3 группы доноров (переболевшие COVID-19, вакцинированные Sputnik V или мРНК-вакциной, здоровые невакцинированные доноры составили контрольную группу). У всех доноров были измерены титры специфических антител к коронавирусу SARS-CoV-2 иммуноферментным методом, для всех был произведен ПЦР-тест на выявление РНК коронавируса SARS-CoV-2. У всех доноров был произведен забор биологического материала (венозная кровь). Из цельной крови были выделены мононуклеарные клетки с использованием градиента плотности фиколла. Был подобран оптимальный метод выделения интактных B-клеток. Из полученных клеток (мононуклеары и B клетки доноров) был создан криобанк; в дальнейшем, в зависимости от поставленных задач, возможна дополнительная характеризация данных клеток. Были получены данные по связыванию B клетками доноров антигена коронавируса SARS-CoV-2 – RBD, конъюгированного с флуоресцентными метками.
4. Получены экспрессионные генетические конструкции для наработки различных вариантов антитела HFB30132A IgG и IgA-изотипа. Были получены экспериментальные образцы рекомбинантных мономерных форм антитела HFB30132A IgA1- и IgA2m1- изотипов, а также антитела HFB30132A IgG4 изотипа для использования в качестве контрольного образца. Утверждены Акт наработки экспериментального образца антитела HFB30132A в формате IgG4, Акт наработки экспериментальных образцов мономерных форм антитела HFB30132A IgA1- и IgA2m1-изотипов и составлены Паспорта штаммов-продуцента антитела IgA1- и IgA2m1-изотипов, которые приводятся в виде отдельных документов в составе отчетной документации.
5. Получены экспрессионные конструкции для экспрессии генов таргетных полипептидов TP1-Sort-His6 и TP2-Sort-His6 и гибридных белков TP1-BarnaseCys и TP2-BarnaseCys. Получены эффективные штаммы-продуценты таргетных анти SARS-CoV-2 полипептидов TP1-Sort-His6 и TP2-Sort-His6, а также гибридных белков TP1-BarnaseCys и TP2-BarnaseCys. Подготовлены Паспорта штаммов продуцентов указанных белков, которые приводятся в виде отдельных документов в составе отчетной документации. Разработаны методы выделения и очистки таргетных анти-SARS-CoV-2 полипептидов TP1-Sort-His6 и TP2-Sort-His6, а также гибридных белков TP1-BarnaseCys и TP2-BarnaseCys. Методика представлена в виде отдельного документов в составе отчетной документации. Разработан метод получения гибридного белка TP2-Barnase посредством лигирования белковых компонентов TP2-Sort-His6 и GGG-Barnase при помощи фермента сортазы А.
6. Изучено влияние заместителя в карбоксильной группе амикумацина на его активность и стабильность. Показано, что введение замещенных амидов и гидразидов увеличивает стабильность молекуды амикумацина в водных растворах, при этом антибиотическая активность изменяется несущественно. Помимо этого, была разработана методика для синтеза С-16 аминопроизводных амикумацина из бензилового эфира. Данный подход позволит избежать щелочного гидролиза, а нужная карбоксильная группа будет освобождена гидрогенолизом. На последующих этапах проекта планируется разработка прототипа лекарственного средства против коронавируса COVID-19, основанного на использовании амикумацина — антибиотика из Bacillus pumilus, ингибирующего трансляцию патогенов. Предполагается, что доставка инактивированного амикумацина в зараженные клетки будет приводить к высвобождению активной молекулы путем расщепления предшественника протеазой Mpro COVID-19 и ингибированию трансляции вируса.
