Пресс-центр / новости / Наука /

Научные достижения ИБХ РАН в 2021 году

На заседании Ученого Совета ИБХ РАН 29 декабря 2021 г. были представлены результаты научной деятельности подразделений Института за 2021 год. Вашему вниманию предлагается презентация директора А.Г. Габибова, а также список  достижений, поданных подразделениями на сайте.

отчёт, достижения ИБХ

Гончарук С.А.

Итоговая презентация директора Института А.Г. Габибова

  • Скачать в формате PDF
  • Публикационная активность отделов и лабораторий представлена на 29 декабря 2021г. Напоминаем, что актуальная статистика всегда доступна на сайте.

Отдел пептидно-белковых технологий

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

,  

Отдел пептидно-белковых технологий (Иванов В.Т.)

,  

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

,  

НПП «Питомник лабораторных животных» (Телегин Г.Б.)

Антиген-специфичная стимуляция и экспансия CAR-T клеток с использованием искусственных везикул.

Инженерия Т-клеток человека сделала революцию в онкологии. Разработка CAR-T терапии привела к значительному успеху в лечении В-клеточного лейкоза. Критическим этапом технологии является наработка in vitro из донорских аутологичных Т клеток CAR-T с заранее заданной антигенной специфичностью. Для разработки специфического улучшенного протокола экспансии CAR-T-клеток предложено использовать клеточные мембранные везикулы стабильно экспрессирующие поверхностно-связанные антигены CAR. В опытах in vivo продемонстрировано что антиген-специфические везикулы способны вызывать более сильную стимуляцию, пролиферацию и функциональную активность CAR-T-клеток. Новая методология значительно расширит возможности получения улучшенных популяций функциональных CAR-T-клеток для терапии рака.

  1. Ukrainskaya V, Rubtsov Y, Pershin D, Podoplelova N, Terekhov S, Yaroshevich I, Sokolova A, Bagrov D, Kulakovskaya E, Shipunova V, Deyev S, Ziganshin R, Chernov A, Telegin G, Maksimov E, Markov O, Oshchepkova A, Zenkova M, Xie J, Zhang H, Gabibov A, Maschan M, Stepanov A, Lerner R 2021 Antigen-Specific Stimulation and Expansion of CAR-T Cells Using Membrane Vesicles as Target Cell Surrogates. Small e2102643

Лаборатория белков гормональной регуляции (Белогуров А.А.)

,  

Группа химии гетероциклических соединений (Баранов М.С.)

Глубинное профилирование метаболизма убиквитина в клетках млекопитающих с применением флуоресцентного трекинга

Определено время полужизни убиквитина в клетках млекопитающих (4 часа)

Показано, что усреднённо в клетке белки конъюгированы с 6 остатками убиквитина

Выявлено, что молекула убиквитина участвует в среднем в 16 циклах конъюгации, а безвозвратные потери убиквитина составляют одна молекулу на 4 акта захвата полиубиквитинированного субстрата протеасомой

Аминокислотный остаток UbK27 является критичным в терминах внутриклеточной стабильности убиквитина в целом

  1. Kudriaeva AA, Livneh I, Baranov MS, Ziganshin RH, Tupikin AE, Zaitseva SO, Kabilov MR, Ciechanover A, Belogurov AA 2021 In-depth characterization of ubiquitin turnover in mammalian cells by fluorescence tracking. Cell Chem Biol 28 (8) 1192–1205.e9

Лаборатория химии протеолитических ферментов (Смирнов И.В.)

,  

Лаборатория биокатализа (Габибов А.Г.)

,  

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Андреев Д.Е.)

Живые биосенсоры для сверхвысокопроизводительного скрининга антимикробной активности против грамотрицательных бактерий

Грамотрицательные бактерии представляют собой серьезную угрозу из-за их внутренней и приобретенной устойчивости к антибиотикам. Многие современные лекарственные препараты-кандидаты демонстрируют заметную антимикробную активность против грамположительных бактерий, но неэффективны против грамотрицательных.

Сверхвысокопроизводительные методы скрининга на основе микрофлюидики представляют собой новую парадигму для глубокого анализа антибактериальной активности и открытия антибиотиков. Ключевой этап этой технологии основан на совместном культивировании одной клетки из выбранного микробиома вместе с репортерным флуоресцентным патогеном в эмульсии и последующим отбором свободных от репортера капель с использованием технологии FACS.

В Лаборатории химии протеолитических ферментов была разработана панель репортерных штаммов грамотрицательных бактерий Escherichia coli для обеспечения живых биосенсоров для точного мониторинга антимикробной активности. Мы создали репортерные штаммы для стабильного, гомогенного, высокого уровня продукции зеленого флуоресцентного белка (GFP) в E. coli. Две альтернативные стратегии, основанные на (i) высокоэффективном конститутивном промоторе pJ23119 и (ii) ослабленном контроле промотора Т7, сделали возможным чувствительное флуоресцентное обнаружение роста и уничтожения бактерий. Разработанные живые биосенсоры были применены для скрининга почвенного микробиома, что в результате использование сверхвысокопроизводительного скрининга почвенного микробиома позволило отобрать штамма Paenibacillus polymyxa P4. Геномный и метаболомный анализ позволил идентифицировать антибиотик колистин (полимиксин E) и кластер генов его биосинтеза, опосредующий активность антибиотика. Таким образом, живые биосенсоры могут быть эффективно использованы для открытия антибиотиков / пробиотиков, мониторинга окружающей среды и синтетической биологии.

  1. Baranova MN, Babikova PA, Kudzhaev AM, Mokrushina YA, Belozerova OA, Yunin MA, Kovalchuk S, Gabibov AG, Smirnov IV, Terekhov SS 2021 Live biosensors for ultrahigh-throughput screening of antimicrobial activity against gram-negative bacteria. Antibiotics (Basel) 10 (10)

Группа молекулярной физиологии (Деев И.Е.)

Роль трансмембранного домена в фосфорилировании рецептора IRR

Сотрудниками группы молекулярной физиологии, лаборатории клеточной биологии рецепторов, лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии и лаборатории моделирования биомолекулярных систем, впервые проведены исследования роли трансмембранного домена в активации рецепторной тирозинкиназы IRR. Для этого использовали два подхода: сначала с помощью молекулярного моделирования мы определяли трехмерную структуру трансмембранной части рецептора IRR в липидной среде, что позволило нам интерпретировать результаты мутагенеза. Во-вторых, были получены мутантные формы рецептора IRR с заменами в трансмембранном домене и проведен анализ pH-чувствительности этих мутантов.

Было показано, что наибольший эффект имеют двойные замены аминокислотных остатков (V929E, G930R) и (A938E, A939R) (Рис. 1). Данные мутации могут стабилизировать гомодимер рецептора IRR в активной конформации и приводят к сильному базальному фосфорилированию рецептора при нейтральных значениях pH среды, что также сопровождается активацией внутриклеточных сигнальных путей.

Группа экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки (Фролова Е.И.)

Получена серия однодоменных наноантител к шиповидному белку вируса SARS-Cov-2, способных блокировать его взаимодействие с клеточным рецептором

Для эффективного лечения COVID-19 необходимо создание новых средств таргетной терапии, нацеленных непосредственно на вирус SARS-CoV-2. Основными кандидатами на роль таких средств являются препараты на основе антител. Помимо преимуществ – длительного времени действия после введения в кровоток и низкой иммуногенности – у моноклональных антител традиционной структуры есть и недостатки – слабая тканевая проницаемость, что затрудняет их воздействие на распространение вируса по легочному эпителию. Таких недостатков лишены фрагменты однодоменных антител – нанотела, получаемые из иммуноглобулинов животных семейства верблюдовых, обладающие компактным размером (~15 кДа), высокой стабильностью в различных средах и хорошей проникающей способностью. Мы иммунизировали двух животных (альпак) рекомбинантным шиповидным белком (Spike) SARS-CoV-2 и рецептор-связывающим доменом (RBD) этого белка, и провели селекцию нанотел из иммуноглобулиновых клонотек методом фагового дисплея. В результате селекции была получена панель нанотел, специфично связывающихся со Spike с аффинностью в диапазоне 10-7 – 10-10 М. В экспериментах in vitro, среди идентифицированных кандидатных нанотел 7 вариантов проявили способность блокировать взаимодействие Spike и рецептора ACE2, который используется вирусом для проникновения в клетку. В опытах с использованием репортерной системы – лентивирусного вектора, псевдотипированного белком Spike – 6 вариантов нанотел показали нейтрализующую активность, для пяти нанотел она была затем подтверждена в экспериментах по нейтрализации живого вируса SARS-CoV-2. Идентифицированные нейтрализующие нанотела могут быть использованы для терапии COVID-19, причем компактный размер и высокая стабильность таких молекул могут позволить их применение в виде ингаляционно-вводимого препарата. Такой путь введения позволяет достичь высоких концентраций действующего вещества непосредственно на слизистых оболочках легких, что необходимо для подавления внутрилегочного распространения вируса.

Отдел иммунологии

Лаборатория клеточных взаимодействий (Сапожников А.М.)

Каталитическая субъединица теломеразы увеличивает пролиферацию и продолжительность жизни NK-клеток человека без иммортализации

Была трансдуцирована каталитическая субъединица теломеразы человека (hTERT) в популяции и клональные культуры NK-клеток.

Условия трансдукции были оптимизированы для повышения эффективности за счет активации клеток фидерными клетками IL-2 и K562-mbIL21.

Сверхэкспрессия hTERT умеренно влияла на фенотип и дегрануляцию NK-клеток, увеличивала пролиферативный потенциал и увеличивала продолжительность жизни трансдуцированных культур NK-клеток, но не приводила к истинной иммортализации.

  1. Velichinskii RA, Streltsova MA, Kust SA, Sapozhnikov AM, Kovalenko EI 2021 The Biological Role and Therapeutic Potential of NK Cells in Hematological and Solid Tumors. Int J Mol Sci 22 (21)
  2. Streltsova MA, Ustiuzhanina MO, Barsov EV, Kust SA, Velichinskiy RA, Kovalenko EI 2021 Telomerase Reverse Transcriptase Increases Proliferation and Lifespan of Human NK Cells without Immortalization. Biomedicines 9 (6) 662

Лаборатория клеточных взаимодействий (Сапожников А.М.)

HLA-DR-позитивные NK-клетки пролиферируют в ответ на антигены Mycobacterium tuberculosis и опосредуют индуцированную микобактериями активацию Т-клеток

NK-клетки играют важную роль в борьбе с туберкулезной инфекцией: они не только способны убивать инфицированные клетки, но также контролировать активность макрофагов и развитие адаптивного иммунного ответа. Мы в сотрудничестве с Институтом туберкулёза и Институтом биологии развития обнаружили, что увеличение субпопуляции NK-клеток, экспрессирующих HLA-DR - подтип MHC класса II, в периферической крови туберкулезных больных ассоциировано с пролиферирацией этих клеток в ответ на стимуляцию in vitro суспензией разрушенных ультразвуком клеток Mycobacterium tuberculosis . Активированные HLA-DR+ NK-клетки имели менее дифференцированный фенотип и повышенную экспрессию рецепторов NKp30 и NKp46, а также интенсивнее продуцировали IFNγ в ответ на микобактериальные антигены. Кроме того, было продемонстрировано, что HLA-DR+ NK-клетки после предварительной инкубации с микобактериями способны стимулировать HLA-DR-опосредованную активацию аутологичных CD4+ Т-клеток. Таким образом, функционально активные HLA-DR+ NK-клетки могут быть важным связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунитетом.

  1. Kust SA, Streltsova MA, Panteleev AV, Karpina NL, Lyadova IV, Sapozhnikov AM, Kovalenko EI 2021 HLA-DR-Positive NK Cells Expand in Response to Mycobacterium Tuberculosis Antigens and Mediate Mycobacteria-Induced T Cell Activation. Front Immunol 12 662128

Лаборатория клеточных взаимодействий (Сапожников А.М.)

Роль белков теплового шока 70 кДа в патогенезе бронхиальной астмы

Повышенный уровень внеклеточного HSP70 был обнаружен в сыворотке периферической крови и мокроте пациентов с астмой, а также в жидкости бронхоальвеолярного смыва мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей. В представленном обзоре АТФ-азная и шаперонная активности HSP70 рассмотрены с точки зрения регуляции иммунного ответа при астме. Учитывая решающую роль хронического воспалительного ответа при астме, понимание эффектов HSP70 может открыть новые перспективы терапевтического контроля воспаления.

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

Инновационный радиофармпрепарат на основе рекомбинантного DARPin G3 для радионуклидной диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu успешно прошел I фазу клинических испытаний.

Проведена I фаза клинических испытаний инновационного радиофармпрепарата 99mTc-DARPin G3, созданного на основе меченного 99мтехнецием рекомбинантного адресного полипептида DARPin G3 и предназначенного для радионуклидной диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu. Показано, что визуализация экспрессии опухолевого маркера HER2/neu с использованием 99mTc-DARPin G3 безопасна, обеспечивает низкую дозовую нагрузку на организм и хорошо переносится пациентами. Полученные изображения опухолей позволяют достоверно различать HER2-положительный и HER2-отрицательный рак груди, позволяя врачу выбрать обоснованный протокол лечения. Успешные результаты I фазы клинических испытаний служат основанием для дальнейшей клинической разработки диагностического радиофармпрепарата 99mTc-DARPin G3.

