Лаборатория функциональной геномики и протеомики растений

В лаборатории функциональной геномики и протеомики растений ведутся исследования, связанные с анализом транскриптома, протеома и пептидома модельных и сельскохозяйственно-важных культур. Одним из основных направлений исследований является изучение влияния стрессовых факторов на протеом и пептидом растительной клетки.

Так, в лаборатории реализуется проект, направленный на изучение влияния нонсен-опосредованной деградации (NMD) РНК на формирование протеома растительной клетки. Используя современные методы нанопорового секвенирования и коллекцию мутантных линий мха Physcomitrella patens по ключевым компонентам NMD системы сотрудники лаборатории выявляют потенциальные мишени деградации - транскрипты белок-кодирующих генов и длинные некодирующие РНК. Эффекты на трансляционном уровне устанавливаются протеомными исследованиями с применением методов масс-спектрометрии. Пептидомные анализы позволяют расширять пул идентифицируемых белков и выявлять трансляцию коротких открытых рамок считывания, которые могут быть триггерами нонсенс-опосредованной деградации транскриптов.

Особую роль занимают исследовапния, посвященные выявлению новых функциональных пептидов у растений и выявлению их биологической роли. Биологически активные пептиды могут выщепляться из неативного белка-предшественника, быть продуктом протеолиза функционального белка, либо кодироваться собственной короткой открытой рамкой считывания. Все эти группы пептидов являются областью научного интереса сотрудников лаборатории.

В лаборатории используются такие методы, как CRISPR/Cas9 редактирования генома, фенотипический анализ полученных мутантных линий, протеомный и пептидомный анализ, секвенирование РНК, флуоресцентная микроскопия.

Исследование функций пептидов, кодируемых короткими открытыми рамками считывания.

Короткие открытые рамки считывания (кОРС) – это небольшие (до 300 п.н.) участки генома, которые потенциально могут кодирвать маленькие белки или пептиды. Несмотря на то, что все геномы содержат большое количество кОРС их кодирующий потенциал и функции были недооценены, но в последнее время стали привлекать всё больший интерес научного сообщества. На данный момент в литературе появляется всё больше примеров коротких рамок, кодирующих функциональные пептиды. Однако у растений количество и функции таких пептидов остаются по-прежнему малоизученными. Так, известно всего лишь шесть функциональных пептидов растений, кодируемых кОРС. Такие пептиды участвуют в регуляции роста корней, образования клубеньков, прорастания пыльцевых зёрен, пролиферации клеток, развития пестика и программируемой клеточной смерти  (Casson et al., 2002; Rohrig et al, 2002; Blanvillain et al., 2011; Ikeuchi et al., 2011; Dong et al., 2013; Brito et al., 2018). Таким образом, у растений небольшое количество известных пептидов, кодируемых кОРС, вовлечены в регуляцию широкого спектра физиологических явлений. В нашей лаборатории ранее был отработан метод определения новых пептидов, кодируемых кОРС, в ходе применения которого был выявлен ряд новых функциональных пептидов (Fesenko et al., 2019). На данный момент в лаборатории проводится активное исследование их функциональной роли.

 

Выявление функциональных криптических пептидов.

Пептиды играют ключевую роль в регуляции фундаментальных биологических процессов. В последние годы с использованием современных методов анализа генома, транскриптома и пептидома был выявлен целый ряд биологически активных пептидов, в том числе, и у растений. Однако имеется значительное количество пробелов как в идентификации таких пептидов, так и в выяснении их функций и механизма действия. Отдельная группа группа таких пептидов – это криптические пептиды, которые выщепляются из функционального белка-предшественника. У растений на данный момент выявлены функции только для трёх криптических пептидов, хотя результаты исследований, проведённых на других организмах, позволяют предположить, что таких регуляторных пептидов гораздо больше. Например, один из таких пептидов – инсептин – образуется из хлоропластной АТФ-синтазы при биотическом стрессе и индуцирует защитный ответ. В лаборатории функциональной геномики и протеомики растений отработаны методы выявления криптических пептидов в клетках и секретоме растений. В результате выявлен ряд пептидов, образующихся при биотическом стрессе и проявляющих антимикробную активность. На данный момент продолжаются исследования биологической роли криптических пептидов в стрессовых условиях. 

 

Исследование функций фитогормонов пептидной природы RALF.

