Группа структурной биологии ионных каналов

Группа исследует мембранные рецепторы и ионные каналы, а также соединения, действующие на них (токсины, эндогенные лиганды). Для исследования структуры и механизмов действия на молекулярном уровне мы применяем современные методы структурной биологии: ЯМР-спектроскопию и криоэлектронную микроскопию. В настоящее время мы изучаем механизмы взаимодействия токсинов с потенциал-зависимыми K+ и Na+ каналами (Kv и Nav), а также исследуем структуры белковых лигандов никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR). Структурные исследования мембранных рецепторов и каналов необходимы для разработки новых средств диагностики и терапии заболеваний нервной, сердечно-сосудистой и мышечной систем организма. Кроме того, мы исследуем структуры и механизмы действия антибиотиков и защитных пептидов растений и животных. Эти исследования необходимы для создания новых препаратов для лечения инфекционных заболеваний.

Рис 1. Структура комплекса канала Nav1.4 из мышц человека с токсином Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei по данным ЯМР. (A) Комплекс Hm-3 (голубой/фиолетовый) с первым потенциал-чувствительным доменом (DI) канала (песчаный/красный). Вид сбоку, со стороны липидного бислоя. (В) Комплекс токсин-канал. Вид на плоскость мембраны со стороны внеклеточного пространства.

Нашей группой проведены ЯМР-исследования структуры и динамики потенциал-чувствительных доменов нескольких K+ и Na+ каналов, включая канал Nav1.4 из мышц человека. Дисфункции канала Nav1.4 вызывают расстройства опорно-двигательного аппарата, такие как паралич, миастенический синдром и миотония. Впервые охарактеризованы «необычные» флуктуации в структуре доменов, идущие с характерными временами в диапазоне мкс-мс, возможно, являющиеся прообразом структурных перестроек, происходящих при потенциал-зависимой активации. Показано, что домены Na+ каналов обладают большей конформационной пластичностью по сравнению с доменами K+ каналов. Это свойство, вероятно, обуславливает более быстрое срабатывание Nav каналов при изменении трансмембранного потенциала. Нами исследованы токсины VSTx1 и Hm-3 из яда пауков, которые, связываясь с участком мембраны, окружающий ионный канал, блокируют потенциал-зависимую активацию. На основании экспериментальных данных ЯМР-спектроскопии, совместно с лабораторией молекулярных инструментов для нейробиологии ИБХ РАН построена модель комплекса токсина Hm-3 с каналом Nav1.4 из мышц человека. Полученные структурные данные открывают возможность дальнейших фармакологических разработок.

В настоящее время, совместно с биологическим факультетом МГУ, используя методы электронной микроскопии, мы исследуем пространственную структуру полноразмерного канала Kv7.1 сердечной мышцы человека. Дисфункции этого канала приводят к развитию наследственной аритмии – синдрома удлиненного интервала QT.

Совместно с группой биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов ИБХ РАН, используя методы ЯМР-спектроскопии, нами определены структуры нескольких «трехпетельных» белков, действующих на ионный канал никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR). Определены пространственные структуры токсина WTX из яда кобры, регуляторных белков Lynx1 и Lypd6 из нервной системы человека и белков SLURP-1 и SLURP-2, продуцируемых клетками эпителия человека. Эти молекулы имеют перспективы для разработки новых лекарств, нацеленных на лечение нейродегенеративных заболеваний.

ris2_trehpetelnye.png

Рис 2. Пространственные структуры трехпетельных белков, действующих на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, по данным ЯМР. WTX токсин из яда кобры Naja kaouthia. Lynx1 и Lypd6 – регуляторные белки нервной системы человека.

Используя методы ЯМР-спектроскопии, наша группа совместно с Учебно-научным центром ИБХ РАН исследует структуру и механизм действия новых антибиотиков и защитных пептидов растений и животных. Большинство из изученных молекул демонстрируют повышенное сродство к мембранам бактериальных клеток и способны образовывать поры и ионные каналы, которые и приводят к гибели клетки-мишени. Нами были определены пространственные структуры и исследована динамика следующих молекул: двухкомпонентный лантибиотик лихеницидин, антибиотик антиамебин, антимикробный пептид ареницин из морского червя, антимикробный пептид аурелин из медузы, пептид дефенсин из чечевицы, липид-транспортирующий белок чечевицы в комплексе с липидами.

ris3_arenitsin_dimer.png

Рис 3. Пространственная структура и конформационная пластичность мономера антимикробного пептида ареницина в воде и димера пептида в мембраноподобном окружении. Справа показано образование ареницином тороидальных пор в мембране бактериальной клетки.

Также группа разрабатывает новые подходы для изучения мембранных биомолекул. Одним из перспективных направлений является использование наночастиц на основе липопротеинов высокой плотности (нанодисков). Нами впервые была показана возможность применения нанодисков в качестве среды для ЯМР-исследований мембранных белков и мембраноактивных пептидов, исследована возможность применения нанодисков в бесклеточных системах синтеза для получения функционально-активных форм мембранных белков, а также возможность применения нанодисков для фолдинга мембранных белков in vitro.

