Пресс-центр / новости / Отчеты /

Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 075-15-2021-1049

За отчетный период 3-го этапа (01.01.2023 – 31.12.2023) в рамках выполнения соглашения были проведены следующие работы:

• Поддержание работы лаборатории по направлению генетики и нанотераностики и лаборатории по направлению разработки технологий для оптического имиджинга, в том числе флуоресцентных и люминесцентных репортерных инструментов.
• Тестирование прототипов мРНК-вакцины, с различными вариантами мРНК и липидов, на животных. Определение вируснейтрализующей активности сыворотки крови иммунизированных мышей. Измерение параметров Т-клеточного иммунитета вакцинированных мышей.
• Разработка, валидация и испытание экспресс-технологии для поиска нейтрализующих антител против вирусных заболеваний.
• Получение экспрессионных конструкций, трансфекция и получение штаммов-продуцентов для наработки рекомбинантных нейтрализующих антител, отобранных из библиотеки истинно природных антител.
• Наработка опытной партии нейтрализующих антител и различных вариантов антитела HFB30132A IgA-изотипа. Экспериментальные исследования по анализу нейтрализующей активности полученных экспериментальных образцов антител in vitro с использованием живого вируса SARS-CoV-2.
• Сравнительное изучение: (1) способности гибридных белков и таргетных пептидов, связываться с рецептор-связывающим доменом S-белка SARS-CoV-2 в формате ИФА; (2) способности гибридных белков, таргетных пептидов, барназы блокировать вирусную инфекцию в модельной системе на лентивирусе
• Определение химической структуры выделенных веществ с антибиотической активностью. Скрининг противогрибковой активности, отобранных в результате скрининга антибиотиков и β-шпилечных АМП. Скрининг цитотоксичности антибиотиков in vitro, отобранных в результате скрининга и βшпилечных АМП.
• Поиск ассоциаций между аллелями главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) и осложнениями COVID-19 со стороны сердечно-сосудистой системы.
• Проверка эффективности выхода мРНК из эндосом на модельных клетках при трансфекции полученными липидными наночастицами. Трекинг пути эндоцитоза липидных частиц в модельных клетках.
• Разработка и испытание универсальной скрининговой микрофлюидной технологии для поиска антибиотических соединений против возбудителей сопутствующих заболеваний при COVID-19.
• Исследование механизма действия обнаруженных антибиотиков.
• Проведение валидации эффективности наиболее перспективных соединений игибиторов протеазы Mpro и прототипа лекарственного средства амикумацин-пептид на трансгенных hACE2+/+ мышах, определение защитного индекса отобранных ингибиторов Mpro при заражении экспериментальных животных реальными штаммами SARS-CoV-2.
• Эксперименты по установлению механизма действия соединений лидеров. Определение защитного индекса отобранных соединений при заражении экспериментальных животных реальными штаммами SARS-CoV-2.
• Дифференциальная геномика и транскриптомика для установления механизма действия антибиотиков.
• Секвенирование образцов B-клеток для валидации технологий экспресс-технологии для поиска нейтрализующих антител против вирусных заболеваний и штаммов-продуцентов антибиотиков универсальной скрининговой микрофлюидной технологии для поиска антибиотических соединений против возбудителей сопутствующих заболеваний при COVID-19.
• Исследование нейтрализующей активности полученных экспериментальных образцов антител, отобранных из библиотеки истинно природных антител и антител IgAизотипа к вирусу SARS-CoV-2 на животной модели in vivo.
• Исследование противовирусной активности гибридных белков и таргетных пептидов в реальном эксперименте на трансгенных мышах, экспрессирующих человеческий рецептор ACE2 и чувствительных к заражению SARS-CoV-2.
• Доклинические исследование наиболее перспективного/-ых прототипа/ов лекарственных препаратов, разработанных в ходе проекта. Проведение предварительной оценки противовирусной активности гибридных белков и таргетных пептидов на трансгенных мышах с использованием модельной лентивирусной системы, экспрессирующей антигены SARS-CoV-2.
• Подготовка кадров по образовательным программам по тематикам «Биоинженерия лекарственных препаратов на основе рекомбинантных белков и малых молекул» и «Гены, геном, генотерапевтические препараты».
• Стажировки исследователей в возрасте до 39 лет в ведущих образовательных организациях высшего образования и научных организациях страны и мира.
• Проведение конференции и молодёжной научная школы по направлению генетические технологии.