  1. Bragina O, Chernov V, Schulga A, Konovalova E, Garbukov E, Vorobyeva A, Orlova A, Tashireva L, Sorensen J, Zelchan R, Medvedeva A, Deyev S, Tolmachev V 2021 Phase I trial of 99mTc-(HE)3-G3, a DARPin-based probe for imaging of HER2 expression in breast cancer. J Nucl Med

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

Разработка неинвазивного подхода для прижизненного мониторинга деградации магнитных частиц в организме мышей и комплексное исследование долгосрочной судьбы магнитных частиц в зависимости от их изменяемых параметров.

Разработан магнитно-спектральный неинвазивный подход для прижизненного мониторинга циркуляции наночастиц в кровотоке и деградации магнитных частиц (МЧ) в организме экспериментальных животных. Впервые проведено комплексное исследование долговременной судьбы 17 типов частиц оксида железа в зависимости от 5 изменяемых параметров частиц. Показано замедление биотрансформации МЧ при увеличении их дозы, а также зависимость скорости деградации МЧ от их размера, внутренней структуры и типа внешнего покрытия. Разработано покрытие частиц для блокировки их элиминации системой мононуклеарных фагоцитов, что позволило продлить период полувыведения функциональных частиц из кровотока в 18 раз. Более глубокое понимание процессов биотрансформации и деградации частиц in vivo может способствовать рациональному дизайну нано- и микрочастиц с предсказуемой долгосрочной судьбой in vivo.

  1. Zelepukin IV, Yaremenko AV, Ivanov IN, Yuryev MV, Cherkasov VR, Deyev SM, Nikitin PI, Nikitin MP 2021 Long-Term Fate of Magnetic Particles in Mice: A Comprehensive Study. ACS Nano
  2. Mirkasymov AB, Zelepukin IV, Nikitin PI, Nikitin MP, Deyev SM 2021 In vivo blockade of mononuclear phagocyte system with solid nanoparticles: Efficiency and affecting factors. J Control Release 330 111–118

Лаборатория молекулярной тераностики (Мартынов В.И.)

Генетически кодируемые флуоресцентные конструкции для избирательного мечения раковых клеток

По сравнению с нормальными клетками внеклеточное пространство раковых клеток имеет пониженные показатели рН. C помощью методов генной инженерии в лаборатории были получены гибридные конструкции флуоресцентного белка (EGFP) и пептида (pHLIP), которые при понижении рН ниже 6.8 специфически связываются с мембраной клетки. Предполагается, что такие гибридные конструкции могут быть использованы при разработке новых подходов в диагностике и нацеленной терапии рака.

Отдел структурной биологии

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Арсеньев А.С.)

,  

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Андреев Д.Е.)

Выявлена важная роль цинка в работе рецептора TLR1

Толл-подобные рецепторы являются ключевыми участниками врожденного иммунитета. Несмотря на большое количество исследований и данных об этих белках, структурно-функциональные основы их работы до сих пор не до конца ясны. Было проведено комплексное исследование структуры TIR домена TLR1. Для этого пространственная структура домена была определена двумя методами - ЯМР-спектроскопии в растворе и рентгеноструктурного анализа в кристаллах. Сравнение структур выявило отличие в области, содержащей два остатка цистеина, что навело на мысль о существовании возможного взаимодействия домена рецептора с ионами цинка. Для проверки этой гипотезы была проведена серия экспериментов по изучению связывания TIR домена с ионами различных металлов, содержащихся в цитоплазме клетки. Выяснилось, что именно цинк связывается с TIR доменом специфически в наномолярных концентрациях. Кроме того, оказалось, что происходит образование двух конкурирующих комплексов TLR1/Zn. С использованем подходов на основе точечного мутагенеза белка и компьютерного моделирования удалось обнаружить ключевые остатки, участвующие во взаимодействии. Компьютерный эксперимент показал, что цинк может стабилизировать важный участок TIR домена в двух различных состояниях. Чтобы понять, насколько обнаруженное взаимодействие белка с цинком важно для работы рецептора, была изучена активность TLR1 в живых клетках. Оказалось, что изменение концентрации цинка влияет на активность TLR1, а мутация ключевого остатка цистеина приводит к полной потере активности рецептора.

  1. Lushpa VA, Goncharuk MV, Lin C, Zalevsky AO, Talyzina IA, Luginina AP, Vakhrameev DD, Shevtsov MB, Goncharuk SA, Arseniev AS, Borshchevskiy VI, Wang X, Mineev KS 2021 Modulation of Toll-like receptor 1 intracellular domain structure and activity by Zn2+ ions. Commun Biol 4 (1) 1003

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Арсеньев А.С.)

Впервые показано прямое взаимодействие между рецепторами нейротрофинов TrkA и P75

Нейротрофины и их рецепторы участвуют в большом количестве жизненно важных процессов в нейронах. Каскады запускаемых ими реакций влияют на пролиферацию, дифференциацию, нейропластичность, программируемую смерть клетки и др. Такое большое разнообразие биологических ответов сложно объяснить наличием всего 4 рецепторов и 4 лигандов. Предполагается, что широкий спектр событий может объясняться за счет взаимодействия рецепторов нейротрофинов между собой. В рамках работы по изучению нейротрофиновых рецепторов TrkA и P75 было обнаружено взаимодействие между трансмембранными доменами этих белков и описаны интерфейсы гетеродимеризации. Кроме того, было показано, что константы гомо- и гетеродимеризации рецепторов сравнимы между собой, что говорит в пользу гипотезы о прямом взаимодействии рецепторов в клетке.

  1. Franco ML, Nadezhdin KD, Light TP, Goncharuk SA, Soler-Lopez A, Ahmed F, Mineev KS, Hristova K, Arseniev AS, Vilar M 2021 Interaction between the transmembrane domains of neurotrophin receptors p75 and TrkA mediates their reciprocal activation. J Biol Chem 297 (2) 100926

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Арсеньев А.С.)

,  

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

Описан молекулярный механизм действия D3 пептидов в процессе разрушения β-амилоидных олигомеров

Болезнь Альцгеймера - самый распространенный в мире вид нейродегенеративного заболевания. В патогенезе болезни задействованы различные пептиды и белки, в том числе бета-амилоидный пептид (Aβ). Известно, что все изоформы Aβ склонны к ассоциации, и именно олигомеры играют решающую роль в патогенезе болезни Альцгеймера, оказывая токсическое действие на нейроны и их органеллы. Немецкими учеными был создан D-энантиомерный пептид D3, который участвует в разрушении цитотоксических малых олигомеров Aβ. В рамках работы по изучению этого белка было показано, что D3, стабилизирующий мономерный Aβ, динамически взаимодействует с прилегающей к мембране областью мембранного белка предшественника β-амилоида— трансмембранного фрагмента APP672-726 (Aβ1-55). На основе данных ЯМР и молекулярного моделирования было показано, что D3 нацелен на амилоидогенную область Aβ, тем самым ингибируя ранние стадии перехода пептида Aβ в β-конформацию, характерную для малых токсичных олигомеров. Было обнаружено, что D3 и Aβ1-55, являясь неупорядоченными белками, при взаимодействии образуют подвижный, но устойчивый комплекс, в котором конформации обоих полипептидов постоянно изменяются с изменением паттерна межмолекулярных контактов. Такие динамические межмолекулярные взаимодействия D3 пептидов лежат в основе их молекулярного механизма разрушения цитотоксических β-амилоидных олигомеров, а именно подавления контактов между Aβ пептидами и сохранения их в α-спиральной конформации, что предотвращает их переход в β-тяжи.

  1. Bocharov EV, Gremer L, Urban AS, Okhrimenko IS, Volynsky PE, Nadezhdin KD, Bocharova OV, Kornilov DA, Zagryadskaya YA, Kamynina AV, Kuzmichev PK, Kutzsche J, Bolakhrif N, Müller-Schiffmann A, Dencher NA, Arseniev AS, Efremov RG, Gordeliy VI, Willbold D 2021 All-d-Enantiomeric Peptide D3 Designed for Alzheimer’s Disease Treatment Dynamically Interacts with Membrane-Bound Amyloid-β Precursors. J Med Chem
  2. Urban AS, Pavlov KV, Kamynina AV, Okhrimenko IS, Arseniev AS, Bocharov EV 2021 Structural Studies Providing Insights into Production and Conformational Behavior of Amyloid-β Peptide Associated with Alzheimer's Disease Development. Molecules 26 (10)

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Арсеньев А.С.)

ЯМР-спектроскопия в реальном времени — методика исследования сайтов фосфорелирования Тау-белка в норме и патологии

При исследовании белков, как правило, основной интерес представляют «hotspots» - их функционально-активные участки, которые ответственны за ключевые процессы в каскаде биологических реакций. Метод ЯМР-спектроскопии позволяет на атомном уровне взглянуть на эти процессы, однако, классические подходы неизменно включают стадию полного отнесения сигналов белка, что ресурсозатратно как в плане приборного, так и рабочего времени. Это зачастую является «узким местом» в драг-дизайн и существенным сдерживающим фактором для выполнения проекта в кратчайшие сроки. Разработанная методика FOSY (FOcused SpectroscopY) позволяет преодолеть данные ограничения, проводя отнесение сигналов интересующего участка в течение нескольких часов без последующего трудозатратного анализа полученных спектров. Апробация данного подхода была успешно проведена на Тау-белке (441 а.о.), для которого ранее не удавалось получить полного и достоверного отнесения сигналов, необходимого для обнаружения его функционально-активных сайтов посттрансляционных модификаций. Применения методики FOSY позволило достоверно определить два ключевых сайта фосфорилирования. А как известно, избыточное фосфорилирование Тау-белка при болезни Альцгеймера и Паркинсона приводит к образованию нейрофибриллярных клубков и патологиям стабилизации аксональных микротрубочек.

  1. Lesovoy DM, Georgoulia PS, Diercks T, Matečko-Burmann I, Burmann BM, Bocharov EV, Bermel W, Orekhov VY 2021 Unambiguous tracking of protein phosphorylation by fast high-resolution FOSY NMR. Angew Chem Int Ed Engl

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

Структурный механизм тепловой активации ионного канала TRPV3

Ионный канал TRPV3 — один из представителей ванилоидного подсемейства термочувствительных каналов TRP (термо-TRP), экспрессирующийся преимущественно в клетках кожи (кератиноцитах). TRPV3 участвует в работе систем организма ответственных за кожную чувствительность, включая чувствительность к повышенным температурам (>31-39° C) и зуду, ноцицепцию (болевую чувствительность), поддержание кожного барьера, заживление ран, рост волос, эмбриональное развитие. Коллегами из Колумбийского университета (США) методом криоэлектронной микроскопии получены атомарные структуры белка в трех состояниях: закрытом, сенситизированном (переходном) и, впервые, - открытом при помощи температуры. На основании структурных данных был предложен механизм термоактивации канала, который сопровождается т.н. «конформационной волной» перестроек полипептидной цепи белка и его липидного окружения. Моделирование молекулярной динамики (МД) позволило охарактеризовать проводимость ионов и молекул воды через пору TRPV3 в различных состояниях и проследить за динамикой ключевого липида в т.н. «ванилоидном кармане». Эти липиды, по-видимому, играют роль своеобразных «плавких предохранителей», регулирующих перестройки белка в ответ на изменение температуры.

  1. Nadezhdin KD, Neuberger A, Trofimov YA, Krylov NA, Sinica V, Kupko N, Vlachova V, Zakharian E, Efremov RG, Sobolevsky AI 2021 Structural mechanism of heat-induced opening of a temperature-sensitive TRP channel. Nat Struct Mol Biol 28 (7) 564–572

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул (Феофанов А.В.)

,  

Отдел биоинженерии (Кирпичников М.П.)

Реорганизация структуры нуклеосом поли(АДФрибоза)полимеразой 1 (PARP1)

В сотрудничестве с учеными из Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, Монреальского университета (Канада), Центрального научно-исследовательского института лекарственных средств (Индия) и Онкологического центра Фокс Чейз (США).

PARP1 - это фермент, участвующий в репарации ДНК, организации хроматина и транскрипции. С помощью микроскопии spFRET, молекулярной динамики и биохимических подходов было идентифицировано несколько различных комплексов PARP 1-нуклеосома и два типа связывания PARP1 с нуклеосомами.
Было обнаружено, что две или три молекулы PARP1 связываются с нуклеосомой в зависимости от наличия линкерной ДНК и индуцируют реорганизацию всей нуклеосомы не зависимо от каталитической активности PARP1.
Полученные данные свидетельствуют, что PARP 1 может индуцировать образование альтернативного состояния нуклеосомы, которое, вероятно, участвует в регуляции генов и репарации ДНК.

