Лаборатория молекулярной токсинологии

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации

Руководитель: Уткин Юрий Николаевич, д. х. н.
utkin@ibch.ru+7(495)336-65-22

яды змей, токсины, выделение и свойства новых белков, Никотиновый холинорецептор

Лаборатория проводит фундаментальные исследования по изучению молекулярной структуры компонентов животных ядов и механизмов их действия. В качестве основного инструмента для исследований механизмов функционирования нервной системы и проведения нервных импульсов используются токсины. В результате расширения круга интересов и задач Лаборатории ее сотрудники изучают яды, которые не только воздействуют на нейрорецепторы, но и влияют на гемостаз.

Лаборатория молекулярной токсинологии сотрудничает с рядом зарубежных лабораторий и групп. Так, изучением различных рецепторов и поиском новых токсинов она занимается совместно с Рурским университетом (Ruhr-Universität Bochum, Германия). Кроме того, исследование токсинов проводится совместно с белорусскими учеными («Институт физиологии НАН Беларуси»), которые изучают влияние нейроактивных соединений ядов на развитие опухолей (в качестве модельной опухоли используется карцинома Эрлиха). Особый интерес представляет сотрудничество Лаборатории со специалистами из Вьетнама (Institute of Applied materials science, Хошимин), вместе с которыми изучаются яды вьетнамских животных. Также Лаборатория молекулярной токсинологии  налаживает связи с учеными из Индии.

Помимо традиционно изучаемых нейротоксинов Лаборатория исследует пептиды и белки, влияющие на свертываемость крови. Ученые занимаются установлением их структуры и определением биологических свойств. Кроме того, сотрудники Лаборатории вместе с коллегами из филиала ИБХ (г. Пущино) изучают снижающие кровяное давление пептиды, которые были найдены в яде бирманской гадюки Azemiops feae.  Отдел молекулярных основ нейросигнализации занимается доклиническими исследованиями одного из пептидов этой ядовитой змеи, который взаимодействует с холинорецепторами и позиционируется как местный миорелаксант. В будущем это позволит использовать его для лечения  ряда заболеваний, в которых существует необходимость в местном расслаблении мышц.

Лаборатория молекулярной токсинологии была создана в 2009 году. Вместе с Лабораторией лиганд-рецепторных взаимодействий она входит в состав Отдела молекулярных основ нейросигнализации, который, в свою очередь, возник вследствие  расширения круга задач существовавшей до этого Лаборатории рецепции нейропептидов. Имеющиеся у обеих Лабораторий взаимодополняемые методы структурной нейробиологии помогают сотрудникам проводить совместные исследования и наиболее эффективно выполнять главные задачи отдела.

  • Проведение фундаментальнх исследований по изучению молекулярной структуры компонентов животных ядов и механизмов их действия.
  • Исследование пептидов и белков, влияющих на свертываемость крови, установление их структуры и определение биологических свойств. 

В результате работы выделено и охарактеризовано более трех десятков новых белков, обладающих уникальными структурными и функциональными характеристиками. 

  • При изучении яда кобры Naja kaouthia впервые обнаружено несколько новых токсинов. Так, выделен и охарактеризован первый и пока единственный гликозилированный трехпетельный токсин - цитотоксин 3. Установлено, что гликозилирование этого токсина приводит к существенному снижению его цитотоксичности. Также впервые показано, что давно известные «слабые» токсины способны взаимодействовать с никотиновыми холинорецепторами. При этом, обладая слабым сродством к рецептору, такие токсины связываются практически необратимо. Кроме того, эти токсины способны также аллостерически связываться с мускариновыми холинорецепторами. В яде этой же кобры впервые обнаружены ковалентные димеры трех-петельных токсинов. Показано, что такая димеризация вызывает изменение биологической активности токсинов, образующих димер.

Кристаллическая структура димера альфа-кобратоксина (Osipov et al., (2012) J. Biol. Chem. 287(9), 6725-6734.)