 

В результате выполнения работ третьего этапа работ по Соглашению № 075-15-2021-1049 о предоставлении субсидии получены нижеследующие основные результаты:

3.1.1 В ходе реализации проекта была осуществлена работа по поддержанию работы лаборатории по направлению генетики и нанотераностики и лаборатории по направлению разработки технологий для оптического имиджинга, в том числе флуоресцентных и люминесцентных репортерных инструментов. Расширены ресурсные возможности лабораторий: сделан ремонт помещений, закуплено научно-исследовательское оборудование.

3.2.1 Определены оптимальные последовательности мРНК, обеспечивающие максимальный титр нейтрализующих антител против SARSCOV-2; значения титра нейтрализующих антител сывороток в системе in vitro. Проведен иммунофенотипический анализ продукции воспалительных цитокинов, пропорция и число клеток, отвечающих на пептиды S-белка SARS-CoV-2. В составе ОД по работам 3 этапа соглашения приведен Протокол исследований на животных.

3.2.2 Разработана экспресс-технология для поиска нейтрализующих антител против вирусных заболеваний. По результатам разработки экспресс-технологии составлены: Лабораторный регламент экспресс-технологии для поиска нейтрализующих антител против вирусных заболеваний; комплект технической документации, разработанный в соответствии с положениями нормативных документов в области стандартизации; Акт и протоколы испытаний, – в виде отдельных документов в составе отчетной документации этапа 3 Соглашения.

3.2.3 Получены опытные партии нейтрализующих антител и различных вариантов антитела HFB30132A IgA-изотипа и определены значения IC50. Акты наработки опытных партий нейтрализующих антител и различных вариантов антитела HFB30132A IgA-изотипа а также протоколы испытаний этих опытных партий приведены в виде отдельных документов в составе отчетной документации этапа 3 Соглашения № 075-15-2021-1049.

3.2.4 Было проведено сравнительное изучение способности всех гибридных белков и таргетных пептидов, полученных в настоящем проекте связываться с рецептор-связывающим доменом S-белка SARS-CoV-2 в формате ИФА, а также блокировать вирусную инфекцию в модельной системе на лентивирусе. Было показано, что все вещества, кроме свободной барназы, обладают высокой активности: IC₅₀ связывания с RBD доменом, и IC50 вирус-нейтрализации в модельной системе для всех веществ находятся в субнаномолярном диапазоне. Гибридный белок второго поколения TP1-ABD-Ba продемонстрировал относительно завышенные IC50, что, вероятно, связано со стерическим фактором и его способностью взаимодействовать с бычьим сывороточным альбумином, который есть в обеих системах. Подготовлены Сертификаты о биологической активности соединений, а также 2 заявки на изобретения № 2023135234 и № 2023135241, которые приводнятся в виде отдельных документов в составе отчетной документации за 3 этап выполнения Соглашения 3075-15-2021-1049.