Одно из направлений исследований в лаборатории – это расширение знаний о функциях регуляторных пептидов семейства - RALF (Rapid Alkalinization Factor). Группа регуляторных пептидов RALF относится к классу Cys-богатых регуляторных пептидов и влияет на рост корней, гипокотилей, образование корневых волосков и удлинение пыльцевых трубок покрытосеменных растений, а также регулирует ответ на стрессовые факторы (Murphy, de Smet, 2014, Zhu et al., 2020).  В последнее время RALF-пептиды стали относить к фитогормонам, поскольку они консервативны, регулируют целый спектр биологических процессов и имеют собственный консервативный рецептор. Взаимодействие пептидов RALF с рецепторной киназой FERONIA приводит к целому ряду событий на клеточном уровне, среди которых повышение концентрации ионов кальция в цитозоли, активация малых ГТФаз, а также продукция активных форм кислорода НАДФН-оксидазой, что, в свою очередь модулирует растяжение клеток и ответ растения на абиотические и биотические стрессовые факторы (Liao et al., 2017). Таким образом, исследование функционирования RALF пептидов и передачи их сигнала не только является актуальной фундаментальной задачей, но и имеет прямое прикладное значение. Вместе с тем, решение этой задачи на покрытосеменных модельных объектах сопряжено с рядом трудностей, связанных как с большим количеством RALF-генов у этих растений, так и со сложностью проведения генетических манипуляций (диплоидный или даже полиплоидный геном, продолжительный жизненный цикл). В рамках проекта будет создана коллекция мутантных линий модельного растения – мха Physcomitrella patens - по генам RALF пептидов, а также изучены функции и механизм действия этих пептидов у высших споровых растений и проведены эволюционные параллели. Учитывая особенное филогенетическое положение P.patens, полученные данные будут использованы для изучения происхождения и эволюции пептидных гормонов,  а также их роли в одном из самых значимых для земной биосферы событии  - выходе растений на сушу.

 

Влияние системы нонсенс-опосредованной системы деградации РНК на пептидом клетки.

Лаборатория изучает влияние нонсен-опосредованной деградации (NMD) РНК на формирование протеома и пептидома растительной клетки.
Система NMD является одним из механизмов, контролирующих количество и качество транскриптов. В настоящее время показано, что нонсенс-опосредованная деградация РНК тесно связана с альтернативным сплайсингом и обеспечивает как деградацию абберантных транскриптов, так и регуляцию экспрессии множества генов. Установлено, что у растений система NMD влияет на экспрессию более чем 20% генов и участвует в температуро-зависимой регуляции цветения, ответе на вирусную и бактериальную инфекции, ответе на фитогормоны. В частности, у арабидописа ответ на ауксин и регенерация побегов напрямую регулируется системой NMD. Однако мало известно о том, как связаны механизм нонсенс-опосредованной деградации РНК и ответ растений на абиотические и биотические стрессовые факторы. Показано, что в условиях стресса система NMD ингибируется, ослабляя контроль над трансляцией некоторых транскриптов. Это может приводить к появлению в протеоме и пептидоме клетки новых белков и пептидов, участвующих в ответе на стрессы. Особенно интересным представляется изучение функций пептидов, кодируемых короткими открытыми рамками считывания, которые являются триггерами механизма NMD.
Используя современные методы  нанопорового секвенирования и коллекцию мутантных линий Physcomitrella patens по ключевым компонентам NMD системы сотрудники лаборатории выявляют потенциальные мишени деградации -  транскрипты белок-кодирующих генов и длинные некодирующие РНК. Эффекты на трансляционном уровне устанавливаются протеомными исследованиями с применением методов масс-спектрометрии. Пептидомные анализы позволяют расширять пул идентифицируемых белков и выявлять трансляцию коротких открытых рамок считывания. Интеграция транскриптомных, протеомных и пептидомных анализов предоставляет возможность всесторонне оценить роль механизма нонсенс-опосредованной деградации РНК в жизни растительной клетке.     

Поддержана грантом РФФИ 20-04-00938 (2020)

Все публикации (показать избранные)

Загружаются...

Тальянский Михаил Эммануилович

снс Фесенко Игорь Александрович

email: fesigor@gmail.com

Короткие рамки считывания кодируют регуляторные микробелки у растений

В организмах живых существ есть небольшие участки ДНК размером до 300 пар нуклеотидов, которые могут потенциально кодировать маленькие белки. Короткие рамки считывания найдены в ДНК всех организмов, однако их обычно отбрасывают при биоинформатическом анализе генома. Это приводит к тому, что кодирующий потенциал геномов остается неизученным, а биологическая роль продуктов считывания этих коротких рамок зачастую недооценивается. Мы обнаружили приблизительно 70 тысяч маленьких рамок считывания на различных типах молекул РНК модельного растения — мох Physcomitrella patens. Более 5000 из них оказались консервативными, то есть мало изменявшимися в процессе эволюции у всех организмов, поэтому они встречались не только у мха. Для поиска транслирующихся коротких рамок был использован масс-спектрометрический анализ. После жесткой фильтрации, для дальнейшего анализа использовали 46 транслирующихся рамок, находящихся на разных типах РНК, включая длинные некодирующие РНК. По некоторым коротким рамкам были получены мутантные линии со сверхэкспрессией или нокаутом пептидов. Оказалось, что выбранные для проверки микробелки участвуют в регуляции развития и роста мха. При «выключении» найденных генов, например отвечающих за синтез пептидов psep3 и psep25, наблюдалось снижение роста растения, а их избыточная работа приводила к разнообразным внешним эффектам или появлению новых гаметофоров — частей, несущих половые органы. В настоящее время научный интерес к теме начал стремительно расти, особенно из-за того, что причина некоторых заболеваний человека лежит в нарушении альтернативных рамок считывания.