  • Несколько нейротоксичных белков выделено из ядов гадюк. Так, из яда гадюки Никольского выделена гетеродимерная фосфолипаза А2, проявляющая пресинаптическую нейротоксичность. Из яда африканской шумящей гадюки Bitis arietans выделен блокирующий никотиновый холинорецептор (нХР) белок с молекулярной массой 27,4 кДа. N-концевая последовательность этого белка, названного битанарином, гомологична N-концевым аминокислотным последовательностям фосфолипаз А2 из ядов змей, имеющих молекулярную массу около 14 кДа и не обладающих способностью блокировать холинорецепторы. С использованием метода радиолигандного анализа установлено взаимодействие битанарина с нХР мышечного и альфа7 типа, а также с ацетилхолин-связывающими белками моллюсков L. stagnalis и A. californica. По своей активности битанарин близок так называемым необычным или слабым трехпетельным токсинам из ядов кобр. Этот белок обладает также фосфолипазной активностью, сопоставимой с активностью фософлипаз А2 яда кобр. Битанарин представляет собой фосфолипазу А2 нового типа и является первой фософлипазой, для которой показано взаимодействие с нХР.
  • При исследовании компонентов ядов, воздействующих на гемостаз, также обнаружен ряд новых белков. Так, из яда кобры Naja oxiana выделена металлопротеиназа оксиагин, для которой впервые показан новый механизм ингибирования системы комплемента. В яде кобры Naja haje обнаружена фософлипаза А2, обладающая уникальной способностью ингибировать тромбин. Это – первый представитель нового структурного типа белковых ингибиторов тромбина.

Все публикации (показать избранные)

Загружаются...

Уткин Юрий Николаевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 31, комн. 606
  • Тел.: +7(495)336-65-22
  • Эл. почта: utkin@ibch.ru

Включение в наноматериалы усиливает биологическую активность компонентов животных ядов

Ранее была продемонстрирована сильная антикоагулянтная активность дипептида IleTrp (IW) и аденозина (Ado), обнаруженных в яде скорпиона. Результаты дальнейшего исследования показали, что включение этих соединений в наноматериалы существенно усиливает их антикоагулянтную активность. Ado и IW были включены в термочувствительный наногель, состоящий из гепарина, к которому ковалентно присоединен полимер плюроник P123. Биологическую активность определяли путем измерения времени кровотечения из хвоста мыши in vivo и обнаружили, что инкапсуляция Ado и IW в наноматериал значительно усиливает их действие, что приводит к увеличению времени кровотечения. Таким образом, включение низкомолекулярных антикоагулянтов Ado и IW в наноматериалы можно рассматривать как способ повышения их биологической активности.

Публикации

  1. Nguyen TD, Nguyen TN, Nguyen TTT, Ivanov IA, Nguyen KC, Tran QN, Hoang AN, Utkin YN (2019). Nanoencapsulation Enhances Anticoagulant Activity of Adenosine and Dipeptide IleTrp. Nanomaterials (Basel) 9 (9),
  2. Nguyen TD, Nguyen TN, Nguyen KC, Tran QN, Hoang AN, Egorova NS, Starkov VG, Tsetlin VI, Utkin YN (2019). Encapsulation of Neurotoxins, Blockers of Nicotinic Acetylcholine Receptors, in Nanomaterials Based on Sulfated Polysaccharides. Dokl Biochem Biophys 487 (1), 251–255

Первый трехпетельный змеиный нейротоксин, различающий по аффинности и кинетике взаимодействия два участка связывания в мышечном никотиновом рецепторе

Совместно с: Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий

Из яда крайта Bungarus candidus выделен и охарактеризован новый трехпетельный α-нейротоксин - αδ-бунгаротоксин, отличающийся от хорошо известного блокатора мышечных, α7 и α9α10 нейрональных подтипов никотиновых рецепторов α-бунгаротоксина 11 заменами из 74 аминокислотных остатков. Новый токсин также эффективно взаимодействовал с α7 рецептором с наномолярным сродством, но при этом продемонстрировал уникальное для трехпетельных токсинов различие в сродстве к двум разным участкам связывания на мышечном рецепторе (аффинность к α-δ сайту выше чем к α-γ сайту в 20 раз). Кроме того, новый токсин показал быструю кинетику ухода с одного из участков в отличие от необратимого связывания α-бунгаротоксина. Таким образом, открыт новый инструмент исследования мышечных никотиновых рецепторов с уникальным набором свойств.