  1. Maluchenko NV, Nilov DK, Pushkarev SV, Kotova EY, Gerasimova NS, Kirpichnikov MP, Langelier MF, Pascal JM, Akhtar MS, Feofanov AV, Studitsky VM 2021 Mechanisms of nucleosome reorganization by PARP1. Int J Mol Sci 22 (22)
  2. Maluchenko NV, Feofanov AV, Studitsky VM 2021 PARP-1-Associated Pathological Processes: Inhibition by Natural Polyphenols. Int J Mol Sci 22 (21)
  3. Sultanov DC, Gerasimova NS, Kudryashova KS, Maluchenko NV, Kotova EY, Langelier MF, Pascal JM, Kirpichnikov MP, Feofanov AV, Studitsky VM 2017 Unfolding of core nucleosomes by PARP-1 revealed by spFRET microscopy. AIMS Genet 4 (1) 21–31

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

Наблюдение олигомеризации антимикробного пептида Вискотоксина А3 в мицеллах детергентов позволило предложить механизм формирования ионных каналов и лизиса мембраны

С помощью спектроскопии ЯМР была исследована структура вискотоксина А3 (VtA3) в мембраномоделирующих средах — мицеллах детергентов. Вискотоксин А3 относится с семейству тионинов — небольших (∼5 кДа) катионных пептидов, участвующих в процессах иммунного ответа у растений. Этот пептид выделен из полупаразитического растения омелы белой (Viscum album), являющейся традиционным рождественским украшением в Англии. Для VtA3 показана антимикробная и цитотоксическая активность против раковых клеток, а также способность связываться с мембранами, содержащими анионные липиды, и формировать ионные каналы. Пространственная структура VtA3, включающая спиральную шпильку и короткий β-лист, была стабильной и не претерпевала значительных изменений при связывании с мицеллой. Молекула VtA3 с высокой афинностью связывалась с поверхностью мицеллы цвиттерионного додецилфосфохолина (DPC) гидрофобным участком в спиральной шпильке. Олигомеризация VtA3 наблюдалась в анионных мицеллах додецилсульфата натрия (SDS). Прямых контактов между молекулами пептидов не наблюдалось, однако, полученные данные позволили предположить, что мембранная активность VtA3, в зависимости от концентрации, соответствует модели «тороидальной поры», либо «ковровому» механизму. Предложена модель комплекса, разрушающего мембрану, объясняющая образование ионных каналов в частично анионных мембранах.

  1. Paramonov AS, Lyukmanova EN, Tonevitsky AG, Arseniev AS, Shenkarev ZO 2021 Spatial structure and oligomerization of viscotoxin A3 in detergent micelles: Implication for mechanisms of ion channel formation and membrane lysis. Biochem Biophys Res Commun 585 22–28

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

Предсказана специфичность к модификациям гистонов белка PHF10 — субъединицы хроматин-ремоделирующего комплекса PBAF

В то время как наследственность в целом определяется последовательностью нуклеотидов в ДНК, конкретная реализация генетической информации в каждом типе клеток и в каждой отдельно взятой клетке — результат действия сложнейших эпигенетических механизмов, основанных на управлении экспрессией генов в зависимости от контекста, создаваемого на данном участке ДНК хроматином. Один из эпигенетических механизмов — система химической модификации гистонов, «помечающая» хроматин как активный или неактивный, с множеством нюансов, до конца еще не понятых исследователями. Обработкой и ремоделированием хроматина занимаются сложные белковые комплексы, отдельные субъединицы которых служат «системой наведения», распознающей те или иные типы хроматиновых модификаций. В этой работе, выполненной в кооперации с Институтом биологии гена, построена пространственная модель одной из таких «наводящих» субъединиц — белка PHF10 из комплекса PBAF; и проведен подробный структурный анализ «карманов», за счет которых он распознает модификации гистонов H3 и H4.

  1. Chugunov AO, Potapova NA, Klimenko NS, Tatarskiy VV, Georgieva SG, Soshnikova NV 2021 Conserved structure and evolution of dpf domain of phf10—the specific subunit of pbaf chromatin remodeling complex. Int J Mol Sci 22 (20)

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

,  

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

Лантибиотики низин, эпидермин и галлидермин единообразно распознают липид II

Низин — один из самых интересных антимикробных пептидов (АМП), избирательно действующий на молекулу липида II в мембране бактерий, тормозя синтез клеточной стенки и напрямую уничтожая мембрану. Хотя сам по себе он не может быть лекарством (из-за плохой фармакокинетики и давнего применения в качестве консерванта), механизм распознавания этим АМП своей мишени называют перспективным для разработки новых антибиотиков, не подверженных быстрому появлению резистентности у микроорганизмов. В предшествующем исследовании с помощью молекулярного моделирования мы расшифровали этот механизм: это система направленных в единый центр доноров водородной связи от полициклического каркаса низина, «захватывающая» пирофосфатную группировку — принципиальную структурную детерминанту липида II. В этой работе мы показали, что близкие к низину пептиды — эпидермин и галлидермин — работают примерно так же, несколько превосходя низин по связывающей способности. Также мы in silico предложили мутантный вариант низина, обладающий улучшенным связыванием с мишенью, заложив базу для теоретического дизайна новых антибиотиков с описанным механизмом действия.

  1. Panina I, Taldaev A, Efremov R, Chugunov A 2021 Molecular dynamics insight into the lipid ii recognition by type a lantibiotics: Nisin, epidermin, and gallidermin. Micromachines (Basel) 12 (10)

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

Предсказаны основные мотивы пространственной организации комплекса GroEL-PrP

Шапероны — это белки, которые ускоряют фолдинг других белков и предотвращают губительную для клетки агрегацию «неправильно» сложенных белков, помогая им принимать правильную пространственную структуру. Однако из этого правила есть исключение — полагают, что взаимодействие молекулярного шаперона GroEL с нормальной изоформой прионного белка PrPC может приводить к ее трансформации в патогенную, предрасположенную к агрегации форму PrPSc. Совмещая методы криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) и молекулярного моделирования, нам удалось впервые установить молекулярные основы взаимодействия GroEL—PrP. Известно, что в сворачивании белка-субстрата участвуют C-концевые фрагменты субъединиц GroEL, о которых, ввиду их неупорядоченной организации, очень мало структурной информации. Перед началом изучения механизма сворачивания белков в полости GroEL, мы получили с помощью крио-ЭМ 3D структуру апо-формы GroEL, дополнив ее теоретическими расчетами относительно положения С-концевых фрагментов. Далее, мы показали, что PrP асимметрично связывается с несколькими субъединицами GroEL на уровне их апикальных доменов. Согласно моделированию, любой из двух доменов PrP потенциально может формировать контакты с GroEL, однако неупорядоченный N-домен PrP образует энергетически более выгодный комплекс с GroEL, чем его C-домен. Интересно отметить, что при погружении в полость GroEL структурированного С-домена PrP, он частично терял свою вторичную структуру в ходе моделирования МД, тогда как неупорядоченный N-домен, напротив, содержал большее количество элементов вторичной структуры, по сравнению с N-доменом в воде.

  1. Mamchur AA, Moiseenko AV, Panina IS, Yaroshevich IA, Kudryavtseva SS, Pichkur EB, Sokolova OS, Muronetz VI, Stanishneva-Konovalova TB 2021 Structural and Computational Study of the GroEL–Prion Protein Complex. Biomedicines 9 (11)
  2. Panina IS, Mamchur AA, Yaroshevich IA, Zlenko DV, Pichkur EB, Kudryavtseva SS, Muronetz VI, Sokolova OS, Stanishneva-Konovalova TB 2021 Study of GroEL Conformational Mobility by Cryo-Electron Microscopy and Molecular Dynamics. Cryst. Rep 66 (5) 846–853

Отдел геномики и постгеномных технологий

Лаборатория структуры и функций генов человека (Чернов И.П.)

Регулятор эмбриогенеза поджелудочной железы PDX1 увеличивает адгезию и снижает подвижность раковых клеток

Возможным способом подавления миграции опухолевых клеток может быть усиление адгезии между опухолевыми и стромальными клетками в первичных солидных опухолях. Ранее мы обнаружили, что эктопическая экспрессия эмбрионального регулятора поджелудочной железы PDX1 снижает in vitro и in vivo потенциал миграции раковых клеток поджелудочной железы. В новом исследование мы показали, что это происходит за счет увеличения их адгезивности и снижения чувствительности к TGFβ1-индуцированному эпителиально-мезенхимальному переходу. Был проведен транскриптомный анализ клеток двух линий рака поджелудочной железы PANC1 и Colo357 с эктопической экспрессией гена PDX1. Используя РНК-секвенирование (RNA-seq) мы впервые описали транскриптомный профиль линии Colo357. Были выявлены дифференциально экспрессирующиеся гены и функциональные категории генов в клетках линий рака поджелудочной железы при эктопической экспрессии гена PDX1. Анализ генов с пониженным уровнем экспрессии показал обогащение категориями генов, связанными с клеточной подвижностью, адгезией, мезенхимальной дифференцировкой, сигналингами от рецепторов на поверхности клеток. Гены с увеличенным уровнем экспрессии, были обнаружены в генных категориях, связанных с регуляцией транскрипции и клеточного цикла. Данные транскриптомного анализа подтвердили обнаруженный in vitro и in vivo эффект эктопической экспрессии гена PDX1 в клетках линий PANC1 и Colo357. Результаты анализа направленной и ненаправленной миграции клеток и результаты, полученные на организменной модели метастазирования (на эмбрионах Danio rerio), показали снижение миграционного потенциала клеток PANC1 и Colo357, экспрессирующих ген PDX1. Нами было продемонстрировано увеличение адгезивности раковых клеток, экспрессирующих PDX1, к белкам внеклеточного матрикса коллагену I типа и фибронектину, а также к полилизину, и показано, что эктопическая экспрессия PDX1 также снижает чувствительность клеток к TGFβ1.

Полученные результаты дают дополнительные аргументы PDX1 как потенциальному антиметастатическому агенту.

  1. Kondratyeva L, Chernov I, Kopantzev E, Didych D, Kuzmich A, Alekseenko I, Kostrov S, Sverdlov E 2021 Pancreatic Lineage Specifier PDX1 Increases Adhesion and Decreases Motility of Cancer Cells. Cancers (Basel) 13 (17)
  2. Kondratyeva LG, Safina DR, Chernov IP, Kopantzev EP, Kostrov SV, Sverdlov ED 2019 PDX1, a key factor in pancreatic embryogenesis, can exhibit antimetastatic activity in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Manag Res 11 7077–7087

Лаборатория регуляторной транскриптомики (Ажикина Т.Л.)

Малая некодирующая РНК F6 контролирует процесс перехода микобактерий в покоящееся состояние

Малая некодирующая РНК F6 присутствует в геномах всех микобактерий. На модельном объекте Mycobacterium smegmatis мы показали, что F6 контролирует процесс перехода бактерии в покоящееся состояние. Делеция F6 приводит к повышению экспрессии генов, вовлеченных в ответ на окислительный стресс, а также гена фактора ресусцитации RpfE2. Непосредственное взаимодействие F6 с мРНК гена rpfE2 подавляет синтез белка RpfE2, участвующего в гидролизе бактериальных пептидогликанов, что приводит к существенному снижению способности микобактерий переходить в состояние метаболического покоя.

  1. Grigorov A, Bychenko O, Salina EG, Skvortsova Y, Mazurova A, Skvortsov T, Kaprelyants A, Azhikina T 2021 Small RNA F6 Provides Mycobacterium smegmatis Entry into Dormancy. Int J Mol Sci 22 (21)
  2. Ostrik AA, Azhikina TL, Salina EG 2021 Small Noncoding RNAs and Their Role in the Pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis Infection. Biochemistry (Mosc) 86 (Suppl 1) S109–S119

Лаборатория регуляторной транскриптомики (Ажикина Т.Л.)

Регуляция синтеза рибосомных белков у микобактерий: аутогенный контроль гена rpsO

Впервые исследована in vivo регуляция синтеза рибосомных белков у микобактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis на примере гена rpsO, кодирующего белок S15. Доказан механизм аутогенной репрессии на уровне инициации трансляции, в основе которого лежит связывание белком S15 регуляторной области на своей мРНК, формирующей структуру типа «псевдоузел», что указывает на поразительное сходство с механизмом регуляции S15 у E. coli несмотря на значительное филогенетическое расстояние между этими организмами.

  1. Aseev LV, Koledinskaya LS, Bychenko OS, Boni IV 2021 Regulation of Ribosomal Protein Synthesis in Mycobacteria: The Autogenous Control of rpsO. Int J Mol Sci 22 (18)

Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза (Зарайский А.Г.)

Секретируемая дисульфид изомераза Ag1, утраченная предками слабо-регенерирующих позвоночных, необходима для регенерации хвоста головастиков Xenopus laevis

В отличие от холоднокровных позвоночных (рыб, амфибий и пресмыкающихся), теплокровные (птицы и млекопитающие) не способны регенерировать конечности и хвост, в случае их потери. Ранее мы выдвинули гипотезу о связи между ослаблением регенеративных способностей у теплокровных и утратой у них некоторых генов, регулирующих регенерацию у холоднокровных. В поддержку данной гипотезы было показано, что среди немногочисленных генов, утраченных теплокровными позвоночными, действительно есть гены, активирующиеся при регенерации, в частности, ген секретируемой дисульфид изомеразы Ag1. На модельном объекте - головастиках шпорцевой лягушки Xenopus laevis - мы продемонстрировали, что в хорошем соответствие с гипотезой нокдаун ag1 снижает способность к регенерации хвоста. При этом добавление рекомбинантного белка Ag1 в среду с головастиками, находящимися в рефрактерном периоде (в это время способность к регенерации хвоста исчезает по естественным причинам), индуцирует регенерацию хвоста.

  1. Ivanova AS, Tereshina MB, Araslanova KR, Martynova NY, Zaraisky AG 2021 The Secreted Protein Disulfide Isomerase Ag1 Lost by Ancestors of Poorly Regenerating Vertebrates Is Required for Xenopus laevis Tail Regeneration. Front Cell Dev Biol 9 738940

Группа геномного анализа сигнальных систем клетки (Буздин А.А.)

