Отдел структурной биологии

Основными задачами отдела является установление фундаментальной взаимосвязи структура-динамика-функция для белков и пептидов различных семейств для выяснения молекулярных механизмов их биологической активности в организме, а также рациональной разработки прототипов лекарственных препаратов направленного действия. Основными объектами исследования рассматриваются водорастворимые белки, мембранные белки и мембраноактивные пептиды из различных живых организмов. В рамках работы Отдела решаются фундаментальные задачи современной биологии, а именно выяснение механизмов работы различных белковых соединений на молекулярном и клеточном уровнях. В то же время, направленное конструирование биологически- активных соединений, в том числе с использованием бионанотехнологий, требует глубокого понимания структурно-динамической организации и функционирования их белковых мишеней (во многих случаях локализованных в биологических мембранах). Отдел разрабатывает новые комплексные методики исследований на основе белковой инженерии, современных структурных методов ЯМР, компьютерного моделирования, оптической микро- и спектроскопии является актуальным трендом, способствующим получению уникальных данных о взаимосвязях между структурой и функцией белков и пептидов. Спектроскопия ЯМР является уникальным методом, позволяющим получить экспериментальную информацию о структуре, динамике и межмолекулярных взаимодействиях для пептидов и белков, зачастую имеющих подвижные участки и выполняющих биологическую функцию в гетерогенном окружении. Современные методы белковой инженерии позволяют в достаточном количестве для структурных исследований получить препараты водорастворимых и мембранных белков (в том числе изотопно- меченые производные) из различных живых организмов. Компьютерное моделирование помогает исследовать на атомистическом уровне структуру и динамику белков и мембран, детализировать их взаимодействия при выполнении биологической функции. С помощью оптической микро- и спектроскопии возможно охарактеризовать белковые препараты, а также получить экспериментальную информацию о структурно-функциональных свойствах белковых соединений на молекулярном и клеточном уровнях.

Сотрудниками отдела ведутся работы по следующим перспективным направлениям:

  • Структурно-функциональные исследования механизмов регуляции потенциал-управляемых ионных каналов – важных мишеней для лечения заболеваний-нервной и нейромышечной систем организма и аутоиммунных заболеваний
  • Структурно-функциональные исследования механизмов регуляции рецепторных тирозин-киназ – важных мишеней для противоопухолевой терапии
  • Структурно-функциональные исследования антибиотиков и антимикробных пептидов, как прообразов новых классов антибактериальных препаратов
  • Исследование метаболома крови и тканей мозга пациентов с глиомами, как важный шаг для разработки новых методов ранней диагностики и персонифицированной медицины онкологических заболеваний

Для реализации стратегических направлений исследований запущена программа модернизации приборного парка лабораторий, входящих в Отдел. Отдел реализует исследования в рамках темы ГЗ № 0101-2019-0015.

 

Все публикации (показать избранные)

Арсеньев Александр Сергеевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. , комн.
  • Эл. почта: aars@nmr.ru

Мембрано-связанная нейраминидаза-1 как ключевой компонент комплекса рецептора эластина

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Нейраминидаза-1 (Neu-1) человека входит в состав рецептора эластина и, благодаря своей сиалидазной активности, играет важнейшую роль в эластогенезе, регулируя тем самым работу клетки и развитие сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз. Neu-1 также служит датчиком деградации эластина, способна регулировать активацию TGF-бета и, возможно, ремоделировать эластичные волокна внеклеточного матрикса. В ходе совместных исследований, проводимых в течение ряда лет французско-российским коллективом – исследователями из Университета г. Реймс и ИБХ РАН (Лаб. моделирования биомолекулярных систем) - изучены молекулярные механизмы регуляции жизнедеятельности эластичных волокон, ключевую роль в которых играет Neu-1. В частности, авторами впервые показано, что Neu-1 не только имеет трансмембранную топологию, но и способна димеризоваться в мембрано-связанном состоянии. Это существенно влияет на активность фермента и всего комплекса рецептора эластина в клетке.

Публикации

  1. Bennasroune A, Romier-Crouzet B, Blaise S, Laffargue M, Efremov RG, Martiny L, Maurice P, Duca L (2019). Elastic fibers and elastin receptor complex: Neuraminidase-1 takes the center stage. Matrix Biol 84, 57–67

Комбинаторное селективное введение изотопов 13C и 15N упрощает анализ спектров ЯМР и позволяет картировать интерфейс взаимодействия в комплексах мембранных рецепторов с лигандами

Группа анализа структуры мембранных белков in silico,  Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов,  Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии,  Лаборатория структурной биологии ионных каналов

Комбинаторное введение в молекулы белков стабильных изотопов 13C и 15N позволяет значительно упростить анализ спектров ЯМР. Впервые решена задача и разработан алгоритм CombLabel по расчету схемы комбинаторного введения 13C и 15N меток с минимальной ценой. Применение программы позволило произвести отнесение 50% ЯМР-сигналов основной цепи второго потенциал-чувствительного домена натриевого канала Nav1.4 человека (VSD-II). Токи утечки через мутантные варианты Nav1.4, содержащие замену Arg675Gly в VSD-II, приводят к развитию наследственного заболевания – нормокалемического периодического паралича. Методом ЯМР спектроскопии определен интерфейс взаимодействия VSD-II с токсином Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei, который способен блокировать токи утечки. В модели комплекса VSD-II/Hm-3, построенной на основании данных ЯМР, токсин связывается с внеклеточной петлей S1-S2, дестабилизируя состояние домена, при котором наблюдаются токи утечки. На примере комплексов токсина Hm-3 с VSD-I и VSD-II канала Nav1.4 показано, что токсины паукообразных могут по-разному взаимодействовать с различными доменами в составе одного натриевого канала.

Данные spFRET-анализа подтверждают гипотезу о том, что противоопухолевый агент кураксин, а именно его производное CBL0137, может влиять на дальние взаимодействия энхансеров  с промоторами в хроматине, нарушая структуру нуклеосом или влияя на структуру и динамику линкерной ДНК, поддерживающей эффективные взаимодействия энхансеров  с промоторами (Kantidze et al., Nat Commun., 2019,10(1):1441). Данные показывают, что CBL0137 привлекает hFACT человека (белковый фактор, который облегчает транскрипцию хроматина) к нуклеосомам, опосредует hFACT-индуцированное масштабное,  частично обратимое развертывание нуклеосомы (или раскручивание нуклеосомальной ДНК) и вызывает арест hFACT на нуклеосомах. Этот кураксин-зависимый арест hFACT может быть причиной перераспределения hFACT из транскрибируемых  областей хроматина в другие геномные локусы (Chang et al. Science Advances, 2018, 4 (11), eaav2131).

Работа выполнена совместно с сотрудниками Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (М.Е. Валиева, А.В. Любителев, С.В. Разин), Института биологии гена РАН (Кантидзе О.Л., Лужин А.В., Голов А.К., Величко А.К.), Fox Chase Cancer Center, USA (Nizovtseva EV, Studitsky VM, Kulaeva, O.I., Chang, H.-W.), Roswell Park Comprehensive Cancer Center, USA (Gurova KV, Safina A., Wang, J.,), Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development, USA (Chereji, R.V.), Rutgers University, USA (Morozov, A.V.).

Публикации

  1. Kantidze OL, Luzhin AV, Nizovtseva EV, Safina A, Valieva ME, Golov AK, Velichko AK, Lyubitelev AV, Feofanov AV, Gurova KV, Studitsky VM, Razin SV (2019). The anti-cancer drugs curaxins target spatial genome organization. Nat Commun 10 (1), 1441
  2. Chang HW, Valieva ME, Safina A, Chereji RV, Wang J, Kulaeva OI, Morozov AV, Kirpichnikov MP, Feofanov AV, Gurova KV, Studitsky VM (2018). Mechanism of FACT removal from transcribed genes by anticancer drugs curaxins. Sci Adv 4 (11), eaav2131

Структурные основы влияния патогенных мутаций в трансмембранных доменах на функционирование клеточных рецепторов

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии

Мутации в мембранных белках часто ассоциированы с патогенными процессами в организме человека, в том числе с нейродегенеративными и онкогенными заболеваниями. При помощи белковой инженерии, ЯМР-спектроскопии и компьютерного моделирования раскрыт простой молекулярный механизм развития болезни Альцгеймера (AD), связанный с влиянием семейной «Австралийской» мутации L723P на структурно-динамические свойства трансмембранного (ТМ) сегмента белка-предшественника β-амилоида (АРР). Мутация приводит к анормальному расщеплению белка АРР ферментами-секретазами и интенсивному накоплению патогенных форм β-амилоида вокруг нейронов. Примечательно, что возрастное развитие болезни можно объяснить схожими механизмами, где вместо мутации будут действовать, например, окислительный стресс или определенный липидный состав мембран нейронов, включая избыток холестерина.