3.2.5 Определены структуры потенциальных антибиотиков. Результаты анализа противогрибковой активности (не менее 2 видов грибов/дрожжей) для панели отобранных в результате скрининга антибиотиков и βшпилечных АМП. Цитотоксичность гауземицинов оценивали в отношении клеточных линий различного происхождения (COLO357, J774, EL-4, Colon26, HT-29), значения IC₅₀ для исследованных соединений составили 5-10 мкг/мл, что на порядок превышает концентрации, подавляющие грамположительные бактерии. Этот результат позволяет судить об избирательной мембранной активности гауземицинов, чувствительной к строению мембран бактерий и клеток млекопитающих. Проведена оценка цитотоксичности отобранных прототипов препаратов на основе новых β-шпилечных пептидов животного происхождения: абареницина и его модифицированных аналогов, капителлацина и его модифицированных аналогов, природных пептидов HfBRI-25 и UuBRI-21, а также природных гомологов гомезина. В работе были использованы суспензионные клетки крови человека (эритроциты, мононуклеарные клетки), а также адгезионные клеточные линии человека HEK293T и HaCat. Показана сравнительно низкая цитотоксичность in vitro для большинства полученных в ходе выполнения проекта β-шпилечных АМП. Отобранный пептид Ар9 обладает антибактериальной активностью in vivo в отношении бактерий E. coli и P. aeruginosa. Минимальная эффективная лечебная доза при лечении эшерихиозной инфекции у мышей составляет 2 мг/кг. Обнаружен новый АМП HfBRI-25 из полихеты H. filiformis, обладающий уникальной ассиметричной β-шпилечный структурной и высокой эффективностью in vivo. Показано, что новый пептид способен селективно и сравнительно медленно нарушать целостность мембран бактериальных клеток. Изучена противогрибковая активность новых природных гомологов известного АМП гомезина в отношении четырех видов дрожжеподобных грибов рода Candida. Для дальнейших исследований эффективности противогрибкового действия отобран новый нетоксичный гомезин-подобный пептид DsGom из паука D. Silvatica.

3.2.6 Сформирована когорта пациентов, страдающих осложнениями со стороны сердечно-сосудистой системы после перенесенного COVID-19, в количестве 24 человек. Кроме того, сформирована когорта из 13 в качестве группы сравнения. Осуществлено генотипирование ДНК пациентов методом таргетного секвенирования следующего поколения для определения генотипа главного комплекса гистосовместимости. Установлено, что в группах сравнения значимо различалась частота встречаемости аллелей HLA-C*04:01 и HLA-DRB1*01:01. Так аллель HLA-C*04:01 встречался у пациентов без нарушений со стороны ССС в 7,5 раз чаше по сравнению с пациентами с нарушениями со стороны ССС. На основании данных секвенирования и опроса пациентов был составлен Аннотированный список образцов генетического материала с клинической информацией о течении COVID-19, представленный отдельным документом в составе ОД за 3 этап выполнения Соглашения 3075-15-2021-1049.

3.2.7. Установлено, что наиболее перспективным для использования у животных являются ЛНЧ, составленные на основе ионизируемого липида Аналог 1. Предложен метод оценки транспорта липоплексов содержащих мРНК с помощью красителя SYBR Green I (SG), который образует флуоресцентный комплекс со спаренными участками нуклеиновых кислот. Интенсивность флуоресценции комплекса РНК и SG ниже интенсивности флуоресценции комплекса, образованного двуспиральной ДНК и SG, что позволяет определить момент, когда мРНК в комплексе с SG выходит в цитоплазму из эндосомальных везикул, по увеличению интенсивности флуоресценции клеток. С помощью этого метода установлено, что липоплекс, образованный липидными наночастицами и мРНК S-белка коронавируса SARS-Cov-2, эффективно транспортируется в клетки HEK 293T. Этот транспорт является активным. Накопление липоплекса в эндосомальных везикулах заканчивается примерно к 50-й минуте и далее происходит выход мРНК в цитоплазму и её подготовка к трансляции. Эта стадия занимает примерно 1 час. Установлено, что в транспорте липоплекса не задействован клатрин-опосредованный механизм эндоцитоза, а используется альтернативный механизм фагоцитоза с участием везикулярного транспорта микротрубочками. Протокол исследований представлен отдельным документом в составе ОД за 3 этап выполнения Соглашения 3075-15-2021-1049.

3.2.8 Разработана и испытана универсальная скрининговая микрофлюидная технология для поиска антибиотических соединений против возбудителей сопутствующих заболеваний при COVID-19. В составе ОД по работам 3 этапа Соглашения 3075-15-2021-1049 в виде отдельных документов приведены Лабораторный регламент универсальной генетической скрининговой микрофлюидной технологии для поиска антибиотических соединений против возбудителей сопутствующих заболеваний при COVID-19; программа и методика испытаний; комплект технической документации, разработанный в соответствии с положениями нормативных документов в области стандартизации; акт и протоколы испытаний.