Публикации

  1. Fesenko I, Kirov I, Kniazev A, Khazigaleeva R, Lazarev V, Kharlampieva D, Grafskaia E, Zgoda V, Butenko I, Arapidi G, Mamaeva A, Ivanov V, Govorun V (2019). Distinct types of short open reading frames are translated in plant cells. Genome Res 29 (9), 1464–1477

Кластер дифференциально экспрессируемых белков метионинового цикла в сортах картофеля, контрастных в ответе на комбинированный стресс

Совместно с: Лаборатория молекулярных основ стрессоустойчивости растений

Сравнительный количественный протеомный анализ сортов картофеля Гала и Чикаго, контрастных в ответе на биотический стресс (инфекция Y вирусом картофеля, YВК) и абиотический тепловой стресс (повышение температуры до 28°С) выявил кластер дифференциально экспрессируемых белков-участников метионинового цикла. Известно, что метилирование РНК/ДНК является важным фактором, влияющим на устойчивость растений к вирусной инфекции и возможно, толерантность к абиотическим стрессам.

В растениях восприимчивого сорта Чикаго снижено количество пяти белков (на схеме выделены зеленым цветом), участвующих в процессе метилирования. Напротив, в растениях устойчивого сорта Гала увеличено количество цистатион β-лиазы и SAM метилтрансферазы (на схеме отмечены красным цветом), участвующих в превращении S-аденозилметионина - донора метильной группы. Проанализированы уровни экспрессии генов некоторых из белков метионинового цикла методом количественной ПЦР в реальном времени. Сравнение полученных данных с результатами протеомного анализа показало, что снижение количества белков метионинового цикла у восприимчивого сорта Чикаго происходит на трансляционном, а не на транскрипционном уровне. Предположено, что воприимчивость к стрессам растений картофеля сорта Чикаго может быть связано с пониженным уровнем белков, участвующих в метилировании.

Hовый антивирусный механизм растений, основанный на взаимодействии субъядерных структур и вирусного белка.

Совместно с: Лаборатория молекулярных основ стрессоустойчивости растений

Ядрышки и тельца Кахаля (ТК) являются суб-ядерными доменами с хорошо известными ролями в метаболизме РНК и сборке РНК-белковых комплексов. Однако эти структуры также участвуют и в других важных аспектах функционирования клетки. В сотрудничестве с Институтом имени Джеймса Хаттона (Великобритания) описан ранее неизвестный механизм, с помощью которого эти структуры и их компоненты регулируют защитный ответ растения на атаку патогена. Показано, что основные белки ТК - коилин и ядрышка - фибрилларин взаимодействуют с поли(АДФ-рибозо)полимеразой (PARP) и модифицируют ее функцию, а это взаимодействие модулируется белком 16К вируса погремковости табака.

Наши результаты демонстрируют, что PARP - ядерный белок, который модифицирует функцию и субклеточную локализацию различных ядерных «целевых» белков (акцепторов) путем присоединения к ним цепей АДФ-рибозы (PAR). Для ре-активации целевых белков, PARP перемещает их из ядрышка и хроматина в ТК для удаления и рециркуляции PAR (рис.1a). При заражении вирусом погремковости табака (TRV) растение запускает защитные ответы, включающие избыточное накопление активных форм кислорода (ROS), увеличения уровня транскриптов PR-1a (патоген-ассоциированного белка, PR) и отложение каллозы (маркеры противовирусного защитного ответа). В ходе вирусной инфекции белок 16К синтезируется в цитоплазме и нацеливается на ядро клетки (рис.1б).  В ядре (ТК и нуклеоплазме) вирусный белок 16К взаимодействует с коилином и релокализует его в ядрышко, что, в свою очередь приводит к задержке PARP в данном субъядерном домене, предотвращая его перемещение из ядрышка в ТК для удаления и рециркуляции PAR. Это приводит к избыточному накоплению PAR/модифицированных PAR белков и значительному усилению защитных реакций растения, таких как экспрессия гена PR-1a и отложение каллозы. По-видимому, отложение каллозы напрямую ограничивает транспорт вируса во вновь образованные листья (рис. 1в).