«Аномальная» динамика воды в трансмембранной поре ионного канала TRPV1

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Методами компьютерного моделирования на примере ионного канала TRPV1 показано, что поведение воды в биологических порах нанометрового масштаба радикально отличается как от поведения свободной воды, так и от воды вблизи поверхности белка. В ограниченном объеме канала (~ 60 молекул воды) вода локализована в компактных областях вблизи некоторых полярных групп белка. Времена жизни молекул воды в областях локализации в 1,5-3 раза больше, чем вблизи аналогичных групп на поверхности белка. Эти эффекты могут играть важную роль в механизмах функционирования ионных каналов. В частности, локализация воды вблизи полярных групп Asn676 в канале TRPV1 облегчает гидратацию т.н. «нижних ворот» гидрофобной поры, понижая тем самым энергетический барьер для прохождения ионов и молекул воды через канал.

Влияние диэлектрических свойств среды на параметры водородных связей в биомембранах - путь к рациональному дизайну новых наноматериалов.

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Методами атомистического компьютерного моделирования исследована роль диэлектрических свойств среды в формировании водородных связей (Н-связей) в соединениях, имитирующих донорные/акцепторные группы фосфолипидов. Показано, что величина свободной энергии образования комплексов с Н-связями (ddG) критическим образом зависит от значения локальной диэлектрической проницаемости окружения (ε), которое, в свою очередь, определяется глубиной расположения соответствующих групп в мембране. Максимальный выигрыш в значениях ddG (~ 11 ккал/моль) наблюдается для взаимодействий донорной NH3+ группы с акцепторными группами C=O и O(H). При этом наиболее сильные Н-связи формируются в неполярном окружении с ε < 17. Полученные результаты обеспечивают понимание на молекулярном уровне основ структурно-динамического поведения клеточных мембран и позволяют осуществлять рациональный дизайн искусственных мембранных наноматериалов с заданными свойствами.

Никотиновые рецепторы ацетилхолина (nAChR) играют важную роль в физиологии клеток эпителия, а их активация способствует развитию карцином. Природные модуляторы никотиновых рецепторов ацетилхолина могут стать перспективными прототипами новых противоопухолевых средств.

Показано, что рекомбинантные препараты трехпетельных белков человека ws-Lynx1 и rSLURP-1 ингибируют рост клеток карциномы легкого и меланомы. Препарат ws-Lynx1 в клетках А549 стимулирует антипролиферативные и проапоптотические сигнальные каскады, связанные с активацией α7-nAChR. Препарат rSLURP-1 тормозит никотин-индуцированный рост клеток карциномы легкого, а также отменяет вызванное никотином увеличение экспрессии α7-nAChR и снижение экспрессии гена-онкосупрессора PTEN. Кроме того, rSLURP-1 тормозит рост мультиклеточных сфероидов из клеток различных карцином. Совместное применение rSLURP-1 с другими противоопухолевыми препаратами (гефитиниб, бортезомиб, доксорубицин) приводит к полной остановке роста сфероидов.

Таким образом, препараты ws-Lynx1 и rSLURP-1 представляют собой перспективные прототипы для разработки новых препаратов для лечения онкологических заболеваний.

На примере двух высокогомологичных флуоресцентных белков из Zoanthus sp. (zoanGFP и zoan2RFP) определены аминокислотные остатки (а.к.о.), участвующие в превращении белка с зеленой флуоресценцией (GFP) в красный флуоресцентный белок (RFP). Нами был проведен мутагенез zoanGFP, в результате которого внутренние аминокислоты (а.к.о.) оказались идентичными zoan2RFP. Однако полученный мутант zoanGFPmut претерпевал лишь частичное превращение в красную форму. С целью выяснения дополнительных факторов, влияющих на созревание RFP, с помощью сравнительной молекулярной динамики zoanGFPmut и zoan2RFP были выявлены а.к.о. на поверхности белка, потенциально влияющие на расположение и подвижность а.к.о. вокруг хромофора. Сайт-направленный мутагенез этих внешних а.к.о. подтвердил их важную роль в биосинтезе хромофора RFP.

Ранее для проектирования пептидов с заданной функцией мы предложили использовать удобный структурный каркас, а именно α-гарпининовую укладку, характерную для токсинов из яда скорпионов и защитных пептидов растений. Теперь использование разработанного нами метода белковой топографии позволило существенно улучшить свойства искусственного α-гарпинина, блокирующего калиевые каналы Kv1.3, важную фармакологическую мишень. Совместное использование двух подходов ‑ «скаффолд-инженерии» и белковой топографии ‑ позволяет получать оптимизированные лиганды ионных каналов.

Впервые определены структуры трех ключевых низкомолекулярных компонентов биолюминесцентной системы морских полихет Odontosyllis undecimdonta: люциферина, оксилюциферина (Green), а также продукта неспецифического окисления люциферина (Pink) кислородом. Установлено, что эти соединения имеют крайне необычный гетероциклический скелет, содержащий три атома серы с различными степенями окисления. Предложены химические механизмы ферментативного (люминесцентного) и неферментативного оксиления люциферина Odontosyllis. Более того, выявлено, что оксилюциферин Odontosyllis является единственным из известных для морских люминесцентных организмов первичным эмиттером зеленого света.

Публикации

  1. Kotlobay AA, Dubinnyi MA, Purtov KV, Guglya EB, Rodionova NS, Petushkov VN, Bolt YV, Kublitski VS, Kaskova ZM, Ziganshin RH, Nelyubina YV, Dorovatovskii PV, Eliseev IE, Branchini BR, Bourenkov G, Ivanov IA, Oba Y, Yampolsky IV, Tsarkova AS (2019). Bioluminescence chemistry of fireworm Odontosyllis. Proc Natl Acad Sci U S A 116 (38), 18911–18916

Создана база данных всех известных пептидных лигандов калиевых каналов – Kalium 2.0

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии

Ранее нами была создана исчерпывающая база данных токсинов скорпионов, действующих на калиевые каналы, получившая название Kalium. Теперь она была расширена и включает вообще все известные лиганды калиевых каналов пептидной природы. Вместе с ресурсом Guide to PHARMACOLOGY, содержащим информацию о низкомолекулярных лигандах, база данных Kalium 2.0 предоставляет исследователям всеобъемлющую информацию об этой важнейшей группе соединений.

По традиции, наша инициатива получила широкое одобрение сообщества, в качестве экспертов Kalium 2.0 выступили ведущие мировые специалисты в области лигандов ионных каналов. Подробнее читай в пресс-релизе на сайте РНФ. База данных Kalium 2.0 доступна по ссылке.

Взаимодействие вольт-сенсорного токсина Hm-3 с потенциал-чувствительным доменом Na+ канала Nav1.4: структурный взгляд на связывание опосредованное мембраной

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов,  Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии,  Лаборатория структурной биологии ионных каналов

Потенциалозависимые Na+ каналы (Nav) играют важнейшую роль в функционировании сердечно-сосудистой, мышечной и нервной систем. Некоторые мутации вызывают токи утечки через потенциал-чувствительные домены (VSD) каналов Nav, которые приводят к различным заболеваниям. Гипокалиемический периодический паралич (HypoPP) 2 типа вызван мутациями в сегментах S4 VSD в канале NaV1.4 скелетных мышц человека. Вольт-сенсорный токсин Hm-3 из яда паук Heriaeus melloteei подавляет токи утечки через такие мутантные каналы. Для изучения механизма взаимодействия Hm-3 и канала NaV1.4 мы сосредоточились на исследовании изолированного домена VSD-I с помощью ЯМР-спектроскопии в среде имитирующей мембрану. Модель комплекса Hm-3/VSD-I была построена методом белок-белкового докинга с использованием ограничений ЯМР. Токсин изначально закрепляется на поверхности мембраны, а затем образует комплекс с петлей S3b-S4 VSD-I. Связывание Hm-3 блокирует движение спирали S4 – датчика-потенциала и индуцирует аллостерические изменения, которые препятствуют появлению токов утечки. Наша работа является первым структурным ЯМР-исследованием взаимодействия между вольт-сенсорными токсинами и каналами Nav.