Создан первый экспрессионный прогностический маркер выживаемости при глиобластоме

Сотрудники Группы геномного анализа сигнальных систем клетки провели системный анализ генов, чья экспрессия связана с прогрессией злокачественного рака мозга (глиобластомы).

В результате удалось обнаружить новый высокоэффективный маркер плохого прогноза этого заболевания – уровень экспрессии некодирующей РНК CRNDE, который обратно коррелировал с выживаемостью пациентов. Мутационные маркеры, по-видимому, в значительной мере исчерпали свой потенциал, тогда как маркеры, основанные на уровне экспрессии генов, являются новой «восходящей звездой» молекулярной онкологии. В исследование включили несколько сотен экспрессионных профилей образцов глиобластомы, связанных с информацией о выживаемости пациентов, из нескольких наборов данных, собранных для пациентов из России, США, Евросоюза и Китая. Потенциальные маркеры, обнаруженные при анализе публичных баз данных, валидировали на экспериментальном материале, полученном в рамках сотрудничества с Медицинским факультетом Университета Любляны, (Словения), МФТИ, Сеченовским университетом, Институтом Онкологии (Словения), компанией Омиксвей, а также Европейской организацией исследования и лечения рака (EORTC). В результате статистической фильтрации данных, был обнаружен единственный ген, демонстрирующий высокий биомаркерный потенциал во всех исследованных наборах данных: ген некодирующей РНК CRNDE.

Результаты исследования свидетельствуют о возможности его включения в клиническую практику наряду с немногочисленными уже существующими биомаркерами глиобластомы: мутациями генов IDH1-2, метилированием промотора гена MGMT и делециями некоторых хромосомных участков.

Рисунок 1. Показатели общей выживаемости в группах пациентов с глиобластомой с низким (синий) и высоким (красный) уровнем экспрессии некодирующей РНК CRNDE в наборах данных (A) CGGA_325, (B) CGGA_693, (C) TCGA и (D) в экспериментальном наборе пациентов из Словении. Результаты указывают на экспрессию CRNDE как надежный негативный прогностический маркер выживаемости при глиобластоме (p = 0.013–0.046 для трех сравнений из четырех; тренд также сохраняется в четвертом сравнении).

  1. Sorokin M, Raevskiy M, Zottel A, Šamec N, Skoblar Vidmar M, Matjašič A, Zupan A, Mlakar J, Suntsova M, Kuzmin DV, Buzdin A, Jovčevska I 2021 Large-Scale Transcriptomics-Driven Approach Revealed Overexpression of CRNDE as a Poor Survival Prognosis Biomarker in Glioblastoma. Cancers (Basel) 13 (14)

Группа генной иммуноонкотерапии (Алексеенко И.В.)

Возможность использования транскрипционного таргетинга фибробластов опухоли при локальной противоопухолевой генной терапии

Использование селективных промоторов в составе противоопухолевых генотерапевтических препаратов способно снижать системную токсичность терапии. Клетки микроокружения опухоли, представленные в основном опухоль-ассоциированными фибробластами (ОАФ), могут выступать мишенью для противопухолевой генной терапии. Однако, малоизвестно какие промоторы могут быть использованы для контроля экспрессии терапевтических генов в ОАФ.

Мы предположили, что промоторы генов с повышенной экспрессией в ОАФ могут обеспечивать селективность экспрессии трансгена в ОАФ. Было выбран ряд ОАФ-специфичных генов. Активность экспрессии трансгенов, находящихся под контролем промоторов ОАФ-специфичных генов и конститутивных промоторов, была изучена в экспериментах in vitro на раковых и стромальных клетках человека и мыши, а также в опухолевой модели in vivo. Показано, что исследуемые промоторы не различаются по селективности экспрессии трансгена, но отличаются по силе. Показано, что экспрессия трансгена в фибробластах может быть обеспечена на высоком уровне при использовании универсальных промоторов (CMV, SV40, PCNA). Интересно, что профили активности промоторов относительно друг друга сохранялись как в клеточных линиях человека и мыши, так и в клетках опухоли. Полученные нами данные могут быть использованы для рационального дизайна противоопухолевых генотерапевтических препаратов.

  1. Alekseenko I, Kuzmich A, Kondratyeva L, Kondratieva S, Pleshkan V, Sverdlov E 2021 Step-by-Step Immune Activation for Suicide Gene Therapy Reinforcement. Int J Mol Sci 22 (17)
  2. Antonova DV, Zinovyeva MV, Kondratyeva LG, Sass AV, Alekseenko IV, Pleshkan VV 2021 Possibility for transcriptional targeting of cancer-associated fibroblasts—limitations and opportunities. Int J Mol Sci 22 (7)

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации

Лаборатория молекулярной токсинологии (Уткин Ю.Н.)

,  

Лаборатория клеточных взаимодействий (Сапожников А.М.)

,  

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

,  

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

Фосфолипазы А2 из ядов змей защищают клетки от вируса SARS-CoV-2

Фосфолипазы А2 (ФЛА2) из змеиного яда защищают клетки Vero E6 от цитопатического эффекта SARS-CoV-2. ФЛА2 показали низкую цитотоксичность по отношению к клеткам Vero E6, которая проявлялась при микромолярных концентрациях, но сильную противовирусную активность, обнаруживаемую при наномолярных концентрациях. ФЛА2 гадюки Никольского (Vipera nikolskii) проявила особенно сильный вирулицидный и противовирусный эффекты, связанные с фосфолиполитической активностью, и ингибировала слияние клеток, опосредованное взаимодействием гликопротеина S SARS-CoV-2 c ангиотензин-превращающим ферментом (АСЕ2). Более того, ФЛА2 препятствуют связыванию анти-АСЕ2 антител с ACE2 на поверхности клеток, а также рецептор-связывающего домена гликопротеина S с ACE2, что было показано методами проточной цитометрии и поверхностного плазмонного резонанса. Таким образом ФЛА2 могут предотвращать проникновение вируса в клетку, ингибируя его связывание с ACE2.

  1. Siniavin AE, Streltsova MA, Nikiforova MA, Kudryavtsev DS, Grinkina SD, Gushchin VA, Mozhaeva VA, Starkov VG, Osipov AV, Lummis SCR, Tsetlin VI, Utkin YN 2021 Snake venom phospholipase A2s exhibit strong virucidal activity against SARS-CoV-2 and inhibit the viral spike glycoprotein interaction with ACE2. Cell Mol Life Sci

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

,  

Отдел молекулярной нейроиммунной сигнализации (Цетлин В.И.)

,  

Лаборатория молекулярной токсинологии (Уткин Ю.Н.)

Новые трех-петельные нейротоксины из яда кобры Naja melanoleuca взаимодействуют с ГАМК-А и никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами

Из яда африканской кобры Naja melanoleuca выделены три новых α-нейротоксина, близкие по аминокислотным последовательностям известным нейротоксинам 1 и 2 из этого яда. Исследование их взаимодействия с ионотропыми рецепторами γ-аминомасляной кислоты (ГАМК-А) и различными подтипами никотиновых холинорецепторов (нАХР) показало, что все токсины взаимодействуют с ГАМК-А намного слабее, чем с нАХР. Анализ их взаимодействия с нАХР Torpedo californica, α7 и α9α10 подтипами рецептора человека выявил наномолярное сродство к первым двум мишеням и аффинность в диапазоне 30-100 нМ – к последнему. При этом один из выделенных токсинов (Tx-NM2) проявлял разное сродство к двум сайтам связывания на нАХР, а также проявил самое высокое сродство к нАХР α9α10 типа. Это первый описанный змеиный токсин, который демонстрирует такое высокое сродство к рецептору α9α10 человека, и поэтому представляет собой ценную основу для выяснения критических детерминант селективности α9α10 нАХР и разработки избирательных зондов для изучения этого подтипа нАХР.

  1. Son L, Kryukova E, Ziganshin R, Andreeva T, Kudryavtsev D, Kasheverov I, Tsetlin V, Utkin Y 2021 Novel Three-Finger Neurotoxins from Naja melanoleuca Cobra Venom Interact with GABAA and Nicotinic Acetylcholine Receptors. Toxins (Basel) 13 (2)

Лаборатория оксилипинов (Безуглов В.В.)

Докозагексаеноилдофамин – новый эндогенный лиганд сиротского рецептора GPR55, действующий в противовес лизофосфатидилинозиту

Впервые установлено, что докозагексаноилдофамин (DHA-DA) наряду с арахидоноилдофамином (AA-DA) является лигандом сиротского рецептора GPR55 из семейства неклассических каннабиноидных рецепторов, который активируется лизофосфатидилинозитом(LPI) и стимулирует пролиферацию раковых клеток. Активация этого рецептора ацилдофаминами, напротив, приводит к индукции апоптоза раковых клеток. С использованием панели раковых клеток и набора ингибиторов рецепторв и внутриклеточных сигнальных путей, а также с помощью измерения сигнальных молекул (Ca2+, NO, ROS )и экспрессии генов мы впервые показали что DHA-DA и AA-DA индуцируют апоптоз через сверхстимуляциюнейрональной синтазы оксида азота с последующей индукцией оксидативного стресса. При комбинированном воздействии DHA-DA и LPI, цитотоксический эффект DHA-DA оказываетсясильнее про-пролиферативного действия LPI на раковые клетки, что может иметьтерапевтическое значение.

  1. Akimov MG, Gamisonia AM, Dudina PV, Gretskaya NM, Gaydaryova AA, Kuznetsov AS, Zinchenko GN, Bezuglov VV 2021 GPR55 Receptor Activation by the N-Acyl Dopamine Family Lipids Induces Apoptosis in Cancer Cells via the Nitric Oxide Synthase (nNOS) Over-Stimulation. Int J Mol Sci 22 (2) 1–24

Отдел биоинженерии

Лаборатория инженерии белка (Долгих Д.А.)

,  

Лаборатория молекулярной биофизики (Олейников В.А.)

,  

Лаборатория биомедицинских материалов (Марквичева Е.А.)

Конъюгация рецептор-специфического варианта DR5-B цитокина TRAIL c амфифильными наночастицами на основе поли-N-винилпирролидона усиливает его цитотоксичность в опухолевых моделях in vitro

Рецептор-специфический вариант DR5-B противоопухолевого цитокина TRAIL был конъюгирован с наночастицами на основе поли-N-винилпирролидона Amph-PVP. В цитокин вводили остаток цистеина на N-конец для ковалентного связывания с наночастицами, полученными из смеси 1:1 немодифицированных и модифицированных малеимидом полимерных цепей. Цитотоксичность полученных наночастиц P-DR5-B исследовали на клеточных линиях аденокарциномы молочной железы MCF-7 и колоректальных карцином HCT116 и HT29. Было обнаружено усиление цитотоксичности TRAIL DR5-B, конъюгированного с наночастицами, по сравнению со свободным лигандом как в 2D (монослойная культура), так и в 3D (опухолевые сфероиды) моделях in vitro, причем конъюгация DR5-B с Amph-PVP-наночастицами сенсибилизировала DR5-B-резистентные опухолевые сфероиды MCF-7 и HT29. Конъюгация гидрофильных терапевтических белковых молекул на поверхности Amph-PVP-наночастиц с помощью клик-химии открывает новые возможности получения систем для направленной доставки лекарств в опухолевые клетки.

  1. Yagolovich A, Kuskov A, Kulikov P, Kurbanova L, Bagrov D, Artykov A, Gasparian M, Sizova S, Oleinikov V, Gileva A, Kirpichnikov M, Dolgikh D, Markvicheva E 2021 Amphiphilic Poly(N-vinylpyrrolidone) Nanoparticles Conjugated with DR5-Specific Antitumor Cytokine DR5-B for Targeted Delivery to Cancer Cells. Pharmaceutics 13 (9)

Лаборатория инженерии белка (Долгих Д.А.)

Нейтрализующее биспецифическое антитело к интерферону-бета и рецептору ErbB2 для таргетной терапии ErbB2-позитивных опухолей

Предложен новый формат иммуноцитокина, представляющий собой комплекс биспецифического антитела и ИФН-β для таргетной терапии ErbB2-позитивных опухолей. Биспецифическое антитело B16/Tz было получено на основе двух антител: терапевтического антитела трастузумаб против онкомаркера ErbB2 и химеризованного нейтрализующего антитела B16 к ИФН-β, несущих мутации «выступ во впадину» в Fc-фрагменте, необходимые для корректной сборки биспецифической молекулы. Выбранный формат соответствует структуре полноразмерного иммуноглобулина класса IgG1, что определяет его высокую биологическую активность, взаимодействие с системой комплемента, продолжительный период полувыведения из крови и низкую иммуногенность. Разработанная молекула обеспечивает доставку эндогенного и экзогенного ИФН-β к опухоли и обладает нейтрализующей способностью в отношении ИФН-β, что предотвращает взаимодействие цитокина с рецептором в процессе доставки и позволяет тем самым снизить частоту потенциальных побочных эффектов. Взаимодействие биспецифического антитела с ИФН-β и ErbB2 было подтверждено методом «сэндвич»-ИФА, оценена и определена ИФН-β-нейтрализующая способность на линии клеток HT29 (IC50 = 49,3 µg/ml).