Ris4_nanodiskibeskletka.png

Рис 4. Добавление предварительно сформированных нанодисков в трансляционную смесь бесклеточной системы синтеза позволяет получать функционально-активные мембранные белки, доступные для исследования методами ЯМР-спектроскопии.

Нашей группой ведутся разработки новых подходов для установления химической структуры и изучения механизмов превращения в азот-богатых гетероциклических соединениях. Один из разработанных подходов основан на измерении и анализе «малых» (амплитуда от 1 до 0.01 Гц) констант спин-спинового взаимодействия 13С-15N и 1H-15N в соединениях, селективно меченных стабильным изотопом 15N. Применение этого подхода позволило изучить процессы азидо-тетразольной таутомерии в азидо-триазинах и азидо-пиримидинах.

ris5_himiya15N.png

Рис 5. Анализ «малых» констант спин-спинового взаимодействия 13С-15N в соединениях, меченных изотопом 15N, позволяет однозначно установить структуру тетразольной формы в азидо-триазинах и азидо-пиримидинах.

Группа ведет работы в сотрудничестве с подразделениями ИБХ РАН:

Группа сотрудничает с Российскими научными и образовательными организациями:

Международные партнеры:

Группа была организована в 2015 году в рамках программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (де факто группа существовала с 2008 года).

  1. Исследование структуры K+ и Na+ каналов человека и механизмов действия токсинов, влияющих на потенциал-зависимую активацию.
  2. Изучение взаимосвязи структура-функция в «трехпетельных» белках – лигандах никотинового ацетилхолинового рецептора.
  3. Исследование структуры и механизмов действия новых антибиотиков и защитных пептидов.
  4. Разработка новых мембраномоделирующих сред на основе липопротеинов высокой плотности (нанодиски) для продукции и структурно-функциональных исследований мембранных белков и пептидов.
  5. Разработка новых методов ЯМР для установления структуры и механизмов превращения азот-богатых гетероциклических соединений.
  • Исследована структура и динамика двух потенциал-чувствительных доменов канала Nav1.4 из мышц человека. Исследована структура и мембранная активность токсина Hm-3 из яда паука. На основании экспериментальных данных ЯМР-спектроскопии построена модель комплекса Nav1.4/Hm-3.
  • В потенциал-чувствительном домене канала KvAP археи охарактеризованы межспиральные движения в мкс-мс диапазоне, возможно, являющиеся прообразом структурных перестроек, происходящих при потенциал-зависимой активации.
  • Определены пространственные структуры и исследована внутримолекулярная динамика для ряда «трехпетельных» белков, действующих на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, включая токсин кобры WTX, регуляторные белки Lynx1 и Lypd6 из нервной системы человека и белки SLURP-1 и SLURP-2 из эпителия человека.
  • Определены пространственные структуры и предложен механизм действия для новых антибиотиков и защитных пептидов растений и животных, включая двухкомпонентный лантибиотик Лихеницидин; антибиотик антиамебин; антимикробные пептиды ареницин и аурелин, дефенсин и липид-транспортирующий белок чечевицы.
  • Разработан ряд новых подходов по применению нанодисков для продукции и структурно-функциональных исследований мембранных белков и пептидов.
  • Разработан новый метод ЯМР для установления химической структуры и изучения механизмов превращения в азот-богатых гетероциклических соединениях.

Избранные публикации

  1. Shenkarev Z.O., Karlova M.G., Kulbatskii D.S., Kirpichnikov M.P., Lyukmanova E.N., Sokolova O.S. (2018). Recombinant Production, Reconstruction in Lipid-Protein Nanodiscs, and Electron Microscopy of Full-Length α-Subunit of Human Potassium Channel Kv7.1. Biochemistry Mosc. 83 (5), 562–573 [+]

    Voltage-gated potassium channel Kv7.1 plays an important role in the excitability of cardiac muscle. The α-subunit of Kv7.1 (KCNQ1) is the main structural element of this channel. Tetramerization of KCNQ1 in the membrane results in formation of an ion channel, which comprises a pore and four voltage-sensing domains. Mutations in the human KCNQ1 gene are one of the major causes of inherited arrhythmias, long QT syndrome in particular. The construct encoding full-length human KCNQ1 protein was synthesized in this work, and an expression system in the Pichia pastoris yeast cells was developed. The membrane fraction of the yeast cells containing the recombinant protein (rKCNQ1) was solubilized with CHAPS detergent. To better mimic the lipid environment of the channel, lipid-protein nanodiscs were formed using solubilized membrane fraction and MSP2N2 protein. The rKCNQ1/nanodisc and rKCNQ1/CHAPS samples were purified using the Rho1D4 tag introduced at the C-terminus of the protein. Protein samples were examined using transmission electron microscopy with negative staining. In both cases, homogeneous rKCNQ1 samples were observed based on image analysis. Statistical analysis of the images of individual protein particles solubilized in the detergent revealed the presence of a tetrameric structure confirming intact subunit assembly. A three-dimensional channel structure reconstructed at 2.5-nm resolution represents a compact density with diameter of the membrane part of ~9 nm and height ~11 nm. Analysis of the images of rKCNQ1 in nanodiscs revealed additional electron density corresponding to the lipid bilayer fragment and the MSP2N2 protein. These results indicate that the nanodiscs facilitate protein isolation, purification, and stabilization in solution and can be used for further structural studies of human Kv7.1.