Публикации

  1. Männikkö R, Shenkarev ZO, Thor MG, Berkut AA, Myshkin MY, Paramonov AS, Kulbatskii DS, Kuzmin DA, Castañeda MS, King L, Wilson ER, Lyukmanova EN, Kirpichnikov MP, Schorge S, Bosmans F, Hanna MG, Kullmann DM, Vassilevski AA (2018). Spider toxin inhibits gating pore currents underlying periodic paralysis. Proc Natl Acad Sci U S A 115 (17), 4495–4500

Установлен молекулярный механизм конститутивной активации рецепторной тирозин-киназы PDGFRA, опосредованной траснмембранным доменом

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

В сотрудничестве с экспериментальными группами проф. Ж.-Б. Демолина (Институт Де Дюва, Брюссель Бельгия) и проф. А. С. Арсеньева (ИБХ РАН) исследован молекулярный механизм активации рецепторных тирозинкиназ, опосредованной трансмембранным (ТМ) доменом,  на примере рецептора фактора роста тромбоцитов (PDGFRA) и его онкогенного мутанта V536E. Разработанная уникальная вычислительная платформа позволила просканировать все возможные позиции в ТМ-спирали рецептора и идентифицировать функциональные мутации для дикого типа и онкогенного мутанта, а также выявить взаимосвязь между активностью рецептора и димеризацией ТМ доменов по нескольким доступным участкам взаимодействия (интерфейсам). Найдены и протестированы на культуре клеток новая активирующая мутация I537D для дикого типа, а также мутация S541G, элиминирующая повышенную конститутивную активность онкогенного мутанта V536E. 

Публикации

  1. Polyansky AA, Bocharov EV, Velghe AI, Kuznetsov AS, Bocharova OV, Urban AS, Arseniev AS, Zagrovic B, Demoulin JB, Efremov RG (2019). Atomistic mechanism of the constitutive activation of PDGFRA via its transmembrane domain. BIOCHIM BIOPHYS ACTA 1863 (1), 82–95

А.В. Феофанов (Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул), О.В. Некрасова, К.С. Кудряшова (Отдел биоинженерии, группа нанобиоинженерии), А.А. Василевский, А.И. Кузьменков, А.М. Гиголаев (Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии), А.О. Чугунов, В.М. Табакмахер, Р. Г. Ефремов (Группа анализа структуры мембранных белков in silico, Лаборатория моделирования биомолекулярных систем).

Исследован уникальный высокоаффинный и высокоселективный пептидный блокатор канала Kv1.2 - MeKTx11-1 из яда скорпиона Mesobuthus eupeus. Пептид MeKTx11-1 и его мутантные аналоги были получены в рекомбинантной форме, их рецептор-связывающая активность изучена на панели Kv1-каналов. Проведено молекулярное моделирование взаимодействия этих пептидов с каналом Kv1.2, установлены ключевые структурные детерминанты этого взаимодействия. Пептид MeKTx11-1 является новым эффективным молекулярным инструментом для нейробиологии, позволяющим идентифицировать и изучать активность канала Kv1.2 в присутствии различных изоформ Kv1-каналов.

В сотрудничестве с S.Peigneur, J.Tytgat из University of Leuven, Бельгия и А.Ф. Фрадковым из ООО Евроген.

Ефременко А.В., Шаронов Г.В., Феофанов А.В. (Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул), Люкманова Е.Н., Бычков М.Л., Шулепко М.А., Кульбатский Д.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. (Группа биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов, Отдел биоинженерии), Шенкарев З.О (Группа структурной биологии ионных каналов).

Обнаружено, что секретируемый белок человека SLURP-1, который экспрессируется в эпителиальных клетках и контролирует их пролиферацию и миграцию, подавляет рост раковых клеток эпителиального происхождения. Воздействие SLURP-1 на раковые клетки характеризуется положительной обратной связью: экзогенный (рекомбинантный) SLURP-1 связывается с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами α7 типа и запускает каскад сигналов, который активирует секрецию эндогенного SLURP-1, быстро повышая его концентрацию в межклеточном пространстве и усиливая антипролиферативное действие.  Концентрации SLURP-1, подавляющие деление опухолевых клеток, не влияют на рост нормальных клеток.

Предложен молекулярный механизм передачи сигнала рецептором hGHR

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии

На основе структурно-динамических ЯМР-исследований детально описаны аллостерические конформационные перестройки и межмолекулярные взаимодействия трансмембранного домена рецептора гормона роста человека, hGHR, инициированные связыванием лиганда. В результате был предложен молекулярный механизм передачи сигнала рецептором hGHR.

Разработка метода оценки мембраноподобных сред и поиск новых составов для исследования мембранных белков

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии

С использованием спектроскопии ЯМР был разработан новый метод оценки корректности структуры мембраноподобных сред на основе бицелл, основанный на детекции фазовых переходов липидов в бицеллах, а также изучены свойства фазового перехода  в зависимости от параметров изучаемых смесей. В серии работ были исследованы характеристики множества различных составов бицелл, найдены среды, способные имитировать различные аспекты поведения клеточной мембраны. Разработаны новые составы, с помощью которых можно изучать мембранные белки с большими водорастворимыми доменами и отслеживать влияние состава мембраны на поведение мембранного белка. 

Дизайн антимикробного пептида с пониженной гемолитической активностью на основе комбинирования фрагментов (мотивов) пептидов из яда пауков. С помощью молекулярной динамики в крупнозернистом приближении оценена глубина проникновения природных пептидов (Ltc1, Oxt 4a) из яда паука в мембрану эритроцитов. Искусственный пептид  (P5) сформирован из фрагментов, не проникающих глубоко в такую мембрану (в круге - см. Рис.), или пептида, глубоко проникающего, и, следовательно, гемолитически активного, но с пониженной за счет аминокислотной замены L/K степенью гидрофобности (в эллипсе).

Механизм самопроизвольного прохождения вискумина А через мембрану

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

На примере цепи A токсина вискумин исследован in silico один из возможных механизмов спонтанного прохождения водорастворимых белков через мембрану. Показано, что в ходе молекулярной динамики в смеси хлороформ/метанол вискумин A «выворачивается» наружу: на поверхности белка оказываются гидрофобные участки, изначально находившиеся внутри глобулы. При этом увеличивается длина участков регулярной вторичной структуры белка. Конформационный поиск методом Монте-Карло в присутствии неявно заданной мембраны показал, что полученные структуры способны связываться с мембраной, в отличие от структуры в воде. 

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии систематически изучает яды членистоногих, выделяя из них пептиды, специфично и с высокой активностью модулирующие активность разнообразных ионных каналов. Яд скорпионов особенно богат пептидными поровыми блокаторами потенциал-чувствительных калиевых каналов (Kv), и это разнообразие мы отразили в ранее созданной базе данных таких пептидов Kalium.

В сотрудничестве с Лабораторией оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул и Группой нанобиоинженерии с применением разработанной ранее уникальной системы скрининга из яда скорпиона Mesobuthus eupeus был выделен пептидный блокатор канала Kv1.2 MeKTx11-1, связывающийся с высокой аффинностью (IC50 ≈0,2 нМ) и специфичностью (эффект на каналах Kv1.1, 1.3 и 1.6 проявляется в концентрациях в сотни раз выше). Этот пептид отличается всего двумя остатками от родственного MeKTx11-3, обладающего существенно меньшей селективностью в отношении Kv1.2.

В Группе анализа структуры мембранных белков in silico провели молекулярное моделирование взаимодействия этих двух пептидов с каналом Kv1.2, помещенным в явно заданную бислойную липидную мембрану, и объяснили механизм селективного действия MeKTx11-1. Выработанная методика анализа позволит создавать новые селективные лиганды Kv и других каналов, востребованные как в качестве молекулярных инструментов для изучения нервной системы, так и для медицины.

Токсин из яда паука-бокохода Heriaeus melloteei может стать основой для создания лекарства от гипокалиемического периодического паралича второго типа, надежного лекарства от всех случаев которого не существует. Причиной заболевания служат мутации гена потенциал-чувствительных натриевых каналов NaV1.4, характерных для скелетных мышц. В результате мутаций эти каналы проводят аберрантные токи, мышцы оказываются неспособны отвечать на сигналы нервной системы, и развивается слабость вплоть до паралича. Токсин Hm-3 оказался способным селективно блокировать такие токи, протекающие через потенциал-чувствительных домен I мутантных каналов. Подробнее в пресс-релизе на сайте ИБХ.