1. A.A.Rybchenko et al., Biomolecules. 2021, 11, 1915. Bispecific Antibodies for IFN-β Delivery to ERbB2 (IF 4,879, Q2).

2. А.А.Панина и соавт. Рекомбинантные биспецифические антитела к рецептору ErbB2 и интерферону-β человека. Acta Naturae. 2020. Т.12, № 2(45), С. 95-104. (IF 1,84, Q3).

3. Т.К.Алиев и соавт. Патенты РФ 2 748 953 от 02.06.2021 и 2 729 391 от 06.08.2020. 4. Лицензионный договор между ИБХ РАН и ООО «ФАРМАПАРК» № 33-НИЛ/2021 от 31.03.2021 г.

  1. Panina AA, Toporova VA, Rybchenko VS, Balabashin DS, Argentova VV, Yakimov SA, Solopova ON, Aliev TK, Dolgikh DA, Sveshnikov PG, Kirpichnikov MP 2020 Development of the Bispecific Antibody in Fab-scFv Format Based on an Antibody to Human Interferon Beta-1 and Antibody to HER2 Receptor. Russ. J. Bioorganic Chem. 46 (4) 572–581
  2. Rybchenko VS, Panina AA, Aliev TK, Solopova ON, Balabashin DS, Novoseletsky VN, Dolgikh DA, Sveshnikov PG, Kirpichnikov MP 2021 Bispecific Antibodies for IFN-β Delivery to ErbB2+ Tumors. Biomolecules

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

,  

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

,  

Отдел биоинженерии (Кирпичников М.П.)

,  

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов (Козлов С.А.)

,  

Группа химии пептидов (Азев В.Н.)

Определены вторичные мишени белка человека SLURP-1

При изучении функциональной активности мутантных вариантов белка человека SLURP-1 мы выдвинули предположение, что кроме никотинового ацетилхолинового рецептора a7 типа (a7-nAChR) мишенями SLURP-1 могут выступать также и другие поверхностные рецепторы, участвующие в регуляции внутриклеточной сигнализации. Для проверки этого предположения мы использовали метод аффинной экстракции и показали, что в клетках аденокарциномы легкого A549 рекомбинантный SLURP-1 образует комплекс не только с a7-nAChR, но также с PDGFRa и EGFR. Взаимодействие SLURP-1 с этими рецепторами приводит к подавлению сигнального пути PI3K/AKT/mTOR и как следствие, к снижению пролиферацию и миграции клеток A549. Используя химерные белки с пересаженными фрагментами SLURP-1, мы показали, что петля I является основным функциональным элементом SLURP-1. Синтетический пептид, имитирующий петлю I, проявлял активность близкую к активности нативного SLURP-1 и может считаться прототипом нового противоопухолевого препарата.

  1. Bychkov ML, Shulepko MA, Shlepova OV, Kulbatskii DS, Chulina IA, Paramonov AS, Baidakova LK, Azev VN, Koshelev SG, Kirpichnikov MP, Shenkarev ZO, Lyukmanova EN 2021 SLURP-1 Controls Growth and Migration of Lung Adenocarcinoma Cells, Forming a Complex With α7-nAChR and PDGFR/EGFR Heterodimer. Front Cell Dev Biol 9 739391
  2. Shulepko MA, Bychkov ML, Shenkarev ZO, Kulbatskii DS, Makhonin AM, Paramonov AS, Chugunov AO, Kirpichnikov MP, Lyukmanova EN 2021 Biochemical basis of skin disease Mal de Meleda: SLURP-1 mutants differently affect keratinocyte proliferation and apoptosis. J Invest Dermatol 141 (9) 2229–2237

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

,  

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

,  

Отдел биоинженерии (Кирпичников М.П.)

,  

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов (Козлов С.А.)

,  

Лаборатория внесинаптической передачи (Семьянов А.В.)

Lypd6 человека - отрицательный модулятор холинергической системы мозга

Lypd6 представляет собой GPI-связанный белок из семейства Ly-6/uPAR, экспрессируемый в головном мозге. Чтобы исследовать холинергическую активность Lypd6, был получен рекомбинантный водорастворимый вариант белка человека (ws-Lypd6). Эксперименты с различными подтипами nAChR, экспрессируемыми в ооцитах Xenopus, выявили отрицательную аллостерическую модулирующую активность ws-Lypd6 в отношении a3b4- и a7-nAChR. При этом ws-Lypd6 не вызывал токи через nAChR в отсутствие ACh. Инкубация с 1 мМ ws-Lypd6 значительно подавляла вызванный холином ток через a7-nAChR в срезах гиппокампа крысы. Подобно змеиному нейротоксину a-бунгаротоксину, ws-Lypd6 подавлял долгосрочную потенциацию (LTP) в срезах гиппокампа мышей. В первичных кортикальных нейронах и нейронах гиппокампа была показана солокализация эндогенного GPI-связанного Lypd6 с a3b4- и a7-nAChR. Построена компьютерная модель взаимодействия Ws-Lypd6 с внеклеточным доменом a7-nAChR. Полученные результаты позволяют рассматривать Lypd6 как эндогенный негативный модулятор, участвующий в регуляции холинергической системы головного мозга.

  1. Kulbatskii D, Shenkarev Z, Bychkov M, Loktyushov E, Shulepko M, Koshelev S, Povarov I, Popov A, Peigneur S, Chugunov A, Kozlov S, Sharonova I, Efremov R, Skrebitsky V, Tytgat J, Kirpichnikov M, Lyukmanova E 2021 Human Three-Finger Protein Lypd6 Is a Negative Modulator of the Cholinergic System in the Brain. Front Cell Dev Biol 9 662227

Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов (Люкманова Е.Н.)

,  

Отдел биоинженерии (Кирпичников М.П.)

Трехпетельный токсин мамбалгин-2 ингибирует рост, миграцию и инвазию первичных меланом, воздействуя на рецепторы, содержащие ASIC1a

Мы показали, что закисление внеклеточной среды увеличивает пролиферацию, миграцию и инвазию клеток метастатической меланомы, полученных от пациентов, и регулирует экспрессию на клеточной поверхности протон-чувствительных каналов, содержащих субъединицы ASIC1a, α-ENaC и γ-ENaC. Рекомбинантный аналог трехпетельного токсина мамбалгина-2 отменял вызванную закислением пролиферацию, миграцию и инвазию клеток метастатической меланомы, способствовал апоптозу и подавлял экспрессию проонкогенных факторов CD44 и Frizzled 4 и фосфорилирование фактора транскрипции SNAI на поверхности раковых клеток. С помощью конфокальной микроскопии и аффинной экстракции было показано, что мамбалгин-2 взаимодействует с гетеротримерными каналами ASIC1a/α-ENaC/γ-ENaC на поверхности клеток меланомы.

  1. Bychkov ML, Kirichenko AV, Shulepko MA, Mikhaylova IN, Kirpichnikov MP, Lyukmanova EN 2021 Mambalgin-2 inhibits growth, migration, and invasion of metastatic melanoma cells by targeting the channels containing an asic1a subunit whose up-regulation correlates with poor survival prognosis. Biomedicines 9 (10)

Группа нанобиоинженерии (Некрасова О.В.)

,  

Лаборатория оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул (Феофанов А.В.)

Химерные каналы KcsA-Kv1 для изучения пептидных блокаторов: новый формат аналитической системы

Химерные каналы KcsA-Kv1, имитирующие внешний сайт связывания поровых блокаторов калиевых каналов Kv1, используются для изучения аффинности лигандов Kv1- каналов. Разработана новая аналитическая система для изучения взаимодействия KcsA-Kv1 с блокаторами, включающая:
- сферопласты клеток E.coli, экспрессирующих в плазматической мембране флуоресцентно-меченые химерные каналы TagRFP-KcsA-Kv1;
- флуоресцентные генокодируемые лиганды GFP-ChTx и GFP-AgTx2;
- метод проточной цитометрии;
- оригинальную методику анализа данных проточной цитометрии для определения констант диссоциации (Kd) комплексов лигандов с каналами.

Преимущества аналитической системы: быстрота получения и обсчета данных, возможность высокопроизводительного скрининга лигандов, возможность мультиплексного анализа нескольких каналов-мишеней. Система может быть использована для скрининга блокаторов Kv1 каналов, в том числе, в целях разработки новых лекарственных средств на основе пептидных блокаторов.

Работа выполнена совместно с Биологическим факультетом МГУ.

  1. Sharonov GV, Nekrasova OV, Kudryashova KS, Kirpichnikov MP, Feofanov AV 2021 Bioengineered System for High Throughput Screening of Kv1 Ion Channel Blockers. Bioengineering (Basel) 8 (11) 187
  2. Kudryashova KS, Nekrasova OV, Kirpichnikov MP, Feofanov AV 2021 Chimeras of KcsA and Kv1 as a bioengineering tool to study voltage-gated potassium channels and their ligands. Biochem Pharmacol 190 114646

Отдел молекулярной нейробиологии

Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов (Козлов С.А.)

Изучение роли С-концевого внутриклеточного домена на функционирование ионного канала ASIC3

Повышение концентрации протонов в синаптической щели при выбросе нейромедиаторов считается одним из возможных способов сенсибилизации постсинаптической мембраны, что в конечном итоге может приводить к развитию нейродегенеративных заболеваний или к нарушению когнитивных способностей. Одним из основных сенсоров закисления являются представители семейства кислото-чувствительных ионных каналов (ASIC). Одна из изоформ – ASIC3, которая обильно представлена на постсинаптической мембране ноцицепторов относится к перспективным мишеням для разработки терапевтических средств. Несмотря на высокую степень идентичности между ортологами ASIC3 каналов млекопитающих, имеется ряд различий, что осложняет простой перенос регистрируемых эффектов в животных тестах на эффекты, ожидаемые в клинической практике. Наиболее проблемно то, что человеческий ASIC3 канал (hASIC3), в отличие от канала крысы (rASIC3) при физиологическом значении внеклеточного рН 7.4 находится в состоянии очень слабой чувствительности к протонам. Мутагенез С-концевого внутриклеточного домена канала выявил причину аномального поведения hASIC3. Элиминирование или, в меньшей степени, блокирование этого участка hASIC3 приводит к восстановлению профиля тока (как у грызунов), регистрируемого в эксперименте whole-cell на гетерологически экспрессированных каналах, при активации мутантных каналов протонами или агонистом. Полученные результаты демонстрируют особую важность роли внутриклеточной регуляции ASIC3 каналов посредством внутриклеточного домена, которую необходимо учитывать далее в разработке тестов на животных моделях или при дизайне лекарственных препаратов.

  1. Osmakov DI, Korolkova YV, Lubova KI, Maleeva EE, Andreev YA, Kozlov SA 2021 The Role of the C-terminal Intracellular Domain in Acid-Sensing Ion Channel 3 Functioning. J Evol Biochem Physiol 57 413–423

Лаборатория внесинаптической передачи (Семьянов А.В.)

Разрушение внеклеточного матрикса мозга приводит к формированию новых синапсов, но подавляет синаптическую пластичность посредством повышения проводимости SK каналов

Роль внеклеточного матрикса головного мозга (ВКМ) в регуляции синаптической пластичности остаётся недостаточно хорошо изученной. Мы показали, что ферментативное разрушение ВКМ с помощью хондроитиназы ABC (ChABC) вызывает появление новых глутаматергических синапсов на пирамидных нейронах в области CA1 гиппокампа. При этом уменьшается как средняя амплитуда миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов, так и соотношение AMPA/NMDA токов, свидетельствуя о том, что новые синапсы являются непотенциированными. Однако несмотря на увеличение числа непотенциированных синапсов мы наблюдали снижение величины долговременной потенциации (LTP). Это происходило за счёт увеличения проводимости кальций-активируемых калиевых каналов малой проводимости (SK каналы) и снижения, таким образом, возбудимости пирамидных нейронов. Блокирование SK каналов восстанавливало возбудимость клеток и усиливало LTP выше контрольных значений. Усиление LTP подавлялось при блокировании Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK), которая участвует в перестройке цитоскелета и формировании дендритных шипиков. Таким образом, разрушение ВКМ может вызывать появление новых синапсов, что потенциально может применяться в регенеративной медицине. Однако этот процесс компенсируется снижением возбудимости постсинаптических нейронов, предотвращая перевозбуждение сети в ущерб синаптической пластичности.

  1. Dembitskaya Y, Gavrilov N, Kraev I, Doronin M, Tang Y, Li L, Semyanov A 2021 Attenuation of the extracellular matrix increases the number of synapses but suppresses synaptic plasticity through upregulation of SK channels. Cell Calcium 96 102406

Лаборатория внесинаптической передачи (Семьянов А.В.)

Пространственно-временные характеристики астроцитарной кальциевой динамики гиппокампа изменяются при сокращении потребления калорий

Были проанализированы пространственно-временные характеристики кальциевой динамики астроцитов в слое stratum radiatum области CA1 гиппокампальных срезов головного мозга молодых мышей возрастом 2–3 месяца. Животные контрольной группы потребляли пищу ad libitum. Животные из группы сокращения калорий (СК) в течение одного месяца потребляли 70% калорий от нормы контрольных животных. В результате у животных группы СК астроцитарные кальциевые события стали короче по длительности и меньше по размеру. Астроцитарные кальциевые сигналы у мышей группы СК имели более высокую амплитуду и более высокие скорости нарастания и затухания. Эти изменения можно объяснить морфологической перестройкой астроцитов, индуцированной диетой.