Публикации

  1. Utkin YN, Kuch U, Kasheverov IE, Lebedev DS, Cederlund E, Molles BE, Polyak IL, Ivanov IA, Prokopev NA, Ziganshin RH, Jornvall H, Alvelius G, Chanhome L, Warrell DA, Mebs D, Bergman T, Tsetlin VI (2019). Novel Long-chain Neurotoxins from Distinguish the Two Binding Sites in Muscle-type Nicotinic Acetylcholine Receptors. Biochem J 476 (8), 1285–1302

Предложен и синтезирован новый класс ингибиторов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов

Совместно с: Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий

На основании  собственных и литературных данных, показывающих, что положительно заряженные аминокислотные остатки играют важную роль в активности α-конотоксинов, синтезирована серия пептидов, построенных исключительно из остатков  аргинина (R) и показано, что олигоаргинины  (R=6-18) являются ингибиторами различных подтипов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР), при этом R8  имеет  выраженную селективность к нейрональным α9/ α10, а R16 имеет наибольшее сродство к α7 нАХР. Ингибирующая активность установлена и у ряда положительно заряженных полимеров, которые, наряду с олигоаргининами используются для внутриклеточной доставки потенциальных лекарственных соединений, что должно учитываться в качестве возможных положительных и отрицательных эффектов.

Публикации

  1. Lebedev D, Kryukova E, Ivanov I, Egorova N, Timofeev N, Spirova E, Tufanova E, Siniavin A, Kudryavtsev D, Kasheverov I, Zouridakis M, Katsarava R, Zavradashvili N, Iagorshvili I, Tzartos S, Tsetlin V (2019). Oligoarginine Peptides, a New Family of nAChR Inhibitors. Mol Pharmacol 96 (5), 664–673

Первые рекомбинантные трехпетельные токсины гадюк – антагонисты никотиновых холинорецепторов мышечного и нейронного типа

Совместно с: Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий,  Лаборатория молекулярной диагностики,  Отдел «Учебно-научный центр»

Одним из основных компонентов ядов змей семейства Elapidae являются трехпетельные токсины, которые обладают различными видами биологической активности, включая ингибирование синаптической передачи за счет блокирования холинорецепторов никотинового типа. Трехпетельные токсины до сих пор не обнаружены в ядах змей семейства Viperidae, хотя кодирующие их мРНК найдены в ядовитых железах змей этого семейства. Нами впервые проведена экспрессия в клетках E. coli генов двух трехпетельных токсинов TFT-AF и TFT-VN, последовательности которых установлены на основании последовательностей кДНК из ядовитых желез гадюк Azemiops feae и Vipera nikolskii, соответственно. Исследование биологической активности полученных токсинов проведено с помощью методов электрофизиологии, кальциевого имиджинга и радиолигандного анализа. Нами впервые показано, что трехпетельные токсины гадюк являются антагонистами никотиновых холинорецепторов как нейронного, так и мышечного типа.

Открыто подавление роста карциномы Эрлиха факторами яда кобры

При исследовании влияния компонентов яда кобры на привитую мышам карциному Эрлиха впервые установлено, что фактор роста нервов (NGF) яда кобры и фактор яда кобры (CVF) подавляют рост опухоли. При этом противоопухолевое действие NGF зависит от статуса иммунной системы и пропадает при истощении системы комплемента; нарушение воспалительного ответа также отменяет противоопухолевый эффект NGF.

Публикации

  1. Osipov AV, Terpinskaya TI, Kuznetsova TE, Ryzhkovskaya EL, Lukashevich VS, Rudnichenko JA, Ulashchyk VS, Starkov VG, Utkin YN (2017). Cobra venom factor and ketoprofen abolish the antitumor effect of nerve growth factor from cobra venom. Toxins (Basel) 9 (9),
  2. Terpinskaya TI, Ulashchik VS, Osipov AV, Tsetlin VI, Utkin YN (2016). Suppression of Ehrlich carcinoma growth by cobra venom factor. Dokl Biol Sci 470 (1), 240–243
  3. Osipov AV, Terpinskaya TI, Kryukova EV, Ulaschik VS, Paulovets LV, Petrova EA, Blagun EV, Starkov VG, Utkin YN (2014). Nerve growth factor from cobra venom inhibits the growth of Ehrlich tumor in mice. Toxins (Basel) 6 (3), 784–795

Структурно-динамическая модель взаимодействия цитотоксина S-типа с мицеллами детергентов и липидными мембранами: спектроскопия ЯМР высокого разрешения и молекулярная динамика.