Публикации

  1. Männikkö R, Shenkarev ZO, Thor MG, Berkut AA, Myshkin MY, Paramonov AS, Kulbatskii DS, Kuzmin DA, Castañeda MS, King L, Wilson ER, Lyukmanova EN, Kirpichnikov MP, Schorge S, Bosmans F, Hanna MG, Kullmann DM, Vassilevski AA (2018). Spider toxin inhibits gating pore currents underlying periodic paralysis. Proc Natl Acad Sci U S A 115 (17), 4495–4500

Новые антимикробные пептиды из древних морских беспозвоночных

Лаборатория структурной биологии ионных каналов,  Отдел «Учебно-научный центр»

В рамках работы по изучению антимикробных пептидов (АМП) животных, проводимой в Учебно-научном центре ИБХ РАН, были обнаружены новые защитные катионные пептиды из древних морских беспозвоночных – никомицины-1 и -2 из небольшой Арктической полихеты Nicomache minor и полифемузин III (PM III) из мечехвоста Limulus polyphemus, а также изучены их структурные и биологические свойства. В ходе работы были получены рекомбинантные аналоги природных АМП и изучена их пространственная структура. Никомицины обладают пространственной структурой, включающей амфипатическую N-концевую α-спираль и C-концевую петлю, состоящую из шести аминокислотных остатков и стабилизированную дисульфидной связью. Структура никомицина уникальна среди AMП полихет и сходна со структурой α-спиральных защитных AMП из кожи лягушек, содержащих С-концевой мотив Rana-box, также стабилизированный дисульфидным мостиком. Никомицин-1 проявляет выраженную активность в отношении грамположительных бактерий в субмикромолярных концентрациях. Предполагается, что механизм действия никомицина-1 связан с повреждением клеточной мембраны, а не с ингибированием процесса биосинтеза белка. Структурный анализ последовательности препроникомицинов показывает, что домен BRICHOS может принимать участие в биосинтезе не только β-шпилечных АМП полихет, но и α-спиральных пептидов, а именно, никомицинов. PM III представляет собой β-шпилечный АМП, который способен быстро повышать проницаемость цитоплазматической мембраны клеток лейкемии человека HL-60. Эксперименты с использованием проточной цитометрии с двойным окрашиванием аннексином V-FITC / пропидий йодидом показали, что ингибитор каспазы Z-VAD-FMK практически не влияет на действие пептида PM III. Полученные данные свидетельствуют о том, что PM III нарушает целостность плазматической мембраны и вызывает гибель клеток по механизму, предположительно, не связанному с апоптозом. По сравнению со своими природными изоформами – полифемузинами и тахиплезинами, PM III проявляет аналогичную или более низкую антибактериальную активность, но значительно более высокую цитотоксичность в отношении опухолевых и трансформированных клеточных линий человека в условиях in vitro.

Авторы: Апарин И.О., Проскурин Г.В., Прохоренко И.А., Коршун В.А. (Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза), Шенкарев З.О. (Группа структурной биологии ионных каналов), Парамонов А.С. (Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии), Рогожин Е.А. (Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов).

Установлена структура двух компонентов липопептидного антибиотика кристалломицина из образца, полученного 60 лет назад. Установлена идентичность компонентов кристалломицина двум компонентам аспартоцина, структура которых была выяснена недавно. Антибиотик проявляет Ca2+-зависимую активность к грам-положительным бактериям. С помощью ЯМР исследованы конформации кристалломицина 2 в растворе.

В составе пептидного антибиотика INA-5812 обнаружена аминокислота 4-хлор-L-кинуренин, ранее встречавшаяся в природных продуктах лишь однажды. Нами впервые описаны флуоресцентные свойства 4-хлор-L-кинуренина и его использование в качестве донора энергии для возбуждения других флуорофоров.

С использованием различных методов 2D ЯМР установлена структура двух новых макролидных антибиотиков, астолидов А и Б. Молекулы астолидов одновременно содержат в качестве агликонов мембрано-активный полиольный макролид и редокс-активный нафтохиноновый остаток. Наличие гидроксильной группы в положении 18 принципиальным образом меняет спектр биологической активности по сравнению с известными аналогами – возрастает противогрибковая активность и снижается цитотоксичность.

Публикации

  1. Alferova VA, Shuvalov MV, Suchkova TA, Proskurin GV, Aparin IO, Rogozhin EA, Novikov RA, Solyev PN, Chistov AA, Ustinov AV, Tyurin AP, Korshun VA (2018). 4-Chloro-l-kynurenine as fluorescent amino acid in natural peptides. Amino Acids 50 (12), 1697–1705
  2. Alferova VA, Novikov RA, Bychkova OP, Rogozhin EA, Shuvalov MV, Prokhorenko IA, Sadykova VS, Kulko AB, Dezhenkova LG, Stepashkina EA, Efremov MA, Sineva ON, Kudryakova GK, Peregudov AS, Solyev PN, Tkachev YV, Fedorova GB, Terekhova LP, Tyurin AP, Trenin AS, Korshun VA (2018). Astolides A and B, antifungal and cytotoxic naphthoquinone-derived polyol macrolactones from Streptomyces hygroscopicus. Tetrahedron 74 (52), 7442–7449
  3. Jiang ZK, Tuo L, Huang DL, Osterman IA, Tyurin AP, Liu SW, Lukyanov DA, Sergiev PV, Dontsova OA, Korshun VA, Li FN, Sun CH (2018). Diversity, novelty, and antimicrobial activity of endophytic actinobacteria from mangrove plants in Beilun Estuary National Nature Reserve of Guangxi, China. Front Microbiol 9 (MAY), 868
  4. Tyurin AP, Alferova VA, Paramonov AS, Shuvalov MV, Malanicheva IA, Grammatikova NE, Solyev PN, Liu S, Sun C, Prokhorenko IA, Efimenko TA, Terekhova LP, Efremenkova OV, Shenkarev ZO, Korshun VA (2018). Crystallomycin revisited after 60 years: Aspartocins B and C. Medchemcomm 9 (4), 667–675

Обнаружено, что секретируемый белок человека SLURP-1, который экспрессируется в эпителиальных клетках и контролирует их пролиферацию и миграцию, подавляет рост раковых клеток эпителиального происхождения.

Воздействие SLURP-1 на раковые клетки характеризуется положительной обратной связью: экзогенный (рекомбинантный) SLURP-1 связывается с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами α7 типа на поверхности клеток и запускает каскад сигналов, который мгновенно активирует секрецию эндогенного SLURP-1 из внутриклеточных депо, быстро повышая его концентрацию в межклеточном пространстве и усиливая антипролиферативное действие.

Концентрации SLURP-1, подавляющие деление опухолевых клеток, не влияют на рост нормальных клеток.

Пространственная структура и структурно-функциональная взаимосвязь зеленого флуоресцентного белка WasCFP.

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров

Методом рентгеноструктурного анализа установлена пространственная структура рН зависимого зеленого флуоресцентного белка WasCFP с хромофором на основе Trp при экстремально низком значении pH 2.0 с разрешением 1.3Å (ранее нами были установлены структуры при рН 10.0, 8.0 и 5.5). Показано, что последовательное изменение рН с 10.0 до 2.0 сопровождается плавными изменениями спектральных свойств коррелирующими с синхронными изменениями конформаций боковых цепей остатков в области хромофора. Влияние взаимодействия хромофора с ключевыми аминокислотными остатками из ближайшего окружения исследовано методом квантовой химии.

Яд скорпионов богат пептидными блокаторами потенциал-чувствительных калиевых каналов (KV), и это разнообразие мы отразили в ранее созданной базе данных таких пептидов Kalium. Из яда скорпиона Mesobuthus eupeus получен высокоаффинный и селективный блокатор каналов KV1.2, характерных для центральной нервной системы человека. С применением молекулярного моделирования и сайт-направленного мутагенеза изучен механизм селективного взаимодействия токсина и каналов.

Оксана В. Некрасова, К.С. Кудряшова (Отдел биоинженерии, группа нанобиоинженерии), А.А. Василевский, А.И. Кузьменков, А.М. Гиголаев (Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии), А.О. Чугунов, В.М. Табакмахер, Р. Г. Ефремов (Группа анализа структуры мембранных белков in silico, Лаборатория моделирования биомолекулярных систем), А.В. Феофанов (Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул).