3.2.9 Исследования молекулярных механизмов действия новых антибиотиков по активности гауземицинов A–F в отношении широкой панели бактериальных патогенов в присутствии 20 мМ Ca²⁺ выявили наномолярную активность против M. luteus, M. Caseolyticus и B. cereus X1. Кондуктометрические исследования порообразующей способности гауземицинов на липидных мембранах в присутствии Са2+ подтвердили огромное влияние кальция на взаимодействия гауземицин-липид. Структурные исследования гауземицина В с помощью ЯМР в цвиттер-ионных и анионных мицеллах выявили связывание Са²⁺ макроциклическим доменом антибиотика.

3.2.10 При проведении валидации эффективности наиболее перспективных соединений игибиторов протеазы Mpro и прототипа лекарственного средства амикумацин-пептид на трансгенных hACE2+/+ мышах был определен защитный индекс отобранных ингибиторов Mpro при заражении экспериментальных животных реальными штаммами SARS-CoV-2. Подготовлены Протокол определения защитного индекса отобранных ингибиторов Mpro при заражении экспериментальных животных реальными штаммами SARSCoV-2 и Протокол определения защитного индекса лекарственного средства амикумацин-пептид при заражении экспериментальных животных реальными штаммами SARS-CoV-2, которые приводятся в виде отдельных документов в составе отчетной документации за 3 этап выполнения Соглашения 3075-15-2021-1049.

3.2.11 Защитный индекс отобранных соединений показана протективная активность (защитный индекс) иммунизации препаратами, обработанными соединением 3е, от последующего заражения двумя штаммами (ПИК35 и 7995о) вируса SARS-CoV-2 на животной модели. Протокол определения защитного индекса отобранных соединений при заражении экспериментальных животных реальными штаммами SARSCoV-2 приведен как отдельный документ в составе отчетной документации по этапу 3 соглашения № 075-15-2021-1049.

3.2.12 При изучении дифференциальной геномики и транскриптомики для установления механизма действия антибиотиков была проведена сборки геномов и транскриптомов изучаемых организмов. Приведена интернет-ссылка (https://www.ibch.ru/about/research/projects/1200) на ресурсы, содержащие последовательности геномов и транскриптомов, как отдельный документ в составе отчетной документации по этапу 3 соглашения № 075-15-2021-1049. Работа выполнены за счет средств АО «Клонинг Фасилити» (Договор о софинансировании № 300721/1 от 30.07.2021 г. ООО «Клонинг Фасилити»; ДС №1 от 28.09.2021 г.; ДС №2 от 21.11.2022 г).

3.2.13 При проведении секвенирования образцов B-клеток для валидации технологий экспресс-технологии для поиска нейтрализующих антител против вирусных заболеваний и штаммов-продуцентов антибиотиков универсальной скрининговой микрофлюидной технологии для поиска антибиотических соединений против возбудителей сопутствующих заболеваний при COVID-19 были определены последовательности нейтрализующих антител и генома штаммов продуцентов антибиотиков. Приведена интернет-ссылка (https://www.ibch.ru/about/research/projects/1200) на ресурсы, содержащие последовательности нейтрализующих антител и генома штаммов продуцентов антибиотико. Работа выполнены за счет средств АО «Клонинг Фасилити» (Договор о софинансировании № 300721/1 от 30.07.2021 г. ООО «Клонинг Фасилити»; ДС №1 от 28.09.2021 г.; ДС №2 от 21.11.2022 г).

3.2.14 Проведено широкомасштабное секвенирование (NGS) библиотек В-клеток человека, вакцинированного мРНК-вакциной фирмы Pfizer/BioNTech. Особенностью данной работы является получение репертуаров антител человека с правильным сочетанием тяжелых и легких цепей путем амплификации индивидуальных B-клеток с помощью микрофлюидной технологии. Для высокопроизводительного анализа репертуаров антител был разработан подход, основанный на высокопроизводительном секвенировании перекрывающихся ампликонов вариабельных фрагментов тяжелых и легких цепей антител, а также алгоритм, позволяющий использовать гипервариабельную последовательность CDR3 тяжелой цепи в качестве внутреннего баркода для восстановления правильных комбинаций секвенированных последовательностей тяжелых и легких цепей антител. Глубокое профилирование биоразнообразия антител, отобранных с использованием дрожжевого дисплея, а также оценка частоты встречаемости индивидуальных клонов для каждого раунда отбора позволили осуществить приоритизацию и выбор клонов. В результате проведенного анализа были выбраны наиболее перспективные последовательности антител, нейтрализующих варианты вируса SARS-CoV-2. Работа выполнены за счет средств АО «Клонинг Фасилити» (Договор о софинансировании № 300721/1 от 30.07.2021 г. ООО «Клонинг Фасилити»; ДС №1 от 28.09.2021 г.; ДС №2 от 21.11.2022 г).