    ID:2085
  2. Männikkö R., Shenkarev Z.O., Thor M.G., Berkut A.A., Myshkin M.Y., Paramonov A.S., Kulbatskii D.S., Kuzmin D.A., SampedroCastañeda M., King L., Wilson E.R., Lyukmanova E.N., Kirpichnikov M.P., Schorge S., Bosmans F., Hanna M.G., Kullmann D.M., Vassilevski A.A. (2018). Spider toxin inhibits gating pore currents underlying periodic paralysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (17), 4495–4500 [+]

    Gating pore currents through the voltage-sensing domains (VSDs) of the skeletal muscle voltage-gated sodium channel Na1.4 underlie hypokalemic periodic paralysis (HypoPP) type 2. Gating modifier toxins target ion channels by modifying the function of the VSDs. We tested the hypothesis that these toxins could function as blockers of the pathogenic gating pore currents. We report that a crab spider toxin Hm-3 from can inhibit gating pore currents due to mutations affecting the second arginine residue in the S4 helix of VSD-I that we have found in patients with HypoPP and describe here. NMR studies show that Hm-3 partitions into micelles through a hydrophobic cluster formed by aromatic residues and reveal complex formation with VSD-I through electrostatic and hydrophobic interactions with the S3b helix and the S3-S4 extracellular loop. Our data identify VSD-I as a specific binding site for neurotoxins on sodium channels. Gating modifier toxins may constitute useful hits for the treatment of HypoPP.

    ID:2084
  3. Lyukmanova E.N., Bychkov M.L., Sharonov G.V., Efremenko A.V., Shulepko M.A., Kulbatskii D.S., Shenkarev Z.O., Feofanov A.V., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. (2018). Human secreted proteins SLURP-1 and SLURP-2 control the growth of epithelial cancer cells via interactions with nicotinic acetylcholine receptors. Br. J. Pharmacol. , [+]

    Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are a promising target for development of new anticancer therapies. Here we have investigated the effects of the endogenous human proteins SLURP-1 and SLURP-2, antagonists of nAChRs, on human epithelial cancer cells.

    ID:2087
  4. Sychev S.V., Sukhanov S.V., Panteleev P.V., Shenkarev Z.O., Ovchinnikova T.V. (2017). Marine antimicrobial peptide arenicin adopts a monomeric twisted β-hairpin structure and forms low conductivity pores in zwitterionic lipid bilayers. Biopolymers , [+]

    Arenicins are 21-residue β-hairpin antimicrobial peptides (AMPs) isolated from the marine lugworm Arenicola marina [Ovchinnikova et al., FEBS Lett. 2004;577:209-214]. The peptides have a high positive charge (+6) and display a broad spectrum of antimicrobial activities against bacteria and fungi. Arenicins adopt the monomeric highly twisted β-hairpin in water or planar β-structural dimers in anionic liposomes and detergent micelles. Until now, the interaction of cationic β-structural AMPs with zwitterionic phospholipid bilayers mimicking eukaryotic membranes is not well understood. To study the structural basis of arenicins activity against eukaryotic cells, we investigated arenicin-2 in the solvents of low polarity (ethanol, 4% dioxane) and in zwitterionic soybean PC and PC/PE liposomes by CD and FTIR spectroscopy. It was shown that arenicin-2 adopted the twisted β-hairpin structure in all the environments studied. Measurements of the Trp fluorescence and H→D exchange in soybean PC liposomes and boundary potential in the planar DPhPC bilayers confirmed the partitioning of the arenicin-2 monomers into interfacial region of the zwitterionic membranes. The low-conductivity (0.12 nS) arenicin-2 pores were detected in the DPhPC bilayers. The lifetime of the open state (up to 260 ms) was significantly longer than lifetime of low-conductivity (0.23 nS) pores previously described in partially anionic membranes (44 ms). The formation of narrow arenicin-2 pores without disruption of the membrane was discussed in the light of the disordered toroidal pore model previously proposed for β-structural AMPs [Jean - Francois et al. Biophys. J. 2008;95:5748 - 5756]. A novel non-lytic mechanism of the arenicin-2 action was proposed.

    ID:2088
  5. Vasilyeva N.A., Loktyushov E.V., Bychkov M.L., Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N. (2017). Three-Finger Proteins from the Ly6/uPAR Family: Functional Diversity within One Structural Motif. Biochemistry Mosc. 82 (13), 1702–1715 [+]

    The discovery in higher animals of proteins from the Ly6/uPAR family, which have structural homology with snake "three-finger" neurotoxins, has generated great interest in these molecules and their role in the functioning of the organism. These proteins have been found in the nervous, immune, endocrine, and reproductive systems of mammals. There are two types of the Ly6/uPAR proteins: those associated with the cell membrane by GPI-anchor and secreted ones. For some of them (Lynx1, SLURP-1, SLURP-2, Lypd6), as well as for snake α-neurotoxins, the target of action is nicotinic acetylcholine receptors, which are widely represented in the central and peripheral nervous systems, and in many other tissues, including epithelial cells and the immune system. However, the targets of most proteins from the Ly6/uPAR family and the mechanism of their action remain unknown. This review presents data on the structural and functional properties of the Ly6/uPAR proteins, which reveal a variety of functions within a single structural motif.