Исследован уникальный высокоаффинный и высокоселективный пептидный блокатор канала Kv1.2 - MeKTx11-1 из яда скорпиона Mesobuthus eupeus. Пептид MeKTx11-1 и его мутантные аналоги были получены в рекомбинантной форме, их рецептор-связывающая активность изучена на панели Kv1-каналов. Проведено молекулярное моделирование взаимодействия этих пептидов с каналом Kv1.2, установлены ключевые структурные детерминанты этого взаимодействия. Пептид MeKTx11-1 является новым эффективным молекулярным инструментом для нейробиологии, позволяющим идентифицировать и изучать активность канала Kv1.2 в присутствии различных изоформ Kv1-каналов.

В сотрудничестве с S.Peigneur, J.Tytgat из University of Leuven, Бельгия и А.Ф. Фрадков из ООО Евроген.

Супрамеры на основе амфифильных молекул липид-олигопептид-биотин

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория углеводов,  Лаборатория молекулярной биофизики

Обнаружено, что соединения на основе олигопептидов с концевыми липидным и биотиновым фрагментами, в водной среде способны образовывать мицеллоподобные однородные по размерам и внутренней структуре супрамеры (глобулы). Методами оптической спектроскопии, атомно-силовой и электронной микроскопии, а также малоуглового рентгеновского рассеяния и компьютерного моделирования показано, что глобулы весьма однородны по размерам (около 14, 6 нм). Показано, что ядро глобул содержит липидные и, частично, биотиновые фрагменты, а определенным образом свернутые олигопептиды, образуют оболочку. Часть (до 10%) биотиновых фрагментов экспонирована наружу, и может быть использована для селективного присоединения заданных молекул. Мицеллоподобные супрамеры, содержащие естественные для живого организма соединения, могут стать основой новых типов транспортеров для адресной доставки лекарств.

В лекарственном растении Laurus nobilis обнаружен протон-независимый активатор кислото-чувствительных каналов ASIC3 с необычными фармакологическими свойствами.

Лаборатория биофармацевтики,  Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория моделирования биомолекулярных систем,  Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Целенаправленный поиск новых лигандов к ионным каналам семейства ASIC привел к обнаружению в листьях благородного лавра алкалоида линдолдхамин, который может активировать канал ASIC3 при физиологических значениях pH. Было продемонстрировано, что закисление внеклеточной среды, которое в норме приводит к активации ионного канала, не является необходимым условием для открытия, как человеческой, так и крысиной изоформы ASIC3 канала. Электрофизиологические исследования на гетерологически экспрессированных ионных каналах ASIC3 выявили различия в модуляции активности человеческой и крысиной изоформы линдолдхамином. С помощью различных протоколов было показано, что связывание линдолдхамина с человеческой изоформой ASIC3 канала в закрытом состоянии приводит к 2 кратному росту амплитуды транзиентного тока в ответ на кислотный рН стимул; при этом на крысиную изоформу ASIC3 лиганд не влиял. Протон независимая активация крысиного канала также была существенно ниже по амплитуде регистрируемого тока. В итоге были показаны существенные фармакологические отличия каналов ASIC3 человека и крысы при их взаимодействии с новым алколоидом, что еще раз доказывает неоднозначность возможной интерпретации данных, получаемых в тестировании на животных моделях, при разработке лекарственных средств для людей. Уникальные фармакологические свойства линдолдхамина позволяют позиционировать его как новый инструмент для изучения активности каналов ASIC, и для изучения синаптической пластичности нервной системы в целом, так как решающая роль этих каналов в этом процессе давно доказана. Уникальным свойством нового лиганда является способность конкурировать с протонами, вызывающими десенситизацию транзиентного тока ASIC3 канала, таким образом, что на кривой рН-зависимости десенситизации наблюдается увеличение амплитуды транзиентного тока, а не сдвиг кривой в область более кислых значений. Ни для одного известного лиганда ASIC такой эффект опубликован ранее не был.

Активация рецепторных тирозинкиназ сопровождается изменением структурно-динамических параметров липидного бислоя мембраны вблизи белка

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Для детализации и визуализации предложенного авторами в 2014-2016 гг. оригинального липид-опосредованного механизма активации рецепторных тирозинкиназ (РТК) разработана вычислительная методика картирования динамических белок-липидных контактов на поверхности трансмембранных спиралей, а также способ учета изменения конфигурационной энтропии липидных молекул вследствие возмущений, вызванных в липидном бислое альфа-спиральными димерами белков в разных конформационных состояниях. Методика апробирована в ходе анализа длительных траекторий молекулярной динамики, рассчитанных для различных состояний трансмембранных димеров РТК в бислое ПОФХ – рецепторов PDGFRa и EGFR. Показано, что конформации, соответствующие активному состоянию димеризованного рецептора, оказывают более выраженное возмущение липидного бислоя по сравнению с неактивными.

Локальные конформационные изменения в молекулах цитотоксинов влияют на механизм их взаимодействия с мембранами

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Локальная конформационная подвижность жестко структурированных и стабильных молекул цитотоксинов (ЦТ) оказывает влияние на их мембрано-активные свойства. На основании данных молекулярной динамики (МД) трех ЦТ (ЦТ 1, 2 из Naja oxiana и ЦТ А3 из Naja atra) в воде и анализа распределений значений двугранных углов аминокислотных остатков основной цепи выявили общие для исследуемых белков конформационные состояния, характеризующиеся высокоамплитудными изменениями двугранных углов φ и ψ в паре остатков (K5/L6). Указанные локальные конформационные изменения ЦТ являются специфическими «горячими точками», меняющими организацию функционально-активного гидрофобного паттерна (т.н. «гидрофобной подошвы») этих белков. Именно этот мотив отвечает за связывание ЦТ с клеточными мембранами. В ходе МД «подошва» может обратимо разделяться на два участка меньших размеров (Рисунок). Таким образом молекулы ЦТ осуществляют «тонкую подстройку» своей пространственной структуры при связывании с поверхностью клеточной мембраны в зависимости от размеров гидрофобных/гидрофильных кластеров на поверхности липидного бислоя.

Публикации

  1. Konshina AG, Krylov NA, Efremov RG (2017). Cardiotoxins: Functional Role of Local Conformational Changes. J Chem Inf Model 57 (11), 2799–2810

Формирование пор в липидных мембранах: построение теории на основе молекулярного моделирования и экспериментальных данных

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Перенос веществ через липидную мембрану может происходить с образованием пор. Атомистические детали структурных перестроек, возникающих в липидном бислое мембран при формировании пор, до сих пор не понятны. В работе исследовали зависимость времени жизни мембранных пленок из различных липидов от приложенного электрического напряжения. Кроме того, с помощью расчетов молекулярной динамики (МД) изучен процесс затягивания предварительно сформированной поры в бислое. Анализ полученных данных позволил усовершенствовать современную теорию, описывающую энергетические аспекты возникновения пор в липидной мембране. На основании результатов МД сделано предположение о том, что возникновение поры сопряжено с формированием гидрофобного дефекта в мембране при малых радиусах поры. При переходе от состояния системы с гидрофобной поверхностью поры к состоянию с гидрофильной поверхностью необходимо преодолеть энергетический барьер. Сделан вывод о том, что при изменении радиуса поры линейное натяжение в бислое на границе поры зависит от ее радиуса. Предложенная теория хорошо согласуется с экспериментальными данными.

Публикации

  1. Akimov SA, Volynsky PE, Galimzyanov TR, Kuzmin PI, Pavlov KV, Batishchev OV (2017). Pore formation in lipid membrane II: Energy landscape under external stress. Sci Rep 7 (1), 12509
  2. Akimov SA, Volynsky PE, Galimzyanov TR, Kuzmin PI, Pavlov KV, Batishchev OV (2017). Pore formation in lipid membrane I: Continuous reversible trajectory from intact bilayer through hydrophobic defect to transversal pore. Sci Rep 7 (1), 12152

Механизмы интернализации и особенности внутриклеточного распределения магнитных наночастиц, функционализированных фолиевой кислотой

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул

А.А. Игнатова, А.В. Феофанов

Ориентированные на тераностику флуоресцентно-меченые наночастицы оксида железа, покрытые полиэтиленгликолем и функционализированные фолиевой кислотой, эффективно накапливаются в клетках карциномы шейки матки HeLa с высоким уровнем мембранных фолатных рецепторов.