Совместно с: Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии,  Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

Расшифровка пространственной структуры мембранных пептидов и белков методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения предполагает использование сред, моделирующих мембранное окружение. Чаще всего в экспериментах используют мицеллы детергентов. Однако неясно, как перенести результаты таких исследований на липидный бислой. В настоящей работе предложен ответ на этот вопрос для бета-структурного белка, цитотоксина 1 S-типа, выделенного из яда кобры N. oxiana. Пространственная структура белка получена методом спектроскопии ЯМР в водном растворе и в мицеллах додецилфосфохолина (ДФХ). Методами молекулярной динамики (МД) в полноатомном и «крупнозернистом» (coarse-grained) приближениях исследовали встраивание белка в мицеллы ДФХ (Рисунок, левая панель) и в липидный бислой пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (Рисунок, правая панель). Показано, что встраивание токсина как в мицеллы, так и в мембраны сопровождается адаптацией молекулы белка к гидрофобно/ гидрофильной среде и конформационной перестройкой в районе окончания петли-II (Рисунок, левая панель). При этом в мицелле реализуется только одно связанное состояние молекулы токсина – окончаниями всех трёх петель молекулы. В бислое наблюдается усреднение между тремя модами связывания – окончаниями первой петли; окончаниями петель I и II; окончаниями всех трёх петель (Рисунок, правая панель, сверху-вниз).

Новые флуоресцентные зонды для исследования строения и функций мембран

Совместно с: Лаборатория химии липидов

С помощью антрилвинил-периленоильной FRET-пары (FRET - Förster resonance energy transfer) фосфолипидных зондов показано, что на поверхности церамид-1-фосфат-переносящего белка существуют регуляторные центры взаимодействий с головными группами фосфоглицеридов в липидной мембране, в отличие от других представителей суперсемейства гликолипид-переносящих белков, специфичных к гликолипидам [1]. С помощью новой BODIPY FRET-пары фосфатидилхолиновых зондов показано, что действие гетеродимерных фосфолипаз А2 из яда гадюки Никольского на отрицательно заряженные липидные бислои приводит к агрегации и стэкингу мембран; это может являться одним из механизмов биологической активности фосфолиазы А2 [2]. Методом FRET между BODIPY-ганглиозидными зондами в сочетании с симуляцией Монте-Карло показано, что в модельных мембранах, имитирующих плазмалемму, образуются сфингомиелин-холестериновые 10-нм-домены (рафты) с жидкокристаллической неупорядоченной фазой [3].

Публикации

  1. Alekseeva AS, Tretiakova DS, Chernikov VP, Utkin YN, Molotkovsky JG, Vodovozova EL, Boldyrev IA (2017). Heterodimeric V. nikolskii phospholipases A2 induce aggregation of the lipid bilayer. Toxicon 133, 169–179
  2. Zhai X, Gao YG, Mishra SK, Simanshu DK, Boldyrev IA, Benson LM, Bergen HR, Malinina L, Mundy J, Molotkovsky JG, Patel DJ, Brown RE (2017). Phosphatidylserine stimulates ceramide 1-phosphate (C1P) intermembrane transfer by C1P transfer proteins. J Biol Chem 292 (6), 2531–2541
  3. Koukalová A, Amaro M, Aydogan G, Gröbner G, Williamson PTF, Mikhalyov I, Hof M, Šachl R (2017). Lipid Driven Nanodomains in Giant Lipid Vesicles are Fluid and Disordered. Sci Rep 7 (1), 5460

Разработка новой методики на основе кальциевого имиджинга и функциональная характеристика с ее помощью α7/α9 мутантов нАХР.