    ID:2086
  6. Shenkarev Z.O., Melnikova D.N., Finkina E.I., Sukhanov S.V., Boldyrev I.A., Gizatullina A.K., Mineev K.S., Arseniev A.S., Ovchinnikova T.V. (2017). Ligand Binding Properties of the Lentil Lipid Transfer Protein: Molecular Insight into the Possible Mechanism of Lipid Uptake. Biochemistry 56 (12), 1785–1796 [+]

    The lentil lipid transfer protein, designated as Lc-LTP2, was isolated from Lens culinaris seeds. The protein belongs to the LTP1 subfamily and consists of 93 amino acid residues. Its spatial structure includes four α-helices (H1-H4) and a long C-terminal tail. Here, we report the ligand binding properties of Lc-LTP2. The fluorescent 2-p-toluidinonaphthalene-6-sulfonate binding assay revealed that the affinity of Lc-LTP2 for saturated and unsaturated fatty acids was enhanced with a decrease in acyl-chain length. Measurements of boundary potential in planar lipid bilayers and calcein dye leakage in vesicular systems revealed preferential interaction of Lc-LTP2 with the negatively charged membranes. Lc-LTP2 more efficiently transferred anionic dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) than zwitterionic dimyristoylphosphatidylcholine. Nuclear magnetic resonance experiments confirmed the higher affinity of Lc-LTP2 for anionic lipids and those with smaller volumes of hydrophobic chains. The acyl chains of the bound lysopalmitoylphosphatidylglycerol (LPPG), DMPG, or dihexanoylphosphatidylcholine molecules occupied the internal hydrophobic cavity, while their headgroups protruded into the aqueous environment between helices H1 and H3. The spatial structure and backbone dynamics of the Lc-LTP2-LPPG complex were determined. The internal cavity was expanded from ∼600 to ∼1000 Å(3) upon the ligand binding. Another entrance into the internal cavity, restricted by the H2-H3 interhelical loop and C-terminal tail, appeared to be responsible for the attachment of Lc-LTP2 to the membrane or micelle surface and probably played an important role in the lipid uptake determining the ligand specificity. Our results confirmed the previous assumption regarding the membrane-mediated antimicrobial action of Lc-LTP2 and afforded molecular insight into its biological role in the plant.

    ID:1779
  7. Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Myshkin M.Y., Shulepko M.A., Kulbatskii D.S., Petrosian N.S., Chugunov A.O., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S., Shenkarev Z.O. (2017). NMR investigation of the isolated second voltage-sensing domain of human Nav1.4 channel. Biochim. Biophys. Acta 1859 (3), 493–506 [+]

    Voltage-gated Na(+) channels are essential for the functioning of cardiovascular, muscular, and nervous systems. The α-subunit of eukaryotic Na(+) channel consists of ~2000 amino acid residues and encloses 24 transmembrane (TM) helices, which form five membrane domains: four voltage-sensing (VSD) and one pore domain. The structural complexity significantly impedes recombinant production and structural studies of full-sized Na(+) channels. Modular organization of voltage-gated channels gives an idea for studying of the isolated second VSD of human skeletal muscle Nav1.4 channel (VSD-II). Several variants of VSD-II (~150a.a., four TM helices) with different N- and C-termini were produced by cell-free expression. Screening of membrane mimetics revealed low stability of VSD-II samples in media containing phospholipids (bicelles, nanodiscs) associated with the aggregation of electrically neutral domain molecules. The almost complete resonance assignment of (13)C,(15)N-labeled VSD-II was obtained in LPPG micelles. The secondary structure of VSD-II showed similarity with the structures of bacterial Na(+) channels. The fragment of S4 TM helix between the first and second conserved Arg residues probably adopts 310-helical conformation. Water accessibility of S3 helix, observed by the Mn(2+) titration, pointed to the formation of water-filled crevices in the micelle embedded VSD-II. (15)N relaxation data revealed characteristic pattern of μs-ms time scale motions in the VSD-II regions sharing expected interhelical contacts. VSD-II demonstrated enhanced mobility at ps-ns time scale as compared to isolated VSDs of K(+) channels. These results validate structural studies of isolated VSDs of Na(+) channels and show possible pitfalls in application of this 'divide and conquer' approach.