7. Составлены множества линейных пептидов вируса для презентации молекулами ГКГС первого класса (8-14 аминокислот) и ГКГС второго класса (15-20 аминокислот). Рассмотренная выборка из Московской популяции содержит 282 гаплотипа ГКГС первого класса, в том числе 20 гаплотипов с частотой более 1%. Десять наиболее частых аллелей ГКГС второго класса (ген HLA-DRB1) покрывали более 75% от разнообразия аллелей всей популяции. Наличие списка гаплотипов и их частот позволило создать список наиболее распространенных генотипов ГКГС. Предсказаны аффинности взаимодействий линейных пептидов вируса SARS-CoV-2 и всех рассматриваемых аллелей ГКГС первого и второго классов. Спектры презентируемых пептидов значительно различались у аллелей ГКГС. Разработано и программно реализовано 4 метода для оценки интегральной способности молекул ГКГС человека к презентации линейных пептидов вируса SARS-CoV-2. Математический анализ методов показал устойчивость методов к вариации пороговых значений и высокую согласованность результатов работы различных методов. Распределение интегральной способности к презентации вирусных пептидов по наиболее частым генотипам ГКГС многомодально и содержит экстремально большие и малые значения числа презентируемых пептидов. Показано существование генотипов ГКГС второго класса, для которых предсказано отсутствие высокоаффинных взаимодействий с пептидами вируса SARS-CoV-2. Рассмотрение частоты генотипа в качестве дополнительной переменной позволяет выделить генотипы с особенным практическим значением (высокая частота и экстремальное значение презентирующей способности молекул).
8. Отработаны условия инкапсуляции индивидуальных В-лимфоцитов в капли. В случае проведения процедуры инкапсуляции индивидуальных B-клеток в каплях эмульсии с использованием модельной смеси клеток В-клеточных лимфом Namalwa и Ramos в соотношении 1:1 получают смесь ампликонов спаренных фрагментов тяжелых и легких цепей антител, содержащую более 70% правильно спаренных последовательностей. При этом аналогичное спаривание цепей без проведения процедуры инкапсуляции индивидуальных B-клеток в каплях эмульсии приводит к ~20 % правильно спаренных последовательностей. Осуществлен рациональный дизайн праймеров для амплификации вариабельных фрагментов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов человека. Были оптимизированы условия обратной транскрипции и эмульсионной ПЦР, включая подбор типов ревертазы, полимеразы, праймеров, концентрации матрицы, количества циклов и температуры. Методика инкапсуляции индивидуальных в-клеток в капли эмульсии и пцр индивидуальных В-клеток в каплях эмульсии приводится в виде отдельного документа в составе отчетной документации.
9. Проведен сбор биоматериала для выделения микроорганизмов из различных источников, в том числе, из экстремальных экониш (засоленные почвы, холодные и засоленные водоемы) и насекомых (личинки мухи черная львинка, муравьи различных родов). Из штамма OPG, выделенного из кишечника личинки мухи черная львинка, была локализована активная фракция штамма-продуцента, проведено культивирования в значительных объемах и выделено индивидуальное активное соединение в количестве более 40 мг. Получены репортерные клетки на основе грамм-отрицательных бактерий E. coli BL21 (DE3), продуцирующие sfGFP под контролем промотора pBS. Подготовлен Паспорт штамма репортерных клеток, который приводятся в виде отдельного документа в составе отчетной документации. Используя полученный штамм репортерных клеток, проведен микрофлюидный высокопроизводительный скрининг образцов микробиоты диких животных. Отобрана панель штаммов бактерий микробиоты диких животных, подавляющих рост репортерных штаммов. Проведен биоинформатический поиск аналогов известных β-шпилечных АМП ареницинов, капителлацина, гомезина, танатина и тахиплезина-1 в базах данных нуклеотидных последовательностей геномов и транскриптомов беспозвоночных животных. Создана библиотека обнаруженных природных гомологов АМП. В частности, было обнаружено 27 новых последовательностей гомологов известных β-шпилечных АМП, 25 из которых были уникальными, а степень гомологии составила от 50 до 95%. Обнаружено новое семейство β-шпилечных АМП из трематод рода Fasciola, названное фасцидинами.