Проникновение наночастиц в клетки HeLa происходит преимущественно путем клатрин-зависимого эндоцитоза при слабом участии кавеолин-опосредованного эндоцитоза и завершается их концентрированием в лизосомах.

Работа выполнена в сотрудничестве с А.Шибановой (Биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова), E. Allard-Vannier, K. Hervé-Aubert, K. Kaaki, T. Blondy, M.L. Saboungi, I. Chourpa (EA 6295 Nanomédicaments et Nanosondes, Université F. Rabelais de Tours, Tours, France).

Публикации

  1. Allard-Vannier E, Hervé-Aubert K, Kaaki K, Blondy T, Shebanova A, Shaitan KV, Ignatova AA, Saboungi ML, Feofanov AV, Chourpa I (2017). Folic acid-capped PEGylated magnetic nanoparticles enter cancer cells mostly via clathrin-dependent endocytosis. BIOCHIM BIOPHYS ACTA 1861 (6), 1578–1586

Были получены структуры трансмембранной и примембранной частей  рецептора TLR4 с использованием спектроскопии ЯМР в различных мембранных окружениях, в том числе фосфолипидных бицеллах. Показано, что примембранная область TLR4 является частью длинной трансмембранной α-спирали. Был найден интерфейс димеризации TM-домена и показано, что такие длинные TM-домены с заряженными аминокислотами - это общая черта всех белков семейства TLR, что позволяет по-другому взглянуть на механизм активации  рецепторов TLR. Наконец, была предложена модель полноразмерного рецептора TLR4 в димерном состоянии на основе структур отдельно взятых доменов.

Потенциалозависимые Na+ каналы играют важнейшую роль в функционировании сердечно-сосудистой, мышечной и нервной систем. α-субъединица Na+ канала состоит из ~2000 аминокислотных остатков, что значительно затрудняет структурные исследования полноразмерных каналов. Методом ЯМР-спектроскопии мембраномоделирующем окружении, был исследован изолированный потенциалочувствительный домен (VSD-II) канала Nav1.4 скелетных мышц человека. Вторичная структура VSD-II схожа со структурой бактериальных Na+ каналов. Часть спирали S4 между первым и вторым консервативными остатками Arg, вероятно, имеет конформацию 3/10-спирали. Данные о релаксации ядер 15N выявили характерную подвижность в мкс-мс временном диапазоне для участков VSD-II, участвующих в предполагаемых межспиральных контактах. VSD-II демонстрирует повышенную подвижность в пс-нс временном диапазоне по сравнению с изолированными VSD K+ каналов.

РАЗРАБОТКА ЭФФЕКТИВНОГО МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЕПТИДОВ α-KTX – БЛОКАТОРОВ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ

Группа нанобиоинженерии,  Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул

О.В.Некрасова, К.С. Кудряшова, С.А. Якимов, М.П.Кирпичников

А.В.Феофанов

Разработан биоинженерный метод получения пептидных блокаторов калиевых Kv1-каналов, который отличается:

  • высоким выходом целевых пептидов (12-22 мг/л культуры);
  • сохранением нативной аминокислотной последовательности пептидов;
  • высоким выходом ренатурированной формы пептидов с правильно замкнутыми тремя и четырьмя дисульфидными связями;
  • простой и надежной процедурой выделения и очистки.

Получаемые этим методом рекомбинантные пептиды семейства α-КТх обладают активностью исходных природных блокаторов. Пептидные высокоаффинные блокаторы калиевых каналов из яда скорпионов широко используются для изучения структуры и функции каналов и имеют перспективное медицинское значение.

Структурно-динамическая модель взаимодействия цитотоксина S-типа с мицеллами детергентов и липидными мембранами: спектроскопия ЯМР высокого разрешения и молекулярная динамика.

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория молекулярной токсинологии,  Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Расшифровка пространственной структуры мембранных пептидов и белков методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения предполагает использование сред, моделирующих мембранное окружение. Чаще всего в экспериментах используют мицеллы детергентов. Однако неясно, как перенести результаты таких исследований на липидный бислой. В настоящей работе предложен ответ на этот вопрос для бета-структурного белка, цитотоксина 1 S-типа, выделенного из яда кобры N. oxiana. Пространственная структура белка получена методом спектроскопии ЯМР в водном растворе и в мицеллах додецилфосфохолина (ДФХ). Методами молекулярной динамики (МД) в полноатомном и «крупнозернистом» (coarse-grained) приближениях исследовали встраивание белка в мицеллы ДФХ (Рисунок, левая панель) и в липидный бислой пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (Рисунок, правая панель). Показано, что встраивание токсина как в мицеллы, так и в мембраны сопровождается адаптацией молекулы белка к гидрофобно/ гидрофильной среде и конформационной перестройкой в районе окончания петли-II (Рисунок, левая панель). При этом в мицелле реализуется только одно связанное состояние молекулы токсина – окончаниями всех трёх петель молекулы. В бислое наблюдается усреднение между тремя модами связывания – окончаниями первой петли; окончаниями петель I и II; окончаниями всех трёх петель (Рисунок, правая панель, сверху-вниз).

Раскрыт механизм связывания и переноса липидов растительными липид-транспортирующими белками

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория структурной биологии ионных каналов,  Отдел «Учебно-научный центр»

Новые липид-транспортирующие белки (LTP) чечевицы, гороха и укропа были выделены и охарактеризованы в Учебно-научном центре ранее. В 2017 г. нами показана способность растительных LTP с различной эффективностью связывать и переносить широкий спектр липидных молекул. Установлено, что аффинность LTP по отношению к насыщенным и ненасыщенным жирным кислотам возрастает по мере уменьшения длины ацильных цепей.  Показано, что LTP эффективнее переносят анионный липид DMPG, чем цвиттерионный DMPC. Методами ЯМР-спектроскопии подтверждена более высокая аффинность LTP к анионным липидам и молекулам с небольшим размером гидрофобных цепей. Определена пространственная структура комплекса Lc-LTP2/LPPG. Установлено, что размер внутренней гидрофобной полости LTP увеличивается от 600 до 1000 А3 при связывании с липидами. Ацильные цепи LPPG или DMPG занимают пространство гидрофобной полости LTP, а головки липидов выступают наружу между α–спиральными участками Н1 и Н3. Другой вход в гидрофобную полость Lc-LTP2, ограниченный петлей между α–спиралями H2-H3 и С-концевым участком, играет важную роль во взаимодействии с поверхностью мембраны, участвует в поглощении липидов и определяет селективность LTP по отношению к лиганду. Полученные результаты впервые раскрывают механизм связывания и переноса липидов посредством LTP и углубляют понимание биологической роли растительных LTP.

Открыты первые пептидные лиганды, потенцирующие ответ TRPA1 рецепторов на агонисты, проявляющие обезболивающий и противовоспалительный эффекты.

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий,  Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Из морских анемон видов Metridium senile и Urticina eques выделены и охарактеризованы анальгетические пептиды Мs9а-1 и Ueq 12-1. Пептид Мs9а-1 содержит 35 аминокислотных остатков, а его пространственная структура стабилизирована двумя дисульфидными мостиками подобно ранее описанным  пептидам из морских анемон. Ueq 12-1 состоит из 45 аминокислотных остатков, включая 10 остатков цистеина с необычным распределением, образующих 5 дисульфидных связей, и является уникальным среди многообразия известных пептидов морских анемон. Являясь по сути принципиально новой обнаруженной пространственной структурой, пространственная укладка части полипептидной цепи молекулы Ueq 12-1 похожа на альфа дефензины млекопитающих. Возможно, именно поэтому пептид также обладает слабым антимикробным действием на грамм-положительные бактерии. Структурно непохожие друг не друга пептиды Мs9а-1 и Ueq 12-1 имеют схожий механизм действия и одну биологическую мишень. В тестах in vitro на ооцитах лягушки Xenopus laevis и клетках млекопитающих, экспрессирующих рецептор TRPA1, оба пептида усиливали действие прямых агонистов, таких как AITC и диклофенак. В тестах in vivo на мышах введение пептидов внутривенно давало значительный анальгетический и противовоспалительный эффект, при этом сами пептиды при введении не вызывали ни болевых ощущений ни тепловую гиперчувствительность. Обнаруженные эффекты пептидов связаны с тем, что при взаимодействии с TRPA1 пептиды делают рецептор более восприимчивым к распознаванию своих агонистов (потенцирующее действие), таким образом, при появлении эндогенных раздражителей, таких как, например, медиаторы воспаления, происходит десенситизация TRPA1-экспрессирующих нейронов. Способность этих веществ избирательно усиливать активность белка TRPA1 открывает новые возможности фундаментальных исследований и служит основой создания лекарств от боли и воспаления.