    ID:1921
  8. Panteleev P.V., Myshkin M.Y., Shenkarev Z.O., Ovchinnikova T.V. (2017). Dimerization of the antimicrobial peptide arenicin plays a key role in the cytotoxicity but not in the antibacterial activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 482 (4), 1320–1326 [+]

    The β-hairpin antimicrobial peptides arenicins from marine polychaeta Arenicola marina exhibit a broad spectrum of antimicrobial activity and high cytotoxicity. In this study the biological activities of arenicin-1 and its therapeutically valuable analog Ar-1[V8R] were investigated. The peptide Ar-1[V8R] displays significantly reduced cytotoxicity against mammalian cells relative to the wild-type arenicin-1. At the same time, both peptides exhibit similar antibacterial activities and kinetics of bacterial membrane permeabilization. Comparative NMR analysis of the peptides spatial structures in water and membrane-mimicking environment showed that Ar-1[V8R] in contrast to arenicin has significantly lower dimerization propensity. Thus, dimerization of the antimicrobial peptide arenicin plays a key role in the cytotoxicity but not in the antibacterial activity.

    ID:1792
  9. Парамонов А.С., Кульбацкий Д.С., Локтюшов Е.В., Царев А.В., Долгих Д.А., Шенкарёв З.О., Кирпичников М.П., Люкманова Е.Н. (2017). Рекомбинантная продукция и исследование структуры белков человека Lypd6 и Lypd6b. Биоорг. хим. 43 (6), 620–630 [+]

    Белки человека Lypd6 и Lypd6b экспрессируются во многих тканях и имеют высокую степень гомо-
    логии аминокислотной последовательности (~ 54%). Оба белка в отличие от других белков семейства
    Ly6/uPAR имеют дополнительные протяженные N- и С-концевые аминокислотные последователь-
    ности, примыкающие к трехпетельному LU-домену, роль которых на данный момент не изучена. Из-
    вестно, что Lypd6 увеличивает амплитуду токов кальция, индуцированных никотином в нейронах
    тройничного нерва мыши. Lypd6 рыбки Danio rerio участвует в регуляции Wnt/β-катенин сигнального
    каскада, и блокирование экспрессии гена lypd6 приводит к нарушению эмбрионального развития.
    Экспрессия Lypd6b в ооцитах X. laevis повышает чувствительность никотиновых ацетилхолиновых ре-
    цепторов к ацетилхолину и увеличивает скорость их десенситизации. Молекулярные механизмы дей-
    ствия, равно как и пространственная структура Lypd6 и Lypd6b, до сих пор не изучены. В представ-
    ленной работе получены и экспрессированы гены водорастворимых аналогов трехпетельных белков
    человека Lypd6 и Lypd6b, не содержащих N-концевые последовательности (rLypd6 и rLypd6b), а также
    Lypd6 с N-концевой последовательностью – N-rLypd6. Белки получали в виде цитоплазматических
    телец включения в E. coli с последующей солюбилизацией в денатурирующих условиях и ренатураци-
    ей. С целью оптимизации выхода рекомбинантных белков был проведен поиск условий ренатурации.
    Анализ полученных препаратов N-rLypd6, rLypd6 и rLypd6b методами ЯМР-спектроскопии показал,
    что N-rLypd6, возможно, не структурирован. Получение миллиграммовых количеств изотопно-ме-
    ченных вариантов rLypd6 и rLypd6b позволило охарактеризовать вторичную структуру этих белков
    и исследовать внутримолекулярную подвижность. Установлено, что rLypd6 и rLypd6b обладают струк-
    турными элементами, характерными для трехпетельных белков семейства Ly6/uPAR с некоторыми
    уникальными особенностями, такими как наличие дополнительной дисульфидной связи в третьей
    петле и спиральных участков в первой и третьей петлях.

    ID:1924
  10. Мышкин М.Ю., Парамонов А.С., Кульбацкий Д.С., Люкманова Е.Н., Кирпичников М.П., Шенкарёв З.О. (2017). ПОДХОД “РАЗДЕЛЯЙ И ВЛАСТВУЙ” ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ МУЛЬТИДОМЕННЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ НА ПРИМЕРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПОТЕНЦИАЛ-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ КАНАЛОВ Kv2.1 И Nav1.4 ЧЕЛОВЕКА1. Биоорг. хим. 43 (6), 608–619 [+]