10. Получены экспрессионные генетические конструкции для наработки различных вариантов главной протеазы вируса COVID19 Mpro. Всего было наработано 4 мг белка Mpro c литра культуры и 15 мг неактивного мутанта С 145/А. Выход препарата Mpro после очистки составил 80% и MproC145/A - 75 % со степенью очистки около 90% Были получены экспериментальные образцы рекомбинантных форм Mpro и ее неактивного мутанта MproC145/A. Составлен паспорт штаммов-продуцента Mpro и MproC145A, который приводится в виде отдельного документа в составе отчетной документации. В результате проведенного отбора из библиотеки DelOpen был получен ряд химических соединений, которые потенциально могут обладать ингибирующей активностью по отношению к протеазе Mpro. После секвенирования отобранных компонентов библиотеки, будет установлена их структура и проведен анализ их активности в качестве высокоспецифичных ингибиторов Mpro. Установлено, что мыши C57BL/6 hAEC2-TG+ (C57BL/6-Tgtn(CAG-human AEC2-IRES-Luciferase-WPRE-polyA) высокочувствительны к вирусу SARS-CoV-2, вариант В, при интраназальном заражении. При расчете ЛД50 по методу Ван дер Вардена величина показателя составила 316 х/:5 БОЕ/мышь. Через 14 суток после инфицирования вирус в органе-мишени не выявлен ни методом негативных колоний, ни ОТ-ПЦР. В диапазоне доз инфицирования 3-5lg БОЕ/особь значимых различий поражения легких животных не отмечено. В диапазоне доз инфицирования 3-5lg БОЕ/особь значимых различий накопления вируса в легких животных не выявлено.
11. Получена панель новых аналогов NHC (не менее 15 соединений). Проведена первичная оценка противовирусной активности и цитотоксичности на восприимчивых к вирусам культурах клеток. Протоколы оценки противовирусной активности и цитотоксичности NHC на культурах клеток представлены в виде отдельных документов в составе отчетной документации. Разработаны схемы синтеза и методики получение новых аналогов N-гидроксицитидина (NHC), модифицированных по гетероциклическому и/или сахарному остаткам, которые представлены в виде отдельных документов в составе отчетной документации.
12. Осуществлены рациональный дизайн, синтез генов и сборка экспрессионных генетических конструкций для наработки различных вариантов антитела HFB30132A IgA-изотипа; таргетных полипептидов (TP1 и TP2), эффективно связывающихся с S-белком SARS-CoV-2; гибридных белков, где TP1 и TP2 находятся в единой рамке считывания с РНКаза барназой и вариантов Mpro протеазы SARS-CoV-2. Подготовлены Паспорта экспрессионных генетических конструкций, которые приводятся в виде отдельных документов в составе отчетной документации.
13. Осуществлены синтез генов и сборка генетических конструкций для синтеза мРНК, содержащих антигены S-2P, S_delta и S_omicron вируса SARS-CoV-2. Подготовлены Паспорта экспрессионных генетических конструкций, которые приводятся в виде отдельных документов в составе отчетной документации.
14. Осуществлено секвенирование 20 отобранных штаммов бактерий, проведена сборка их геномов. Последовательности геномов представлены на локальном ресурсе Института, посвященному данному проекту. Ссылка на ресурс https://www.ibch.ru/about/research/projects/1200. После идентификации кластеров биосинтеза антибиотиков, последовательности штаммов будут выгружены на глобальные ресурсы.
15. Проведена иммунизация мышей антигенами RBD-Fc и RBD-Fc tri. Подготовлены Протоколы иммунизации, которые приводятся в виде отдельных документов в составе отчетной документации. Проведен отбор биообразцов крови, лимфоузлов и селезенок иммунизированных мышей. Анализ сывороток крови иммунизированных мышей показал высокий титр RBD-специфических антител и высокую нейтрализующую активность в псевдовирусной системе SARS-CoV-2. Разработан способ анализа специфического Т-клеточного иммунитета к анигенам SARS-CoV2, основанный на стимуляции спленоцитов иммунизированных мышей набором соответствующих антигенных пептидов с последующим внутриклеточным окрашиванием на цитокины моноклональными флуоресцентными антителами и анализом методом проточной мультипараметрической цитофлуориметрии.

Все задачи первого этапа работ выполнены в установленные сроки в соответствии с планом-графиком исследований Соглашения № 075-15-2021-1049 (внутренний номер 15.ИП.21.0002) о предоставлении субсидии от 28 сентября 2021 г.

4 ноября 2022 года

<form action="" method="post" class="commentForm" id="commentForm-{0}"> <input type="hidden" name="pressId" value="4309" /> <input type="hidden" name="parentId" value="{1}" /> <input type="hidden" name="id" value="{2}" /> <txt name="comment_text" id="comment_text">{3}</txt> <input type="button" class="button" value="Комментировать" /> <a class="button" href="javascript:void(null)">Отмена</a> <span class="wait">Подождите немного...</span> <div class="clear"></div> </form>