СК-индуцированные изменения параметров астроцитарной кальциевой динамики были частично нивелированы ингибированием щелевых контактов/гемиканалов карбеноксолоном. Эффект карбеноксолона на кальциевую активность у СК животных был неожиданным, поскольку диета уже снижает связь щелевых контактов в астроцитарном синцитии. Это может отражать блокаду гемиканалов, также чувствительных к этому препарату. Таким образом, индуцированное СК морфологическая перестройка астроцитов отвечает за изменения паттерна кальциевой активности в астроцитарной сети.

  1. Denisov P, Popov A, Brazhe A, Lazareva N, Verkhratsky A, Semyanov A 2021 Caloric restriction modifies spatiotemporal calcium dynamics in mouse hippocampal astrocytes. BIOCHIM BIOPHYS ACTA 1868 (7) 119034

Лаборатория внесинаптической передачи (Семьянов А.В.)

Дистрофия астроцитов в стареющем мозге сопровождается нарушением синаптической пластичности

Возрастные изменения в структуре и функциях астроцитов и их влияние на снижение когнитивных функций в стареющем мозге на сегодняшний день недостаточно изучены. Используя двухфотонную микроскопию в сочетании с трехмерной реконструкцией, анализом по Шоллю и анализом объемной фракции неразрешённых астроцитарных отростков, мы показали значительное снижение площади территориальных доменов астроцитов, сокращение количества и длины оптически разрешённых астроцитарных отростков, снижение объёмной доли терминальных (оптически не разрешённых) отростков, снижение числа межастроцитарных клеточных контактов в стареющем мозге мышей С57Bl6. Исследование физиологии астроцитов с помощью фиксации астроцитарных токов методом патч-кламп и визуализации кальциевых сигналов выявили снижение калиевого тока и удаления глутамата, а также пространственно-временную реорганизацию кальциевых событий в астроцитах стареющих животных. Эти изменения происходили на фоне нарушения синаптической долговременной потенциации (LTP) в CA1 гиппокампа у стареющих мышей. Наши результаты могут объяснить астроглиальные механизмы возрастного снижения обучаемости и памяти.

  1. Popov A, Brazhe A, Denisov P, Sutyagina O, Li L, Lazareva N, Verkhratsky A, Semyanov A 2021 Astrocyte dystrophy in ageing brain parallels impaired synaptic plasticity. Aging Cell 20 (3) e13334

Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии (Василевский А.А.)

,  

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем (Ефремов Р.Г.)

,  

Группа анализа структуры мембранных белков in silico (Чугунов А.О.)

Развитие скаффолд-инженерии α-гарпининов

Ранее для скаффолд-инженерии лигандов ионных каналов мы предложили использовать α-гарпининовую укладку, а метод белковой топографии — для улучшения их свойств. Теперь мы применили молекулярную динамику для анализа комплекса искусственного α-гарпинина и калиевого канала человека Kv1.3. Такой анализ позволил предложить дополнительные модификации структуры α-гарпинина и увеличить его аффинность к выбранной мишени.

  1. Tabakmakher VM, Gigolaev AM, Peigneur S, Krylov NA, Tytgat J, Chugunov AO, Vassilevski AA, Efremov RG 2021 Potassium channel blocker crafted by α-hairpinin scaffold engineering. Biophys J 120 (12) 2471–2481

Отдел молекулярной биологии и биотехнологии растений

Лаборатория молекулярной диагностики (Завриев С.К.)

АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИ СИНТЕЗИРОВАННОГО ПЕПТИДА, КОТОРЫЙ КОДИРУЕТСЯ РНК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОМ MIR156A И КОНСЕРВАТИВЕН В РАСТЕНИЯХ СЕМЕЙСТВА BRASSICACEAE

Недавние исследования показали, что в растениях первичные транскрипты некоторых генов miRNA (pri-miRNA) способны экспрессировать короткие белки (пептиды) размером от 12–15 до 30–40 а.о. Эти пептиды, названные miPEP, могут участвовать в регуляции транскрипции собственных pri-miRNA и сохраняютбиологическую активность при экзогенном введении в растения через корневую систему. Используя биоинформатический сравнительный анализ последовательностей РНК-транскриптов и геномов растений, нами ранее была обнаружена новая группа miPEP (miPEP-156a), которая кодируется первичными транскриптами pri-miR156a у нескольких десятков видов из семейства Brassicaceae. Экзогенные химически синтезированные пептиды miPEP-156a способны эффективно проникать в проростки растений через корневую систему и распространяться по растению локально и системно в листьях молодых проростков. При этом наблюдается морфологический эффект, заключающийся в ускоренном росте основного корня проростка. Параллельно наблюдается позитивный эффект на уровне экспрессии pri-miR156a. Важно, что с эффектами на морфологическом и молекулярном уровнях коррелирует способность пептида быстро проникать в ядра клеток и связываться in vitro как с хроматином, так и с ДНК. В настоящей работе была экспериментально установлена вторичная структура пептида и показано изменение этой структуры в комплексе с ДНК.

 

Рис. 1. Результаты кПЦР по измерению уровня экспрессии pri-miRNA156a в растениях семейства Brassicaceae. 1 – Брокколи (20-дневное растение, листья); 2 – брокколи (20-дневное растение, корень); 3 – проростки брокколи (4 дня) с добавлением пептида miPEP-156a (10 мкг/мл, выращивание при 20 °С); 4 – проростки брокколи (4 дня) с добавлением пептида (10 мкг/мл, выращивание при 24 °С); 5 – проростки брокколи (4 дня) на чашке Петри, контроль (вода, выращивание при 20 °С); 6 – проростки брокколи (4 дня) на чашке Петри, контроль (вода, выращивание при 24 °С); 7 – взрослые цветущие растения арабидопсиса (корни); 8 – взрослые цветущие растения арабидопсиса (листья); 9 – арабидопсис, проростки (4 дня при 20 °С) целиком (с корнями); 10 – арабидопсис, проростки (4 дня при 24 °С) целиком (с корнями); 11 –пекинская капуста (20-дневное растение, стебель); 12 – пекинская капуста (20-дневное растение, лист); 13 – пекинская капуста (20-дневное растение, корень). Для каждого из трех независимых повторов РНК выделяли из смеси пяти растительных проб. На рисунке указаны средние статистические значения в виде столбчатой диаграммы и стандартные отклонения. Статистическая значимость различий сумм значений в экспериментах 3 и 4 относительно экспериментов 5 и 6 составляла для этих двух выборок p < 0,05, согласно критерию Стьюдента (расчёт на основе программы GraphPad Prism 7.0 –ttps://graphpad_prism.software.informer.com/7.0/).

  1. Morozov SY, Ryazantsev DY, Erokhina TN 2021 Possible Functions of the Conserved Peptides Encoded by the RNA-precursors of miRNAs in Plants. Arch Proteom and Bioinform 2 (1) 1–3
  2. Erokhina TN, Ryazantsev DY, Samokhvalova LV, Mozhaev AA, Orsa AN, Zavriev SK, Morozov SY 2021 Activity of Chemically Synthesized Peptide Encoded by the miR156A Precursor and Conserved in the Brassicaceae Family Plants. Biochemistry (Mosc) 86 (5) 551–562

Лаборатория молекулярной диагностики (Завриев С.К.)

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТИМОЛА, НОВОГО ИНГИБИТОРА МИКОТОКСИГЕНЕЗА, С ДРУГИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ, И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА БИОСИНТЕЗ МИКОТОКСИНОВ У ГРИБА FUSARIUM CULMORUM

Тимол является вторичным метаболитом растений, для которого показана антифунгальная активность. Данное вещество обладает способностью разрушать клеточную стенку, а также оказывать эффект на синтез эргостерола. Кроме того, ранее было продемонстрирована способность тимола взаимодействовать и усиливать эффект соединений, ингибирующих токсигенез у плесневых грибов. Однако не вполне понятен был механизм действия тимола, в частности, эффект, оказываемый на экспрессию ключевых генов, ответственных за процессы роста и развития гриба, а также биосинтез токсинов.В настоящей работе объектом исследования стал штамм токсигенного гриба F. culmorum OR-02-37, выделенный из зерна пшеницы в Орловской области. Для оценки ингибиторного эффекта культуру гриба выращивали в жидкой среде Миро, стимулирующей токсигенез, в течение 7 суток при 25˚С. Для сравнительного анализа уровней относительной экспрессии генов тот же штамм культивировали на твердой среде Миро в течении 5 суток при аналогичных условиях. Рабочая концентрация тимола, использованная для оценки производимого эффекта, составила 50 ppm. Оценку относительной экспрессии токсиновых генов (трихотеценовый и зеараленоновый кластеры) проводили с использованием референсного гена, в качестве которого был выбран ген TEF1a. Оценку уровней накопления микотоксинов проводили методом ВЭЖХ с использованием системы Waters 1525 Breeze по методикам, описанным ранее.В результате проведённых исследований было продемонстрировано, что обработка тимолом не стимулирует экспрессию соответствующих генов, и, как следствие, не повышает накопление микотоксинов. И для ДОН, и для ЗЕН было выявлено некоторое понижение их уровней накопления в жидкой среде (снижение 10-25 %). Кроме того, показано снижение уровней относительной экспрессии ключевого гена трихотеценового биосинтеза (TRI5) и генов PKS4 и PKS13, связанных с синтезом зеараленона.

 

Рис. 1. Эффект, оказываемый тимолом в рабочей концентрации 50 ppm, на экспрессию генов трихотеценового кластера у F. culmorum OR-02-37: (А) – в жидкой среде, (Б) – на твердой среде. NT – необработанные образцы, T – обработанные тимолом.

 

  1. Shcherbakova L, Mikityuk O, Arslanova L, Stakheev A, Erokhin D, Zavriev S, Dzhavakhiya V 2021 Studying the Ability of Thymol to Improve Fungicidal Effects of Tebuconazole and Difenoconazole Against Some Plant Pathogenic Fungi in Seed or Foliar Treatments. Front Microbiol 12 629429

Лаборатория молекулярной биоинженерии (Мирошников К.А.)

Биологическая защита картофеля от мягкой гнили с помощью бактериофагов Bacteriophages for bioprotection of potato against soft rot

Для профилактики и лечения поражений семенного и товарного картофеля мягкогнилостными бактериями Pectobacterium и Dickeya sp. были созданы методы видовой ПЦР-диагностики патогенов и коллекция охарактеризованных специфических бактериофагов. Эксперименты по обработке посевного материала и клубней в хранилище показали эффективность биозащиты.

  1. Bugaeva EN, Voronina MV, Vasiliev DM, Lukianova AA, Landyshev NN, Ignatov AN, Miroshnikov KA 2021 Use of a specific phage cocktail for soft rot control on ware potatoes: A case study. Viruses 13 (6)
  2. Lukianova AA, Evseev PV, Stakheev AA, Kotova IB, Zavriev SK, Ignatov AN, Miroshnikov KA 2021 Development of qPCR Detection Assay for Potato Pathogen Pectobacterium atrosepticum Based on a Unique Target Sequence. Plants (Basel) 10 (2) 1–13
  3. Miroshnikov KA, Evseev PV, Lukianova AA, Ignatov AN 2021 Tailed lytic bacteriophages of soft rot pectobacteriaceae. Microorganisms 9 (9)
  4. Lukianova AA, Evseev PV, Stakheev AA, Kotova IB, Zavriev SK, Ignatov AN, Miroshnikov KA 2021 Quantitative Real-Time PCR Assay for the Detection of Pectobacterium parmentieri, a Causal Agent of Potato Soft Rot. Plants (Basel) 10 (9)

Лаборатория функциональной геномики и протеомики растений (Тальянский М.Э.)

,  

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Андреев Д.Е.)

Комплексное исследование эволюции пептидов растений и роли полипептидных молекул в ответе на биотический стресс

Микробелки, кодируемые короткими рамками считывания, расположенными на длинных некодирующих РНК, традиционно остаются недооцененной частью протеома клетки. Мы провели исчерпывающий поиск транскриптов, кодирующих такие микробелки у мха P. patens, классифицировали, исследовали их консервативность и проследили эволюционные траектории в транскриптомах 479 видов растений. Для части выявленных микробелков была показана трансляция и для отдельных микробелков подтверждена биологическая активность. Отдельный интерес представляет эволюция пептидных семейств, регулирующих иммунный ответ. Мы исследовали разнообразие малых секретируемых пептидов у бриофитов и показали, что многие семейства таких пептидов общие у покрытосеменных и наиболее древних наземных растений, а отдельные пептиды цветковых растений индуцируют сходные физиологические реакции у бриофитов. Ещё одной линией защиты растения от патогенов является протеом. Мы выявили, что высокая устойчивость картофеля сорта Гала к заражению Yвирусом картофеля связана с активностью метионинового цикла и накоплением в растении отдельных его метаболитов. Таким образом, мы провели масштабное исследование эволюции микробелков и пептидов у растений и исследовали роль протеома и пептидома в ответе на биотический стресс.