    Потенциал-зависимые K+- и Na+-ионные каналы вовлечены в широкий спектр физиологических
    процессов, включая возбудимость сердечных, мышечных и нервных клеток, а также секрецию гор-
    монов и нейромедиаторов. Эти каналы имеют модульную структуру и состоят из пяти мембранных
    доменов: четырех потенциал-чувствительных доменов (ПЧД) и одного порового домена. На ПЧД раз-
    личных каналов локализованы уникальные сайты связывания с лигандами, поэтому ПЧД рассматри-
    ваются в качестве перспективных фармакологических мишеней. Модульная организация ионных ка-
    налов позволяет ставить задачи по структурным ЯМР-исследованиям изолированных ПЧД отдельно
    от поры. В настоящей работе рассмотрена возможность таких исследований на примере ПЧД канала
    Kv2.1 человека и первого ПЧД канала Nav1.4 человека. Разработаны сопряженные системы бескле-
    точного синтеза на основе бактериального экстракта S30 из E. coli, позволяющие получать милли-
    граммовые количества препаратов ПЧД, включая меченые стабильными изотопами аналоги. Важным
    этапом ЯМР-исследований является подбор мембраномоделирующей среды, обеспечивающей дол-
    говременную стабильность природной структуры мембранного белка в растворе и высокое качество
    ЯМР-спектров. Скрининг различных сред показал, что домены каналов Kv2.1 и Nav1.4 нестабильны
    в средах, содержащих фосфолипиды: мицеллах короткоцепочечного липида DC7PC и липид-детер-
    гентных бицеллах на основе цвиттер-ионных или анионных насыщенных липидов (DMPC и DMPG).
    Показано, что оптимальной средой для структурных ЯМР-исследований являются смеси цвиттер-
    ионного и слабокатионного детергентов (FOS-12/LDAO). Однако, несмотря на высокое качество
    спектров, образец ПЧД канала Nav1.4 в окружении FOS-12/LDAO необратимо агрегировал в течение
    нескольких дней. Вероятно, ПЧД K+- и Na+-каналов человека не являются полностью автономными
    мембранными доменами и для их стабилизации необходимы контакты с другими доменами канала.

    ID:1925
  11. Deev S.L., Paramonov A.S., Shestakova T.S., Khalymbadzha I.A., Chupakhin O.N., Subbotina J.O., Eltsov O.S., Slepukhin P.A., Rusinov V.L., Arseniev A.S., Shenkarev Z.O. (2017). N-Labelling and structure determination of adamantylated azolo-azines in solution. Beilstein J Org Chem 13, 2535–2548 [+]

    Determining the accurate chemical structures of synthesized compounds is essential for biomedical studies and computer-assisted drug design. The unequivocal determination of N-adamantylation or N-arylation site(s) in nitrogen-rich heterocycles, characterized by a low density of hydrogen atoms, using NMR methods at natural isotopic abundance is difficult. In these compounds, the heterocyclic moiety is covalently attached to the carbon atom of the substituent group that has no bound hydrogen atoms, and the connection between the two moieties of the compound cannot always be established via conventional H-H and H-C NMR correlation experiments (COSY and HMBC, respectively) or nuclear Overhauser effect spectroscopy (NOESY or ROESY). The selective incorporation of N-labelled atoms in different positions of the heterocyclic core allowed for the use of H-N () and C-N () coupling constants for the structure determinations of N-alkylated nitrogen-containing heterocycles in solution. This method was tested on the N-adamantylated products in a series of azolo-1,2,4-triazines and 1,2,4-triazolo[1,5-]pyrimidine. The syntheses of adamantylated azolo-azines were based on the interactions of azolo-azines and 1-adamatanol in TFA solution. For azolo-1,2,4-triazinones, the formation of mixtures of -adamantyl derivatives was observed. The and values were measured using amplitude-modulated 1D H spin-echo experiments with the selective inversion of the N nuclei and line-shape analysis in the 1D С spectra acquired with selective N decoupling, respectively. Additional spin-spin interactions were detected in the N-HMBC spectra. NMR data and DFT (density functional theory) calculations permitted to suggest a possible mechanism of isomerization for the adamantylated products of the azolo-1,2,4-triazines. The combined analysis of the and couplings in N-labelled compounds provides an efficient method for the structure determination of N-alkylated azolo-azines even in the case of isomer formation. The isomerization of adamantylated tetrazolo[1,5-][1,2,4]triazin-7-ones in acidic conditions occurs through the formation of the adamantyl cation.

    ID:2089
  12. Shulepko M.A., Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Dubovskii P.V., Astapova M.V., Feofanov A.V., Arseniev A.S., Utkin Y.N., Kirpichnikov M.P., Dolgikh D.A. (2016). Towards universal approach for bacterial production of three-finger Ly6/uPAR proteins: Case study of cytotoxin I from cobra N. oxiana. Protein Expr. Purif. 130, 13–20 [+]

    Cytotoxins or cardiotoxins is a group of polycationic toxins from cobra venom belonging to the 'three-finger' protein superfamily (Ly6/uPAR family) which includes small β-structural proteins (60-90 residues) with high disulfide bond content (4-5 disulfides). Due to a high cytotoxic activity for cancer cells, cytotoxins are considered as potential anticancer agents. Development of the high-throughput production methods is required for the prospective applications of cytotoxins. Here, efficient approach for bacterial production of recombinant analogue of cytotoxin I from N. oxiana containing additional N-terminal Met-residue (rCTX1) was developed. rCTX1 was produced in the form of E. coli inclusion bodies. Refolding in optimized conditions provided ∼6 mg of correctly folded protein from 1 L of bacterial culture. Cytotoxicity of rCTX1 for C6 rat glioma cells was found to be similar to the activity of wild type CTX1. The milligram quantities of (13)C,(15)N-labeled rCTX1 were obtained. NMR study confirmed the similarity of the spatial structures of recombinant and wild-type toxins. Additional Met residue does not perturb the overall structure of the three-finger core. The analysis of available data for different Ly6/uPAR proteins of snake and human origin revealed that efficiency of their folding in vitro is correlated with the number of proline residues in the third loop and the surface area of hydrophobic residues buried within the protein interior. The obtained data indicate that hydrophobic core is important for the folding of proteins with high disulfide bond content. Developed expression method opens new possibilities for structure-function studies of CTX1 and other related three-finger proteins.