В яде многих пауков обнаружены двудоменные токсины, объединяющие в своей структуре модули, похожие на «простые» однодоменные токсины. Мы провели детальное структурное исследование тех токсинов, что состоят из дисульфид-богатых (похожих на обычные нейротоксины) и линейных (похожих на обычные цитотоксины) модулей. Линейные модули могут служить для ассоциации двудоменных токсинов с мембранами вследствие формирования амфифильных спиралей, характерных для мембрано-активных пептидов. Предложен механизм действия двудоменных токсинов по типу «мембранного доступа» (membrane access): линейные модули взаимодействуют с липидным бислоем, а дисульфид-богатые – с белковым рецептором.

Разработка эффективного метода получения рекомбинантных пептидов α-KTX – блокаторов калиевых каналов

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул,  Группа нанобиоинженерии

Разработан биоинженерный метод получения пептидных блокаторов калиевых Kv1-каналов, который отличается: высоким выходом целевых пептидов (12-22 мг/л культуры);

сохранением нативной аминокислотной последовательности пептидов; высоким выходом ренатурированной формы пептидов с правильно замкнутыми тремя и четырьмя дисульфидными связями; простой и надежной процедурой выделения и очистки. Получаемые этим методом рекомбинантные пептиды семейства α-КТх обладают активностью исходных природных блокаторов. Пептидные высокоаффинные блокаторы  калиевых каналов из яда скорпионов широко используются для изучения структуры и функции каналов и имеют перспективное медицинское значение.

Биомолекулярные инструменты для визуализации ионных каналов

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул

Участники:

Группа молекулярных инструментов для нейробиологии (А.И. Кузьменков, А.А. Василевский, Е.В. Гришин)

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул (А.В. Феофанов)

Группа нанобиоинженерии (К.С. Кудряшова, О.В. Некрасова)

Лаборатория молекулярной токсинологии (И.В. Шелухина)

Краткая формулировка:

Мы создали высокоаффинные химерные молекулы на основе флуоресцентных белков и токсинов скорпионов, селективно воздействующих на потенциал-чувствительные калиевые каналы человека. Мы также продемонстрировали возможности использования таких химер в нейробиологии для визуализации ионных каналов: изучения их локализации, профиля экспрессии в клетках, тканях и органах. Кроме того, представляется возможным использование новых инструментов для скрининговых технологий и диагностики целого ряда заболеваний.

Альтернативная димеризация ТМ домена рецептора EGFR и белок-липид опосредованный механизм активации РТК

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии

Рецептор эпидермального фактора роста EGFR, как представитель HER/ErbB семейства рецепторных тирозинкиназ (РТК), играет ведущую роль в процессах пролиферации и дифференциации клеток в норме и при патологиях организма человека. С помощью ЯМР-спектроскопии высокого разрешения мы показали, что смена мембранноподобного окружения приводит к альтернативной димеризации  трансмембранного  домена EGFR. Из сопоставления результатов исследования с литературными данными для лиганд-связывающих, примембранных и киназных доменов предложен новый механизм аллостерической передачи сигнала РТК через мембрану клетки посредством согласованных белок-липидного и белок-белковых взаимодействий, объясняющий ряд парадоксов, наблюдаемых при активации EGFR  и других РТК. 

Новый подход к исследованию молекулярных основ взаимодействия пептидных блокаторов с калиевым каналом Kv1.6

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул

Авторы: О.В.Некрасова, К.С. Кудряшова, С.А. Якимов, М.П.Кирпичников

(Отдел биоинженерии)

Ю.В. Королькова

(Отдел молекулярной нейробиологии)

А.В.Феофанов

(Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул)

 

            Разработан комплексный подход к поиску, исследованию и конструированию  пептидных блокаторов калиевого канала Kv1.6. Подход основан на применении разработанной нами биоинженерной аналитической системы для изучения связывания блокаторов с гибридным каналом KcsA-Kv1.6 методом конфокальной микроскопии и молекулярного моделирования комплексов пептидных блокаторов с каналом Kv1.6. Используя разработанный подход, охарактеризована аффинность ряда пептидных блокаторов к каналу Kv1.6, построены молекулярные модели их комплексов, описан интерфейс взаимодействия и аминокислотные остатки, влияющие на селективность  взаимодействия блокаторов с каналом Kv1.6.

 

Работа выполнена совместно с сотрудниками кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (К.В.Шайтан, В.Н.Новоселецкий, А.Д.Волынцева).

Публикации

  1. Nekrasova OV, Volyntseva AD, Kudryashova KS, Novoseletsky VN, Lyapina EA, Illarionova AV, Yakimov SA, Korolkova YV, Shaitan KV, Kirpichnikov MP, Feofanov AV (2017). Complexes of Peptide Blockers with Kv1.6 Pore Domain: Molecular Modeling and Studies with KcsA-Kv1.6 Channel. J Neuroimmune Pharmacol 12 (2), 260–276

Структурная реорганизации нуклеосом под действием белкового фактора FACT

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул

А.В.Феофанов

(Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул)

К.С. Кудряшова,  М.П.Кирпичников

(Отдел биоинженерии)

            Аннотация: Разработаны методики флуоресцентной микроскопии одиночных молекул, позволяющие изучать структурные перестройки ДНК в одиночных нуклеосомах под действием белковых факторов.  В исследованиях дрожжевого белкового фактора FACT (facilitates chromatin transcription) методом микроскопии одиночных молекул установлено, что  FACT вызывает масштабное, обратимое, АТФ-независимое раскручивание нуклеосомной ДНК. Это раскручивание происходит по механизму «все-или-ничего», симметрично, затрагивает не менее 70% ДНК, уложенной на гистоновом коре, и не приводит к потере гистонов. FACT-индуцированное раскручивание нуклеосомы усиливает доступность ДНК для ядерных ферментов, что является важнейшей функцией FACT in vivo.   

Публикации:

Valieva M.E., Armeev G.A., Kudryashova K.S., Gerasimova N.S., Shaytan A.K., Kulaeva O.I., McCullough L.L., Formosa T., Georgiev P.G., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Large-Scale ATP-Independent Nucleosome Unfolding by a Histone Chaperone. Nat Struct Mol Biol. 2016,  doi: 10.1038/nsmb.3321, in press.

Feofanov, A.V., Kudryashova, K.S., Chertkov, O.V., Nikitin, D.V., Pestov, N.A., Kulaeva, O.I., Studitsky, V.M. and Kirpichnikov, M.P. Analysis of nucleosome transcription using single-particle FRET. Springer Proceedings in Physics,  2015, Vol.164, pp. 255-260. ISBN:978-3-319-16918-7 Chapter DOI:10.1007/978-3-319-16919-4_33

Kudryashova, K.S., Chertkov, O.V., Nikitin, D.V., Pestov, N.A., Kulaeva, O.I., Efremenko, A.V., Solonin, A.S., Kirpichnikov, M.P., Studitsky, V.M. and Feofanov, A.V.  Preparation of Mononucleosomal Templates for Analysis of Transcription with RNA Polymerase Using spFRET. Methods Mol Biol. 2015, 1288, 395-412.

К.С. Кудряшова, Д.В. Никитин, О.В. Чертков, Н.С. Герасимова, М.Е. Валиева, В.М. Студитский, А.В. Феофанов. Разработка флуоресцентно-меченых мононуклеосом для изучения механизмов транскрипции методом микроскопии одиночных комплексов. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология. 2015. № 4, C. 41-45.