Совместно с: Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий

На основании метода кальциевого имиджинга была разработана новая методика, позволяющая достаточно эффективно экспрессировать в клеточных линиях функционально активные «трудные» подтипы никотиновых рецепторов (нАХР). Методика включает  в себя коэкспресиию с соответствующим подтипом рецептора шаперона и флуоресцентного кальциевого сенсора Case12.  Данная методика позволила получить 6 мутантных форм α7 нАХР с выбранными одиночными заменами аминокислотных остатков из α9 подтипа нАХР. Все полученные мутанты вместе с исходными рецепторами были проанализированы на сродство к ацетилхолину и эпибатидину с помощью разработанной методики. Это позволило выявить две ключевые мутации - L119D и F187S, определяющие селективность к указанным лигандам этих подтипов нАХР. Компьютерное моделирование показало существенное изменение расположение молекул лигандов в участках связывания именно этих двух мутантных форм рецептора, объясняя полученные данные.   

Публикации

  1. Shelukhina I, Spirova E, Kudryavtsev D, Ojomoko L, Werner M, Methfessel C, Hollmann M, Tsetlin V (2017). Calcium imaging with genetically encoded sensor Case12: Facile analysis of α7/α9 nAChR mutants. PLoS One 12 (8), e0181936

Cинтезирован SLURP-1 (81 аминокислотный остаток, 5 дисульфидов), идентичный по аминокислотной последовательности эндогенному белку человека, отличающийся от всех известных рекомбинантных белков по

Совместно с: Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий

Синтезирован  SLURP-1 (81 аминокислотный остаток, 5 дисульфидов), идентичный по аминокислотной последовательности эндогенному токсино-подобному белку человека. По данным 1Н-ЯМР он имеет ту же структуру, что и рекомбинантный rSLURP-1, несущий дополнительный N-концевой Met0, несколько отличается по молекулярной динамике и существенно по биологической активности в отношении различных подтипов никотиновых рецепторов. То есть необходимо максимальное приближение к структуре природного белка для установления механизмов его эндогенной активности и выбора последующих медицинских применений.

Публикации

  1. Durek T, Shelukhina IV, Tae HS, Thongyoo P, Spirova EN, Kudryavtsev DS, Kasheverov IE, Faure G, Corringer PJ, Craik DJ, Adams DJ, Tsetlin VI (2018). Interaction of Synthetic Human SLURP-1 with the Nicotinic Acetylcholine Receptors. Sci Rep 7 (1), 16606

Проведен первый количественный протеомный анализ ядов змей двух различных семейств: гадюковых из рода Vipera (настоящие гадюки), обитающих на территории России, и аспидовых из рода Bungarus ( крайты), обитающих на территории Вьетнама.

Проведен первый количественный протеомный анализ ядов змей двух различных семейств: гадюковых из рода Vipera (настоящие гадюки), обитающих на территории России, и аспидовых из рода Bungarus ( крайты), обитающих на территории Вьетнама. При этом установлено, что яды разных видов змей сильно различаются по составу, а основными компонентами ядов гадюк являются фосфолипазы А2, содержание которых варьирует от 24 до 65%. Наибольшее количество фосфолипаз А2 (65%) содержится в яде гадюки Никольского. Очень большие различия в составе ядов обнаружены между двумя видами крайтов. Так, в яде многополосного крайта Bungarus multicinctus представлены в основном нейротоксины, составляющие более 70% яда. В то время как в состав яда ленточного крайта Bungarus fasciatus входят в основном фосфолипазы А2, составляющие более 70% яда. Выявленные различия следует учитывать при лечении укусов разными видами змей.

Открыто взаимодействие нейротоксинов змей и альфа-конотоксина с ионотропными рецепторами гамма-аминомасляной кислоты

Впервые установлено, что нейротоксины ядов змей и альфа-конотоксин ингибируют токи, индуцируемые гамма-аминомасляной кислотой в GABA(A) рецепторах, гетерологически экспрессированных в ооцитах Xenopus. Степень ингибирования зависит как от природы нейротоксина, так и от субъединичного состава рецептора. При этом наибольшей ингибирующей активностью обладает a-кобратоксин Naja kaouthia. Ингибирование имеет смешанный конкурентный и неконкурентный характер. Центральная полипептидная петля a-кобратоксина играет главную роль во взаимодействии токсина с GABA(A) рецептором.