    ID:1599
  13. Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Shenkarev Z.O., Kasheverov I.E., Chugunov A.O., Kulbatskii D.S., Myshkin M.Y., Utkin Y.N., Efremov R.G., Tsetlin V.I., Arseniev A.S., Kirpichnikov M.P., Dolgikh D.A. (2016). Central loop of non-conventional toxin WTX from Naja kaouthia is important for interaction with nicotinic acetylcholine receptors. Toxicon 119, 274–9 [+]

    'Three-finger' toxin WTX from Naja kaouthia interacts with nicotinic and muscarinic acetylcholine receptors (nAChRs and mAChRs). Mutagenesis and competition experiments with (125)I-α-bungarotoxin revealed that Arg31 and Arg32 residues from the WTX loop II are important for binding to Torpedo californica and human α7 nAChRs. Computer modeling suggested that loop II occupies the orthosteric binding site at α7 nAChR. The similar toxin interface was previously described as a major determinant of allosteric interactions with mAChRs.

    ID:1598
  14. Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Shenkarev Z.O., Bychkov M.L., Paramonov A.S., Chugunov A.O., Kulbatskii D.S., Arvaniti M., Dolejsi E., Schaer T., Arseniev A.S., Efremov R.G., Thomsen M.S., Dolezal V., Bertrand D., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. (2016). Secreted Isoform of Human Lynx1 (SLURP-2): Spatial Structure and Pharmacology of Interactions with Different Types of Acetylcholine Receptors. Sci Rep 6, 30698 [+]

    Human-secreted Ly-6/uPAR-related protein-2 (SLURP-2) regulates the growth and differentiation of epithelial cells. Previously, the auto/paracrine activity of SLURP-2 was considered to be mediated via its interaction with the α3β2 subtype of the nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs). Here, we describe the structure and pharmacology of a recombinant analogue of SLURP-2. Nuclear magnetic resonance spectroscopy revealed a 'three-finger' fold of SLURP-2 with a conserved β-structural core and three protruding loops. Affinity purification using cortical extracts revealed that SLURP-2 could interact with the α3, α4, α5, α7, β2, and β4 nAChR subunits, revealing its broader pharmacological profile. SLURP-2 inhibits acetylcholine-evoked currents at α4β2 and α3β2-nAChRs (IC50 ~0.17 and >3 μM, respectively) expressed in Xenopus oocytes. In contrast, at α7-nAChRs, SLURP-2 significantly enhances acetylcholine-evoked currents at concentrations <1 μM but induces inhibition at higher concentrations. SLURP-2 allosterically interacts with human M1 and M3 muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) that are overexpressed in CHO cells. SLURP-2 was found to promote the proliferation of human oral keratinocytes via interactions with α3β2-nAChRs, while it inhibited cell growth via α7-nAChRs. SLURP-2/mAChRs interactions are also probably involved in the control of keratinocyte growth. Computer modeling revealed possible SLURP-2 binding to the 'classical' orthosteric agonist/antagonist binding sites at α7 and α3β2-nAChRs.

    ID:1597

Шенкарёв Захар Олегович

Вторичная структура и динамика потенциалочувствительного домена второй псевдосубъединицы канала Nav1.4 скелетных мышц человека (2017-11-28)

Потенциалозависимые Na+ каналы играют важнейшую роль в функционировании сердечно-сосудистой, мышечной и нервной систем. α-субъединица Na+ канала состоит из ~2000 аминокислотных остатков, что значительно затрудняет структурные исследования полноразмерных каналов. Методом ЯМР-спектроскопии мембраномоделирующем окружении, был исследован изолированный потенциалочувствительный домен (VSD-II) канала Nav1.4 скелетных мышц человека. Вторичная структура VSD-II схожа со структурой бактериальных Na+ каналов. Часть спирали S4 между первым и вторым консервативными остатками Arg, вероятно, имеет конформацию 3/10-спирали. Данные о релаксации ядер 15N выявили характерную подвижность в мкс-мс временном диапазоне для участков VSD-II, участвующих в предполагаемых межспиральных контактах. VSD-II демонстрирует повышенную подвижность в пс-нс временном диапазоне по сравнению с изолированными VSD K+ каналов.

Публикации

  1. Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Myshkin M.Y., Shulepko M.A., Kulbatskii D.S., Petrosian N.S., Chugunov A.O., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S., Shenkarev Z.O. (2017). NMR investigation of the isolated second voltage-sensing domain of human Nav1.4 channel. Biochim. Biophys. Acta 1859 (3), 493–506 [+]

    Voltage-gated Na(+) channels are essential for the functioning of cardiovascular, muscular, and nervous systems. The α-subunit of eukaryotic Na(+) channel consists of ~2000 amino acid residues and encloses 24 transmembrane (TM) helices, which form five membrane domains: four voltage-sensing (VSD) and one pore domain. The structural complexity significantly impedes recombinant production and structural studies of full-sized Na(+) channels. Modular organization of voltage-gated channels gives an idea for studying of the isolated second VSD of human skeletal muscle Nav1.4 channel (VSD-II). Several variants of VSD-II (~150a.a., four TM helices) with different N- and C-termini were produced by cell-free expression. Screening of membrane mimetics revealed low stability of VSD-II samples in media containing phospholipids (bicelles, nanodiscs) associated with the aggregation of electrically neutral domain molecules. The almost complete resonance assignment of (13)C,(15)N-labeled VSD-II was obtained in LPPG micelles. The secondary structure of VSD-II showed similarity with the structures of bacterial Na(+) channels. The fragment of S4 TM helix between the first and second conserved Arg residues probably adopts 310-helical conformation. Water accessibility of S3 helix, observed by the Mn(2+) titration, pointed to the formation of water-filled crevices in the micelle embedded VSD-II. (15)N relaxation data revealed characteristic pattern of μs-ms time scale motions in the VSD-II regions sharing expected interhelical contacts. VSD-II demonstrated enhanced mobility at ps-ns time scale as compared to isolated VSDs of K(+) channels. These results validate structural studies of isolated VSDs of Na(+) channels and show possible pitfalls in application of this 'divide and conquer' approach.

    ID:1921
  2. Мышкин М.Ю., Парамонов А.С., Кульбацкий Д.С., Люкманова Е.Н., Кирпичников М.П., Шенкарёв З.О. (2017). ПОДХОД “РАЗДЕЛЯЙ И ВЛАСТВУЙ” ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ МУЛЬТИДОМЕННЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ НА ПРИМЕРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПОТЕНЦИАЛ-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ КАНАЛОВ Kv2.1 И Nav1.4 ЧЕЛОВЕКА1. Биоорг. хим. 43 (6), 608–619 [+]

    Потенциал-зависимые K+- и Na+-ионные каналы вовлечены в широкий спектр физиологических
    процессов, включая возбудимость сердечных, мышечных и нервных клеток, а также секрецию гор-
    монов и нейромедиаторов. Эти каналы имеют модульную структуру и состоят из пяти мембранных
    доменов: четырех потенциал-чувствительных доменов (ПЧД) и одного порового домена. На ПЧД раз-
    личных каналов локализованы уникальные сайты связывания с лигандами, поэтому ПЧД рассматри-
    ваются в качестве перспективных фармакологических мишеней. Модульная организация ионных ка-
    налов позволяет ставить задачи по структурным ЯМР-исследованиям изолированных ПЧД отдельно
    от поры. В настоящей работе рассмотрена возможность таких исследований на примере ПЧД канала
    Kv2.1 человека и первого ПЧД канала Nav1.4 человека. Разработаны сопряженные системы бескле-
    точного синтеза на основе бактериального экстракта S30 из E. coli, позволяющие получать милли-
    граммовые количества препаратов ПЧД, включая меченые стабильными изотопами аналоги. Важным
    этапом ЯМР-исследований является подбор мембраномоделирующей среды, обеспечивающей дол-
    говременную стабильность природной структуры мембранного белка в растворе и высокое качество
    ЯМР-спектров. Скрининг различных сред показал, что домены каналов Kv2.1 и Nav1.4 нестабильны
    в средах, содержащих фосфолипиды: мицеллах короткоцепочечного липида DC7PC и липид-детер-
    гентных бицеллах на основе цвиттер-ионных или анионных насыщенных липидов (DMPC и DMPG).
    Показано, что оптимальной средой для структурных ЯМР-исследований являются смеси цвиттер-
    ионного и слабокатионного детергентов (FOS-12/LDAO). Однако, несмотря на высокое качество
    спектров, образец ПЧД канала Nav1.4 в окружении FOS-12/LDAO необратимо агрегировал в течение
    нескольких дней. Вероятно, ПЧД K+- и Na+-каналов человека не являются полностью автономными
    мембранными доменами и для их стабилизации необходимы контакты с другими доменами канала.

    ID:1925

отчёт 2016

В мембраномоделирующих средах на основе мицелл детергентов методами ЯМР-спектроскопии проведено исследование потенциалочувствительного домена (ПЧД) канала Kv2.1 человека. Разработана новая методика отнесения сигналов ЯМР основной цепи белка, основанная на методе комбинаторного введения изотопов в бесклеточной системе синтеза (система сопряженной транскрипции-трансляции in vitro). Разработан новый программный комплекс позволяющий рассчитывать оптимальную схему введения изотопов. С использованием нового метода охарактеризована вторичная структура и внутримолекулярная динамика ПЧД-Kv2.1. Разработан протокол ренатурации рекомбинантного аналога токсина паука, действующего на ПЧД-Kv2.1. Разработанные протоколы делают возможными структурные исследования лиганд-рецепторных взаимодействий токсин-домен. Кроме того за отчетный период проведены структурные исследования ряда токсинов, защитных пептидов и токсин-подобных белков человека, действующих на ионные каналы и мембраны клеток.