 

Работа выполнена совместно с сотрудниками Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (М.Е. Валиева, Г.А. Армеев, Н.С. Герасимова, А.К. Шайтан), Института биологии гена РАН (П.Г. Георгиев), University of Utah, USA (T. Formosa, L.L. McCullough), Fox Chase Cancer Center, USA  (V.M. Studitsky, O.I. Kulaeva)

Публикации

  1. Valieva ME, Armeev GA, Kudryashova KS, Gerasimova NS, Shaytan AK, Kulaeva OI, McCullough LL, Formosa T, Georgiev PG, Kirpichnikov MP, Studitsky VM, Feofanov AV (2016). Large-scale ATP-independent nucleosome unfolding by a histone chaperone. Nat Struct Mol Biol 23 (12), 1111–1116

Температурная активация рецептора TRPV1: моделирование на компьютере

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Ванилоидный рецептор типа 1 (TRPV1) — важнейший молекулярный сенсор нашего организма, реагирующий на повышение температуры, понижение pH (закисление), а также на капсаицин — вещество жгучего перца. Именно активации этого катионного канала мы обязаны ощущением «пожара» во рту от острой пищи, а также болевому ощущению при контакте с предметами горячее 43 °C. В этой работе 2016 года мы промоделировали температурную активацию рецептора TRPV1 с помощью молекулярной динамики (in silico эксперимент). Основываясь на определенных ранее структурах открытого и закрытого состояний TRPV1, мы создали компьютерную модель этого рецептора в липидной бислойной мембране, напоминающей нейрональную. В компьютерных экспериментах с повышением и понижением температуры мы идентифицировали серию событий «открывания» поры рецептора и чуть реже — «закрывания». Также мы предложили термодинамический механизм температурной активации белка, в котором важную роль играет экспонирование гидрофобных фрагментов в пору канала, в область контакта с растворителем. Еще одним интересным моментом стал механизм «асимметричного» открывания, который также следует из этих расчетов. Конечной целью работы можно считать создание в ближайшем будущем виртуального рецептора TRPV1, пригодного для предсказания структуры селективных лигандов. Ожидается, и не без основания, что такие лиганды найдут применение в медицине как анальгетические лекарства и будут лишены большинства побочных эффектов, свойственных современным препаратам группы нестероидных противовоспалительных средств. Подробнее о работе можно прочитать в пресс-релизе, опубликованном на сайте ИБХ.

Дизайн высокоаффинного аналога конотоксина PnIA на основе метода белковой топографии

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Некоторое время назад мы предложили компьютерный алгоритм белковой топографии, применение которого позволило объяснить селективное действие α-нейротоксинов из яда скорпионов на потенциал-чувствительные натриевые каналы насекомых и млекопитающих. В этой работе (2016 года) мы применили описанный принцип — белковую топографию — для дизайна мутантной формы конотоксина PnIA, которая обладает самым высоким на сегодняшний день сродством к ацетилхолиновому рецептору никотинового типа (α7-нАХР). Основой для этого дизайна стал массив экспериментально полученных данных по активности различных конотоксинов по отношению к α7-нАХР, наработанный в Отделе молекулярных основ нейросигнализации (вместе с которым мы представляем это достижение). В этом же отделе проведено исчерпывающее функциональное тестирование предложенных аналогов PnIA, что вместе с применением компьютерного моделирования стало предпосылкой для успешного дизайна новых пептидов. В перспективе, подобный подход позволит создавать нейропептиды с требуемыми свойствами, которые найдут применение в исследованиях рецепторов и в медицине.

Исследована пространственная структура и подвижность связки трансмембранного и цитоплазматического доменов рецептора нейротрофинов р75

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии

Рецептор нейротрофина р75 является важнейшим участником регуляции клеточного цикла нейронов, его дисфункция может приводить к нейродегенеративным заболеваниям. Для понимания молекулярных механизмов функционирования сигнальной системы р75 в 2015 году было проведено исследование структурной организации и внутримолекулярной подвижности связки трансмембранного и цитоплазматического доменов р75 (р75-ТМД-ЦПД) в различных мембраноподобных средах. Были разработаны протоколы продукции, ренатурации и очистки белка, после чего р75-ТМД-ЦПД был встроен в липид-белковые нанодиски различного размера и состава, структура белка была исследована методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Было показано, что глобулярный «домен смерти» р75 соединён с трансмембранным доменом гибким неупорядоченным линкерным участком, движения «домена смерти» и трансмембранного домена никак не взаимосвязаны. На основании полученных данных предложены различные варианты механизмов активации р75.

Определяющая роль мембраны в димеризации трансмембранных доменов белков: результаты молекулярного моделирования

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Димеризация трансмембранных (ТМ) альфа-спиралей — важнейший процесс, определяющий функционирование широкого класса мембранных белков, в частности, рецепторных тирозинкиназ. Молекулярные аспекты механизма ассоциации спиральных доменов в липидном окружении до сих пор остаются неясными. Так, до последнего времени роль мембраны в процессе димеризации рассматривалась лишь поверхностно. В Лаборатории моделирования биомолекулярных систем провели компьютерное исследование структурно-динамических параметров липидного бислоя вблизи мономеров и димеров гликофорина А человека, который является характерной моделью для изучения димеризации ТМ доменов, двух его мутантных форм и двух модельных пептидов. С помощью метода молекулярной динамики были оценены неоднородности в распределении средней плотности липидов. Показано, что даже одиночные спирали вызывают формирование стабильных во времени неоднородностей распределения липидов в гидрофобной области бислоя. При димеризации белка картина усложняется, т. к. ацильные цепи липидов заполняют все неровности поверхности формирующегося димера. Расчёты вкладов различных типов взаимодействий в свободную энергию ассоциации показали, что именно взаимодействие ТМ доменов с липидным окружением вносит наибольший вклад. Таким образом, димеризация ТМ спиралей имеет энтропийную природу и во многом определяется способностью белка связывать липиды на своей поверхности. Впервые получены аргументы в пользу гипотезы об определяющей роли мембраны в процессах олигомеризации ТМ спиралей белков.

Разработка интегрального транскриптомного и протеомного подхода для поиска блокаторов калиевых каналов в ядах животных

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул

Авторы: 

Кузьменков А.И., Василевский А.А., Гришин Е.В. Отдел молекулярной нейробиологии.

Кудряшова К.С., Некрасова О.В., Кирпичников М.П. Отдел биоинженерии.

Феофанов А.В. Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул. 

Аннотация: 

Разработан оригинальный подход для поиска новых лигандов калиевых каналов, объединяющий биоинженерную клеточную тест-систему и транскриптомный и протеомный анализ яда животных. С применением этого подхода из яда скорпиона Mesobuthus eupeus были получены восемь высокоаффинных пептидных блокаторов потенциал-зависимого калиевого канала Kv1.1, включая пять новых пептидов. Предложенный подход является универсальным и эффективным инструментом для направленного поиска блокаторов калиевых каналов в природных ядах.

Прочные, но гибкие: молекулярная динамика объясняет уникальность биомембран архей

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Археи в основном являются экстремофилами: их среда обитания — это высокие температура, давление, соленость и кислотность. Возможно, «особый путь» архей был определен необычными свойствами их мембран, существенно отличающихся по составу от «обычных» фосфолипидов у бактерий и эукариот. В Лаборатории моделирования биомолекулярных систем провели компьютерное исследование архейных мембран, объяснив взаимосвязь между химической структурой липидов и физическими свойствами мембран. В расчетах показано, что ключевой особенностью химического строения архейных липидов, определяющей исключительные физические свойства мембран на их основе, является изопреноидная природа гидрофобных фрагментов этих липидов (боковые метильные группы каждый четвертый углеродный атом «хвоста»). Подробнее об этом можно прочитать в пресс-релизе на сайте ИБХ.

Структурно-функциональное исследование трансмембранного домена рецептора VEGFR-2

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии

Рецеторная тирозинкиназа VEGFR-2 из семейства рецепторов васкулярных эндотелиальных ростовых факторов регулирует процессы ангиогенеза и является одной из ключевых мишеней для противоопухолевых препаратов. В рамках проекта было проведено структурно-функциональное исследования роли трансмембранного (ТМ) домена рецептора в процессах его активации. Были найдены мутации в ТМ домене, способные вызывать лиганд-независимую активацию VEGFR-2, а также VEGFR-2 с делегированным внеклеточным доменом. Были определены пространственные структуры димера ТМ домена VEGFR-2 дикого типа, тримера ТМ домена VEGFR-2 V769E, а также димера ТМ домена VEGFR-2 G770E/F778E. Для проведения детального сравнения полученных структур была разработана методика для измерения свободной энергии ассоциации ТМ спиралей в мицеллярных средах методами ЯМР спектроскопии высокого разрешения, что позволило для всех трех объектов измерить величины свободной энергии димеризации, и, где возможно, тримеризации. На основании данных мутагенеза, ЯМР-спектроскопии и полученных пространственных структур был предложен механизм активации VEGFR-2, подразумевающий существование неактивного димерного состояния рецептора.