3.2.15 Проведено исследование противовирусной активности гибридного белка TP1-ABD-Ba в реальном эксперименте на трансгенных мышах, экспрессирующих человеческий рецептор ACE2 и чувствительных к заражению SARS-CoV-2 в дозе 2.7 мкг/г. Исследование было проведено на высоком уровне значимости с большим количеством животных в группах. В когорте животных, получивших после заражения внутрибрюшинно гибридный белок TP1-ABD-Ba, выживаемость составила 66.7%, в то время как в контрольной группе все животные погибли. Это говорит о высокой противовирусной активности препарата, достоверно отличающееся от контроля. В перспективе необходимо изучение активности в более широком диапазоне дозировок. Подготовлен Протокол исследований противовирусной активности, который приводится в виде отдельного документа в составе отчетной документации. Работа выполнены за счет средств АО «Клонинг Фасилити» (Договор о софинансировании № 300721/1 от 30.07.2021 г. ООО «Клонинг Фасилити»; ДС №1 от 28.09.2021 г.; ДС №2 от 21.11.2022 г).

3.2.16 Проведены доклинические исследования гибридного белка TP1-ABD-Ba как наиболее перспективного прототипа лекарственных препаратов, разработанных в ходе проекта. Современным безметочным методом была исследована зависимость содержания препарата в крови мышей линии BALB/c от времени и определены ключевые фармакокинетические параметры гибридных белков TP1-ABD-Ba и TP1-Ba. Было показано увеличение периода полувыведения гибридного белка, содержащего альбумин-связывающий домен в 35.6 раза, до 17.08 часов. В токсикологическом исследовании было показано, что однократная внутривенная МПД для мышей ICR считается ниже 10 мг/кг на основе наблюдений, зарегистрированных во время вскрытия животных на 14-й день после введения дозы. Подготовлен Отчет о доклинических исследованиях, который приводится в виде отдельного документа в составе отчетной документации. Работа выполнены за счет средств АО «Клонинг Фасилити» (Договор о софинансировании № 300721/1 от 30.07.2021 г. ООО «Клонинг Фасилити»; ДС №1 от 28.09.2021 г.; ДС №2 от 21.11.2022 г).

3.3.1 На этапе 3 были подготовлены кадры по образовательным программам по тематикам «Биоинженерия лекарственных препаратов на основе рекомбинантных белков и малых молекул» и «Гены, геном, генотерапевтические препараты», по которым прошли обучение и получили документы 150 человек (Справки об обучении), подтверждающие успешное освоение соответствующих дисциплин.

3.3.2 В ходе выполнения этапа 3 Соглашения были осуществлены стажировки 3 сотрудников до 39 лет.

3.3.3 Проведена одна научная конференция и одна школа для исследователей в возрасте до 39 лет. Копии подтверждающих документов представлены в комплекте отчетной документации по этапу 3 Соглашения № 075-15-2021-1049.

 

Все задачи третьего этапа работ выполнены в установленные сроки в соответствии с планом-графиком исследований Соглашения № 075-15-2021-1049 (внутренний номер 15.ИП.21.0002) о предоставлении субсидии от 28 сентября 2021 г.

17 января

<form action="" method="post" class="commentForm" id="commentForm-{0}"> <input type="hidden" name="pressId" value="4753" /> <input type="hidden" name="parentId" value="{1}" /> <input type="hidden" name="id" value="{2}" /> <txt name="comment_text" id="comment_text">{3}</txt> <input type="button" class="button" value="Комментировать" /> <a class="button" href="javascript:void(null)">Отмена</a> <span class="wait">Подождите немного...</span> <div class="clear"></div> </form>