  1. Fesenko I, Shabalina SA, Mamaeva A, Knyazev A, Glushkevich A, Lyapina I, Ziganshin R, Kovalchuk S, Kharlampieva D, Lazarev V, Taliansky M, Koonin EV 2021 A vast pool of lineage-specific microproteins encoded by long non-coding RNAs in plants. Nucleic Acids Res
  2. Spechenkova N, Fesenko IA, Mamaeva A, Suprunova TP, Kalinina NO, Love AJ, Taliansky M 2021 The Resistance Responses of Potato Plants to Potato Virus Y Are Associated with an Increased Cellular Methionine Content and an Altered SAM:SAH Methylation Index. Viruses 13 (6)
  3. Lyapina I, Filippova A, Kovalchuk S, Ziganshin R, Mamaeva A, Lazarev V, Latsis I, Mikhalchik E, Panasenko O, Ivanov O, Ivanov V, Fesenko I 2021 Possible role of small secreted peptides (SSPs) in immune signaling in bryophytes. Plant Mol Biol 106 (1-2) 123–143

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений (Долгов С.В.)

Регуляция сроков колошения пшеницы методами геномного редактирования

Мирошниченко Дмитрий Николаевич Тимербаев Вадим Рафаилович, Клементьева Анна Александровна, Сидорова Татьяна Николаевна, Пушин Александр Сергеевич, Долгов Сергей ВладимировичC помощью технологии CRISPR/Cas9 впервые в России отредактирован геном мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) — главной зерновой культуры нашей страны. Целью геномного редактирования являлось получение новых нуклеотидных изменений в консервативной промоторной области гена яровизации VRN-A1, играющего важную роль в регуляции колошения у сортов яровой и озимой пшеницы. Наличие мутаций в этой области изменяет функциональную активность гена и ускоряет время колошения. Для получения растений с отредактированным геном применили ряд экспериментальных разработок: биоинформатический подбор различных гидовых РНК и тестирование их способности создавать разрывы ДНК in vitro в целевых участках, конструирования ряда экспрессиионных векторов, которые методом биобаллистики доставляли в клетки пшеницы и получили растения, содержащие различные изменения в целевой последовательности, включающие единичные нуклеотидные вставки или делеции, делеции из четырех или восьми нуклеотидов. Анализ последующего семенного поколения подтвердил успешное наследование новых мутантных вариантов VRN-А1. Показана возможность получения линий пшеницы, свободных от последовательностей «инструментов» геномного редактирования, а также выявлено изменение срока колошения у гомозиготной линии содержащей 8-ми нуклеотидную делецию в промоторной области VRN-А1 в сравнении с исходным сортом. Работа выполнена в сотрудничестве и при финансовой поддержке КГЦ-ВНИИСБ, Москва https://minobrnauki.gov.ru/press-center/news/?ELEMENT_ID=31804

Лаборатория экспрессионных систем и модификации генома растений (Долгов С.В.)

Низкий транспорт siRNA от вирусоустойчивого трансгенного подвоя в нетрансгенный привой не обеспечивает устойчивость к PPV у деревьев сливы

Сидорова Татьяна Николаевна, Мирошниченко Дмитрий Николаевич Пушин Александр Сергеевич, Долгов Сергей Владимирович

У деревьев косточковых плодовых культур устойчивость к вирусу оспы сливы (PPV) можно достигнуть за счет специфической деградации вирусной РНК с помощью механизма РНК-интерференции (RNAi) благодаря экспрессии шпилечной конструкции, специфичной для белка оболочки PPV. При этом накопление siRNA в трансгенном растении сливы достигает более 2 % (от общего числа малых РНК) и обеспечивает многолетнюю невосприимчивость к вирусу. Биобезопасность трансгенных растений, однако, вызывает опасения из-за вставки чужеродных последовательностей. Плодовые деревья представляют собой комбинацию привоя (верх) и подвоя (низ), поэтому прививка коммерческих сортов на трансгенные вирусоустойчивые подвои (трансграфтинг) рассматривалась как возможный подход к смягчению проблем биобезопасности, однако эффективность этого способа требует экспериментального подтверждения . Нами были созданы различные варианты композитных деревьев, при этом повышенный уровень siRNA в трансгенных тканях обеспечивал устойчивость к PPV и блокировал перемещение вируса через ГМ-ткани в нетрансгенные ткани при инокуляции трансгенных тканей. Несмотря на передвижение большого числа малых РНК из подвоя в привой, транспорт siRNAs необходимых для инактивации PPV оказался низким (только 0.005% пула малых РНК). Поэтому при заражении нетрансгенных тканей (привитых на вирусоустойчивый трансгенный подвой), они по-прежнему оставались восприимчивыми к вирусной инфекции.

  1. Sidorova T, Miroshnichenko D, Kirov I, Pushin A, Dolgov S 2021 Effect of Grafting on Viral Resistance of Non-transgenic Plum Scion Combined With Transgenic PPV-Resistant Rootstock. Front Plant Sci 12 621954

Отдел химической биологии гликанов и липидов

Лаборатория углеводов (Бовин Н.В.)

S-белок SARS-CoV-2 узнает гликаны-лиганды галектинов

В составе S-белка всех SARS-вирусов имеется т.н. галектиновый фолд, то есть участок высокой гомологии с семейством гликан-связывающих белков семейства галектинов (Рис. 1). Однако, гликан-связывающей активности этого участка до появления SARS-CoV-2 никто не видел. С помощью гликанового эррея (>200 гликанов) мы изучили углевод-узнающую активность S-белка SARS-CoV-2 и обнаружили, что из нескольких позитивных гликанов максимальное связывание показывают именно те, которые являются классическими лигандами галектинов (Таблица, лиганды галектинов даны на сером фоне) (работа проведена совместно с НПО Вектор). Далее, работая уже с цельными вирионами и значительно расширив репертуар гликанов, мы подтвердили узнавание типичных галектиновых лигандов (работа проведена совместно с Институтом гриппа, С.-Пб.). Таким образом, коронавирус имеет потенциальный дополнительный рецептор, углеводной природы. Отметим, что нейраминидаза вируса гриппа, отщепляя от гликанов клетки сиаловую кислоту, тем самым создает очень высокую плотность именно тех структур, которые узнаются коронавирусом SARS-CoV-2

  1. Ryzhikov AB, Onkhonova GS, Imatdinov IR, Gavrilova EV, Maksyutov RA, Gordeeva EA, Pazynina GV, Ryzhov IM, Shilova NV, Bovin NV 2021 Recombinant SARS-CoV-2 S Protein Binds to Glycans of the Lactosamine Family in vitro. Biochemistry (Mosc) 86 (3) 243–247

Лаборатория углеводов (Бовин Н.В.)

Антитела переболевших ковидом-19 связываются со стволовым участком S-белка

Были синтезированы 8 пептидов S-белка SARS-CoV-2, предсказанные как наиболее антигенные и не экранированные углеводными цепями; они оказались равномерно разбросанными по поверхности белка. Далее было изучено связывание с ними антител лиц, переболевших ковидом-19; оказалось, что единственный «диагностический» эпитоп (т.е. 90% дискриминирующий переболевших от наивных доноров), начинающийся а.к. 1147, расположен в стволовой части белка, то есть очень близко к мембране вириона (см. рисунок 1). Принципиально важной оказалась презентация пептида 1147. Если пептид просто иммобилизован на поверхности, он теряет диагностическую аккуратность. Но в липидированном виде (см. рисунок 2), встроенный в мембрану эритроцит или в искусственную мембрану, приобретает способность выявлять специфические для заболевания антитела. По-видимому, в упорядоченном слое пептид 1147 приобретает спиральную конформацию, близкую к той, что характерна для стволовой части белка.

  1. Ryzhov IM, Tuzikov AB, Nizovtsev AV, Baidakova LK, Galanina OE, Shilova NV, Ziganshina MM, Dolgushina NV, Bayramova GR, Sukhikh GT, Williams EC, Nagappan R, Henry SM, Bovin NV 2021 SARS-CoV-2 Peptide Bioconjugates Designed for Antibody Diagnostics. Bioconjug Chem
  2. Nagappan R, Flegel WA, Srivastava K, Williams EC, Ryzhov I, Tuzikov A, Galanina O, Shilova N, Sukhikh G, Perry H, Bovin NV, Henry SM 2021 COVID‐19 antibody screening with SARS‐CoV‐2 red cell kodecytes using routine serologic diagnostic platforms. Transfusion 61 (4) 1171–1180

Лаборатория химии липидов (Водовозова Е.Л.)

Фосфатидилинозит стабилизирует жидкофазные противоопухолевые липосомы, нагруженные пролекарством мелфалана

Взаимодействия сывороточного альбумина с жидкофазными противоопухолевыми липосомами, несущими в мембране диолеоилглицеридный конъюгат мелфалана (Mlph-DG), исследованы методом ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье. Показано, что фосфатидилинозит защищает мембрану липосом от проникновения белка. Высвобождение пролекарства Mlph-DG из липосом изучено с помощью метода фракционирования частиц в асимметричных потоках (AF4) — в системе, моделирующей взаимодействия с липопротеинами плазмы. Установлена высокая стабильность липосом. Предполагается, что фосфатидилинозит защищает липидный бислой за счет образования «компенсаторной» пары между объемистым отрицательно заряженным остатком мио-инозита и небольшим положительно заряженным остатком лекарства в молекуле Mlph-DG.

  1. Onishchenko N, Tretiakova D, Vodovozova E 2021 Spotlight on the Protein Corona of Liposomes. Acta Biomater
  2. Tretiakova DS, Le-Deygen I, Kudryashova E, Vodovozova EL 2021 Serum albumin penetration in the fluid lipid bilayer of liposomes loaded with a melphalan lipophilic prodrug can be prevented by inclusion of phosphatidylinositol or ganglioside GM1. FEBS Open Bio 11 (Suppl. 1) 2021, 256 11 256
  3. Tretiakova D, Le-Deigen I, Onishchenko N, Kuntsche J, Kudryashova E, Vodovozova E 2021 Phosphatidylinositol stabilizes fluid-phase liposomes loaded with a melphalan lipophilic prodrug. Pharmaceutics 13 (4)

Отдел биомолекулярной химии

Отдел биомолекулярной химии (Ямпольский И.В.)

,  

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Арсеньев А.С.)

,  

Лаборатория биоинформационных методов комбинаторной химии и биологии (Андреев Д.Е.)

Предложен механизм фотоинактивации целентеразина — хромофора фотопротеина гребневика Beroe abyssicola

Сотрудниками ИБХ РАН совместно с коллегами из Лаборатории фотобиологии Института биофизики (ИБФ СО РАН, г. Красноярск) впервые были выделены продукты фотоинактивации 2-гидропероксицелентеразина из рекомбинантного фотопротеина Beroe abissycola — беровина. Методами ЯМР и масс-спектрометрии было показано, что продукты фотоинактивации представлены изомерными соединениями, имеющими ту же массу, что и исходный хромофор, однако сильно отличающимися по спектральным свойствам. Сотрудники Лаборатории химии метаболических путей методом встречного синтеза окончательно подтвердили структуру выделенных природных соединений — необычных продуктов деградации целентеразина гидантоиновой природы — и предложили механизм, при котором в ходе фотоинактивации происходит расщепление С-С связи в пиразиновом кольце 2-гидропероксицелентеразина. Похожий механизм расщепления был ранее обнаружен при окислении хромофоров GFP-подобных флуоресцентных белков (Ivashkin et al., 2011). Склонность беровина к фотоинактивации позволяет предполагать, что 2-гидропероксицелентеразин в белке, в отличие от гидроидных фотопротеинов, координирован в форме аниона. Результаты работы были опубликованы в журнале Organic letters.

  1. Burakova LP, Lyakhovich MS, Mineev KS, Petushkov VN, Zagitova RI, Tsarkova AS, Kovalchuk SI, Yampolsky IV, Vysotski ES, Kaskova ZM 2021 Unexpected Coelenterazine Degradation Products of Photoprotein Photoinactivation. Org Lett 23 (17) 6846–6849

Лаборатория биотехнологии растений (Захарченко Н.С.)

Трансгенные растения рапса с геном cecP1 безопасны для ассоциативных бактерий

Целью работы явилось изучение возможности колонизации трансгенных растений масличного рапса (Brassica napus L.), экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина P1 (cecP1), ассоциативными микроорганизмами Methylobacterium mesophilicum и Pseudomonas aureofaciens. Продемонстрирована устойчивость растений к фитопатогенам Erwinia carotovora B15, Pseudomonas syringae, Fusarium oxysporum и Botrytis cinerea. Анализ жирнокислотного состава семян трансгенных растений показал увеличение доли ненасыщенных жирных кислот. Растения показали повышенную фотосинтетическую активность при окислительном стрессе, вызванном паракватом, а не при окислительном стрессе и УФ-излучении по сравнению с контролем. Колонизация растений метилобактериями привела к увеличению скорости роста, образования корней и адаптации к тепличным условиям. CecP1-растения, колонизированные бактериями P. aureofaciens с устойчивостью к нафталину, смогли стабильно расти на среде, содержащей это химическое соединение. Исследование взаимодействия трансгенных растений с ассоциативными микроорганизмами показало, что бактерии локализованы во всех первоначально колонизированных растениях, а также в растениях, полученных после нескольких пассажей микропролиферации. Таким образом, трансгенные растения, содержащие ген cecP1, активно заселялись ассоциативными бактериями, что указывает на их безопасность для полезных микроорганизмов.

  1. Zakharchenko NS, Furs OV, Rukavtsova EB, Tarlachkov SV, Kosobryukhov AA, Kreslavski VD, Dyachenko OV, Buryanov YI, Shevchuk TV 2021 The Brassica napus L. plants expressing antimicrobial peptide cecropin P1 are safe for colonization by beneficial associative microorganisms. J PLANT INTERACT 16 (1) 432–442

Отдел биоматериалов и бионанотехнологий

Лаборатория молекулярной биофизики (Олейников В.А.)

Количественный масс-спектрометрический анализ в исследованиях агрегации пептидов Альцгеймера (β-амилоидов) азолоазинами, а также влияния этих пептидов на поведение α-2-макроглобулином

Предложен эффективный метод определения свободного α-2-макроглобулина (α-2-MG) в сыворотке крови человека, основанный на его реакции с трипсином, приводящей к отщеплению короткого пептида (VGFYESDVMGR). Для количественного определения содержания этого пептида был развит масс-спектрометрический метод, основанный на изотопно-меченного (18O) стандарта.

Изучено взаимодействие человеческого α-2-MG с пептидами Альцгеймера (Аβ-пептидs). Впервые обнаружен эффект блокировки отщепления пептида VGFYESDVMGR от α-2-макроглобулина в присутствии пептидов Альцгеймера и исчезновение этого эффекта в случаях модификации последних. Выявлен участок в пептидах Альцгеймера, разрыв пептидной связи в котором или его модификация приводит к потере их способности ингибировать реакцию трипсина с α-2-макроглобулином.

Обнаружено, что нитро-соединения из класса азолоазинов способны выступать в качестве регуляторов агрегации природных пептидов, склонных к самоассоциации, на примере фрагментов β-амилоидного пептида Альцгеймера. Показано, что в зависимости от типа производного азолоазина, происходит либо ассоциация пептида с образованием нерастворимой формы, либо подавление ассоциации, вплоть до растворения ранее образовавшегося ассоциата.

  1. Protasov AV, Mirgorodskaya OA, Kozmin YP, Gobom J 2021 A mass spectrometric approach to study the interaction of amyloid β peptides with human α-2-macroglobulin. Biochimie
  2. Mirgorodskaya OA, Kozmin YP, Protasov AD, Toropygin IY, Oleinikov VA 2018 Regulation of Aggregation of Self-Associated Peptides, Including N-Terminal Fragments of the Alzheimer’s β-Amyloid Peptide, by Nitro Derivatives of Azoloazine. Russ. J. Bioorganic Chem. 44 (6) 665–675

Лаборатория молекулярной биофизики (Олейников В.А.)

Развиты новые методические и инструментальные подходы, расширяющие возможности зондово-усиленной КР спектроскопии

(1) Разработана методика формирования зондов для зондово-усиленной КР спектроскопии. Решена задача получения воспроизводимых практически одинаковых, с воспроизводимыми характеристиками, механически устойчивых зондов с высокой эффективностью получения сигнала КР от молекул, локализованных вблизи вершины зонда.

(2) Решена проблема доставки электромагнитного излучения к кантилеверу сканирующего зондового микроскопа. Реализованная схема позволила существенно уменьшить расстояние между объективом и образцом, что увеличило числовую апертуру объектива. При реализации методики зондово усиленного КР это обеспечивает почти двукратное увеличение эффективности системы возбуждение/сбор вторичного излучения.

  1. Мочалов КЕ, Соловьева ДО, Ефимов АЕ, Клинов ДВ, Олейников ВА 2020 Высокоэффективные воспроизводимые зонды для спектроскопии комбинационного рассеяния с усилением на острие (TERS). Письма ЖТФ 48 (11) 1084–1087
  2. Мезин АВ, Ефимов АЕ, Соловьева ДО, Васкан ИС, Олейников ВА, Мочалов КЕ 2021 Разработка системы низкопрофильного дефлектометра комбинированных систем сканирующей зондовой и оптической микроскопии. Письма ЖТФ 47 (6) 23–25
  3. Трусов МА, Ефимов АЕ, Соловьева ДО, Васкан ИС, Олейников ВА, Мочалов КЕ 2021 Моделирование оптимальной оптической системы ввода/вывода излучения для реализации эффективного зондового усиления электромагнитного поля для случая непрозрачных образцов. Письма ЖТФ 47 (5) 42–44

Лаборатория полимеров для биологии (Генералова А.Н.)

Тетрамер анилина как структурный аналог полианилина – перспективный материал для биомедицинского применения

В работе представлены результаты исследования физико-химических свойств молекул тетраанилина с концевыми фенильными группами (ТАНИ), которые являются проводящими производными полианилина (ПАНИ) с наименьшей молекулярной массой по сравнению с ПАНИ, а также пленок на основе ТАНИ. Самоорганизованные тонкопленочные структуры ТАНИ с четко определенной морфологией получали путем переноса пленок Ленгмюра, сформированных на границе раздела вода-воздух. На примерах разделения смесей нуклеиновых кислот и белков методом спектрально-корреляционной интерферометрии было показано, что поведение ТАНИ в качестве биосепарационного материала аналогично поведению ПАНИ. ТАНИ-поверхность демонстрирует сорбционную инертность по отношению к двунитевым нуклеиновым кислотам («негативная селекция») и связывает белки в зависимости от их изоэлектрических точек и гидрофобности («позитивная селекция»). Обнаруженные свойства ТАНИ позволяют рассматривать данный материал как перспективную альтернативу ПАНИ-содержащим покрытиям для создания хроматографических материалов с контролируемыми сорбционными свойствами по отношению к макромолекулам нуклеиновых кислот и белков.

  1. Yagudaeva EY, Vikhrov AA, Malakhova Y, Iskandyarova Y, Firsova M, Prostyakova A, Korovin A, Malakhov S, Nichugovskiy A, Zubov V, Kapustin D 2021 Tetramer of aniline as a structural analog of polyaniline – Promising material for biomedical application. Synth Met 274 (2) 116712

Лаборатория биомедицинских материалов (Марквичева Е.А.)

Наночастицы на основе поли-N-винилпирролидона, загруженные ДНК- плазмидами, которые кодируют Gn and Gc гликопротеины вируса лихорадки долины Рифт : получение и изучение в модели in vivo

В Лаборатории биомедицинских материалов (рук. Марквичева Е.А.) был разработан новый подход к созданию ветеринарной вакцины, защищающей крупных домашних животных от тяжелого вирусного заболевания- лихорадки долины Рифт. В работе были получены амфифильные наночастиц на основе поливинилпирролидона (ПВП), которые были загружены ДНК плазмидами, кодирующими Gn and Gc гликопротеины вируса. ДНК-плазмиды были защищены от расщепления внеклеточными нуклеазами путем их включения в наночастицы из производных ПВП с аминокислотами β-аланин или глицин. При этом наночастицы были получены простым оригинальной методом самосборки полимерных макромолекул. Гуморальный ответ на включенные в наночастицы плазмиды был изучен in vivo. Показано усиление гуморального ответа в мышах, которые были иммунизированы наночастицами, по сравнению с ответом, полученным в животных при введении им нативных плазмид. ПВП наночастицы, загруженные плазмидами, перспективны для разработки на их основе различных инкапсулированных ДНК вакцин.

  1. Kuskov A, Selina O, Kulikov P, Imatdinov I, Balysheva V, Kryukov A, Shtilman M, Markvicheva E 2021 Amphiphilic Poly(N-Vinylpyrrolidone) Nanoparticles Loaded with DNA Plasmids Encoding Gn and Gc Glycoproteins of the Rift Valley Fever Virus: Preparation and in Vivo Evaluation. ACS Applied Bio Materials 4 (8) 6084–6092

Лаборатория иммунохимии (Бровко Ф.А.)

Функционально – активные моноклональные антитела к гемолизину II Bacillus cereus

Bacillus cereus – патогенная, грамположительная, обитающая в почве бактерия, вызывающая пищевые отравления и другие типы инфекций, является одной из наиболее распространенных причин внутрибольничных инфекций. Одним из главных факторов патогенности B. cereus является гемолизин II (HlyII) – β-пороформирующий токсин, который отличается от других β-пороформирующих токсинов наличием на С-конце молекулы аминокислотной избыточности из 94 остатков, условно обозначаемой как HlyIICTD (С-терминальный домен). Этот белок продуцируется бактерией как мономер, но в присутствие мембраны клеток инфицированного организма, мономеры токсина соединяются, встраиваются в клеточную мембрану и образуют пору, нарушая целостность клетки. Анализ панели моноклональных антител к рекомбинантному белку HlyIICTD выявил способность антитела HlyIIC-20 ингибировать гемолиз HlyII. Методами фагового дисплея и направленного мутагенеза генов природных токсинов близких штаммов определен конформационный эпитоп нейтрализующего антитела HlyIIC-20. Эпитоп локализован в N-концевой части HlyIICTD. Показано, что HlyIIC-20 связывается с HlyII в мономерной форме до начала стадии пороформирования, предотвращая олигомеризацию, необходимую для образования мембранной поры. Эффективность подавления гемолиза, вызванного различными штаммами B. cereus, была различной и зависела от аминокислотного состава эпитопа. Замены L324P и P324L в гемолизинах штаммов ATCC14579T и B771, соответственно, выявили роль лейцина, локализованного в эпитопе, в подавлении гемолиза антителом. Нейтрализующая способность антитела подтверждена экспериментами как in vitro, так и in vivo. Предварительная инкубация HlyIIC-20 с HlyII предотвращала гибель мышей вплоть до эквимолярного соотношения. Стратегия обнаружения и нейтрализации токсической активности HlyII может предоставить инструмент для мониторинга и снижения патогенности B. cereus.

  1. Rudenko NV, Nagel A, Zamyatina A, Karatovskaya AP, Salyamov VI, Andreeva-Kovalevskaya Z, Siunov A, Kolesnikov A, Shepelyakovskaya AO, Boziev KM, Melnik BS, Brovko FA, Solonin A 2020 A Monoclonal Antibody against the C-Terminal Domain of Bacillus cereus Hemolysin II Inhibits HlyII Cytolytic Activity. Toxins (Basel) 12 (12) 806

Лаборатория иммунохимии (Бровко Ф.А.)

Микробиомный анализ молока при маститной патологии коров на фермах Центральной России

Изучение микробных сообществ является современным подходом для профилактики и терапии многих заболеваний. На современном этапе широко используются комплексные омиксные технологии, позволяющие исследовать полный состав флоры и сделать предположения о связи объекта и запускаемого им процесса.

Проблема мастита крупного рогатого скота остается актуальной на сегодняшний день, как с экономической, так и с ветеринарной стороны. Целью работы было провести анализ изменений в составе микробиоты молока коров при заболевании маститом на фермах Российской Федерации.

Проведен микробиомный анализ образцов молока здоровых коров и коров с различными формами мастита. Выявлено значительное преобладание нескольких операционных таксономических единиц, соответствующих преимущественно группам Staphylococcus aureus, Aerococcus spp. и Streptococcus spp. Кроме того, S. thermophilus был идентифицирван в нескольких образцах. Показано, что в Центральной России мастит связан с большим разнообразием возбудителей. Величина эффекта линейного дискриминантного анализа подтвердила наличие нескольких индикаторных родов в хозяйствах Москвы и Тульской области. Эти результаты подтверждают сложную бактериальную этиологию мастита крупного рогатого скота на территории РФ

  1. Sokolov S, Fursova K, Shulcheva I, Nikanova D, Artyemieva O, Kolodina E, Sorokin A, Dzhelyadin T, Shchannikova M, Shepelyakovskaya A, Zinovieva N, Brovko F 2021 Comparative Analysis of Milk Microbiomes and Their Association with Bovine Mastitis in Two Farms in Central Russia. Animals (Basel) 11 (5)
  2. Fursova KK, Sokolov SL, Shchannikova MP, Nikanova DA, Artemeva OA, Kolodina EN, Sorokin AS, Dzhelyadin TR, Shulcheva IV, Shepelyakovskaya AO, Zinovieva NA, Brovko FA 2021 Changes in the Microbiome of Milk in Cows with Mastitis. Dokl Biochem Biophys 497 (1) 75–80

Группа молекулярной экологии (Трубецкая О.Е.)

Разработка подходов для получения новых наноматериалов - углеродных наноточек с высоким квантовым выходом.

В настоящее время во всем мире большое внимание уделяется исследованию недавно обнаруженным наноматериалам, называемых углеродными квантовыми точками (УТ), которые наряду с естественной биосовместимостью обладают стабильной интенсивной флуоресценцией, чувствительной к изменениям окружающей среды. Эти свойства открывают широкие перспективы использования УТ в качестве оптических сенсоров различных примесей в жидких и газовых средах, а также как тераностические нанокомплексы, действующие одновременно как люминесцентные биомаркеры и носители лекарств. Однако природа УТ, в частности их молекулярный размер и степень чистоты (т.е. доля различных нефлуоресцирующих компонентов) практически не известны. Нами впервые была разработана методика высокоэффективной эксклюзивной жидкостной хроматографии (ЭХ-ВЭЖХ) в сочетании с мультиволновыми детекторами флуоресценции и абсорбции для разделения и оценки молекулярных размеров УТ, полученных окислением нанографена, и рассчитан квантовый выход отдельных индивидуальных фракций УТ. Впервые было обнаружено, что лишь небольшая часть исходного оксида нанографена обладает флуоресценцией. Предложенный метод позволяет получать наборы УТ с характеристическими спектрами поглощения и флуоресценции и высоким квантовым выходом. Метод позволяет эффективно отделять флуоресцирующие фракции УТ от не флуоресцирующих примесей, что принципиально важно для практического использования УТ в качестве биомаркеров в медицине.

  1. Trubetskaya OE, Trubetskoj OA, Richard C, Vervald AM, Burikov SA, