Лаборатория иммунохимии

Отдел биоматериалов и бионанотехнологий

Руководитель: Бровко Федор Александрович, д. б. н.
brovko@bibch.ru,  +7(4967)73-08-53#3157

В Лаборатории изучаются процессы активации и регуляции естественного иммунитета, исследуется роль экзотоксинов стафилококков при заболеваниях, вызываемых стафилококками, разрабатываются мультипараметрические диагностические системы обнаружения патогенов на основе иммунохимических методов с использованием моноклональных и рекомбинантных антител.

Патогенные микроорганизмы и их бактериальные токсины

Один из наиболее распространенных патогенов человека и животных – микроорганизм Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк). Стафилококки быстро эволюционируют, приспосабливаясь к изменениям окружающей среды. У человека и животных обнаружены штаммы, резистентные к широкому спектру антибиотиков. Стафилококки способны продуцировать набор белковых и пептидных токсинов, часть которых стабильна при термической обработке, устойчивы к действию протеолитических ферментов  и при экстремальных значениях рН. Прежде всего, эти токсины вызывают отравления у человека, а их многократное воздействие является причиной ряда серьезных осложнений и приводит к развитию аутоиммунных заболеваний и аллергий. Иммунохимические методы анализа используются при обнаружении токсинов в секретах человека, пищевых продуктах и окружающей среде. В Лаборатории получены представительные панели моноклональных антител мыши к токсинам, продуцируемым Staphylococcus aureus. На основе этих антител созданы системы обнаружения токсинов, как с использованием инструментальных методов, так и без приборов в полевых условиях.

Помимо стафилококков интерес вызывают токсины, продуцируемые микроорганизмами Clostridium botulinum (возбудитель ботулизма) и Bacillus anthrax (возбудитель сибирской язвы). Получены моноклональные антитела к наиболее опасным бактериальным токсинам ботулиническим и сибирской язвы, с помощью которых разработаны селективные и чувствительные методы детекции на основе «сэндвич»-метода.

Исследования стафилококк-ассоциированного мастита

Мастит является наиболее важной причиной потерь при производстве молока даже в благополучных странах, как Голландия или Швейцария. В РФ около 30% причин заболевания маститом связаны со стафилококками. Токсины стафилококков могут присутствовать в молоке и получаемых из него продуктов. В Лаборатории исследуется токсигенность стафилококков при маститах в РФ и продукция токсинов токсикогенными штаммами, выделенными из больных маститом животных, изучается иммунный ответ животных на токсины стафилококков.

Роль ГМДП – RN пептида в реакциях естественного иммунитета

Исследование активации естественного иммунитета и роли в этом процессе фрагмента клеточной стенки бактерий глюкозаминилмурамоилдипептида (ГМДП) занимает важное место в проводимых в Лаборатории исследованиях. Используя антитела к ГМДП, полученные в Лаборатории иммунохимии ИБХ, а также технологию пептидного фагового дисплея, сотрудники открыли 15-мерный пептид – миметик ГМДП, названный по концевым аминокислотным остаткам RN пептидом. Исследование роли аминокислот в узнавании антителами пептида и способности влиять на иммунную систему показали следующие эффекты: на уровне организма – адъювантный в дозах 1-3 нг и 1-1,5 мкг; на уровне клеток – увеличение экспрессии NFκB2, регуляция экспрессии NFκB2 в зависимости от концентрации YB-1 в культуральной среде; на молекулярном уровне – связывание с YB-1 с Kd=4∙10-9, конкуренция с ГМДП за сайт связывания YB-1. На основании полученных в результате исследования данных предложена модель активации естественного иммунитета ГМДП – RN пептидом, с участием NOD2 и белка холодового шока Yb-1.

Получение рекомбинантных антител животных и человека

Проводится работа по получению рекомбинантных антител, в основном в формате одноцепочных миниантител, разрабатываются способы стабилизации – рефолдинга и направленной эволюции миниантител. В Лаборатории получены представительная библиотека миниантител человека в формате фагового дисплея, разработан способ аффинного обогащения антител на родственных антигенах. Получены и охарактеризованы миниантитела к энтеротоксинам стафилококков. Исследована роль формата антител на  сп ецифичность в ряду энтеротоксинов.

Анализ токсичности энтеротоксинов и токсин-нейтрализующего потенциала антител

В Лаборатории совместно с лабораторией биологических испытаний на животных моделях разрабатываются методы оценки токсичности токсинов стафилококков и оценки токсин-нейтрализующего потенциала антител к энтеротоксинам. В качестве модельных животных используются линейные мыши, выращенные в НПП «Питомник лабораторных животных» Филиала ИБХ.  Используемые подходы описаны в этой работе.

По исследованиям патогенных микроорганизмов и их бактериальных токсинов Лаборатория сотрудничает с Институтом молекулярной биологии РАН (Москва), Институтом общей физики им. А.М. Прохорова РАН (Москва), Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино), Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ (Москва), Институтом прикладной микробиологии Роспотребнадзора РФ (Оболенск). Исследования стафилококк-ассоциированного мастита проводятся совместно со Всероссийским институтом животноводства им. Л.К. Эрнста (Дубровицы, Московская область). Работа по изучению RN пептида ведется с лабораторией химии пептидов ИБХ РАН и лабораторией регуляцией биосинтеза белка Института белка РАН. Рекомбинантные антитела животных и человека получают совместно с НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Институтом прикладной микробиологии Роспотребнадзора РФ и лабораторией физики белка Института белка РАН.

Все публикации (показать избранные)

Загружаются...

Бровко Федор Александрович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. ФИБХ, комн. Переход/437
  • Тел.: +7(4967)73-08-53#3157
  • Эл. почта: brovko@bibch.ru

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОДНОВРЕМЕННОГО АНАЛИЗА ТРЕХ СТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНТЕРОТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МИКРОСФЕР И ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ

Одной из причин болезней, ассоциированных с пищевыми отравлениями, является заражение токсигенными стафилококками. Высокая стабильность энтеротоксинов стафилококков (SE) обуславливает необходимость усовершенствования методов контроля качества пищевых продуктов. Разработан высокочувствительный метод для одновременного количественного анализа трех стафилококковых энтеротоксинов (SEA, SEB и SEH) методом проточной цитофлуориметрии. Для обнаружения SE использовали функциональные микросферы, связанные с моноклональными антителами захвата, биотинилированные детектирующие моноклональные антитела и конъюгированный с фикоэритрином стрептавидин. Линейные диапазоны обнаружения SEA, SEB и SEH составляли 0,02–20 нг/мл, 0,2–30 нг/мл и 0,2–20 нг/мл соответственно. Каждый из токсинов детектировался специфично без перекрестных реакций, компоненты среды детекции не влияли на специфичность и чувствительность определения.

Публикации

  1. Shepelyakovskaya A, Rudenko N, Karatovskaya A, Shchannikova M, Shulcheva I, Fursova K, Zamyatina A, Boziev K, Oleinikov V, Brovko F (2020). Development of a Bead-Based Multiplex Assay for the Simultaneous Quantification of Three Staphylococcal Enterotoxins in Food by Flow Cytometry. FOOD ANAL METHOD 13 (5), 1202–1210

Геномное исследование S. aureus, ассоциированного с маститом коров.

С помощью метода WGS проведён анализ токсикогенного потенциала S. aureus, ассоциированного с маститом КРС (коров). Проведено полногеномное секвенирование 50 штаммов из различных регионов РФ. Для исследованных образцов составлена карта генома, проведена аннотация с использованием различных ресурсов биоинформатики, геномы зарегистированы в базе данных GenBank.

Исследованные штаммы обладают широким арсеналом факторов вирулентности. Все изоляты несли гены гемолизинов; гены лейкоцидинов встречались в 80%. Также у всех изолятов идентифицированы гены адгезинов и гены, ответственные за формирование биоплёнок. Гены энтеротоксинов идентифицированы у 38% изолятов и представлены  генным кластером egc (seg и sei). Также  у всех изолятов идентифицированы гены эксфолиативных токсинов, хотя их функция при мастите пока не ясна. Частично исследована проблема антибиотикоустойчивости, большинство изолятов относятся к группе MSSA/ MDR S. aureus. Исследование поддержано РНФ 15-16-00020.

Исследование изолятов Staphylococcus aureus, полученных из молока КРС с субклинической формой мастита.

Исследована связь субклинической формы мастита коров со свойствами токсикогенных стафилококков. Впервые показано, что патогенные штаммы стафилококка золотистого содержат набор экзотоксинов. Представленность токсинов у животных составляла: альфа-токсин (hlA) - 70%;  лейкосидин (lucS) - 46.6%;  альфа пептид (psmA) - 81.6%;  бета пептид (psmB) -  95%; дельта токсин (hld) - 78.3% штаммов. Пептидный токсин psmB обнаруживался почти у всех штаммов, также, часто встречается hld и psmA. 88% штаммов выделенных от больных животных содержали гены энтеротоксинов sea - 53.3%, seb - 3.3%, sec - 50%, sed - 4%, see - 46.6%, seg - 70%, sei - 10%, selp - 3.3% и tsst1 -1.6%. Уровень продукции токсинов был низкий и не превышал 18 нг/мл. Обнаружены штаммы, продуцирующие одновременно по два и по три энтеротоксина, что повышает их патогенность.

Проведено полногеномное секвенирование и анонсирование геномов пяти штаммов стафилококка золотистого. Анализ геномов подтвердил наличие и локализацию генов токсинов.

Публикации

  1. Fursova KK, Shchannikova MP, Loskutova IV, Shepelyakovskaya AO, Laman AG, Boutanaev AM, Sokolov SL, Artemeva OA, Nikanova DA, Zinovieva NA, Brovko FA (2018). Exotoxin diversity of Staphylococcus aureus isolated from milk of cows with subclinical mastitis in Central Russia. J Dairy Sci 101 (5), 4325–4331
  2. Rudenko NV, Karatovskaya AP, Noskov AN, Shepelyakovskaya AO, Shchannikova MP, Loskutova IV, Artyemieva OA, Nikanova DA, Gladyr EA, Brovko FA (2018). Immunochemical assay with monoclonal antibodies for detection of staphylococcal enterotoxin H. J Food Drug Anal 26 (2), 741–750
  3. Fursova KK, Artemeva OA, Nikanova DA, Larin AK, Zinovieva NA, Brovko FA (2018). Draft genome sequences of five Staphylococcus aureus strains isolated from clinically healthy cows in the Russian Federation. Genome Announc 6 (16),
  4. Artykov AA, Fursova KK, Ryazantsev DY, Shchannikova MP, Loskutova IV, Shepelyakovskaya AO, Laman AG, Zavriev SK, Brovko FA (2017). Detection of staphylococcal enterotoxin a by phage display mediated immuno-PCR method. Russ. J. Bioorganic Chem. 43 (5), 540–543
  5. Артыков ФФ, Фурсова КК, Рязанцев ДЮ, Щанникова МП, Лоскутова ИВ, Шепеляковская АО, Ламан АГ, Завриев СК, Бровко ФА (2017). Детекция стафилоккокового энтеротоксина А методом фаговой иммуно-ПЦР. 43, 518–522
  6. Fursova KK, Shchannikova MP, Shepelyakovskaya AO, Pavlik LL, Brovko FA (2016). Staphylococcal enterotoxin a detection with phage displayed antibodies. Russ. J. Bioorganic Chem. 42 (3), 294–299

Исследование роли белка YB-1 в реакциях врождённого иммунитета.

В рамках выполнения темы № 59.8. « Исследование роли белка YB-1 в реакциях врождённого иммунитета.» были получены следующие результаты:

Мы подтвердили, что производное бактериальной клеточной стенки GMDP потенцирует ответ В-клеток на антиген Y. pestis V; мы также сообщаем, что основная связывающая мишень для GMDP, белка-хозяина YB-1 сама обладает адъювантными свойствами in vivo и что комбинация YB-1 и GMDP синергически увеличивает количество B-клеток и сродство к V-антигену.

YB-1 смог повысить выживаемость у мышей, получавших инъекцию смертельной дозы E. coli в модели острого бактериального сепсиса и введение рекомбинантного белка для мышей за 12 ч до летального заражения с E. coli, что привело к 50% долгосрочной выживаемости. Данные, полученные нами в модели in vitro и in vivo, позволяют предложить схему биохимических путей реализации сигналинга ГМДП в клетках животных и ключевую роль белка YB-1.

Публикации

  1. Laman AG, Lathe R, Shepelyakovskaya AO, Gartseva A, Brovko FA, Guryanova S, Alekseeva L, Meshcheryakova EA, Ivanov VT (2016). Muramyl peptides activate innate immunity conjointly via YB1 and NOD2. Innate Immun 22 (8), 666–673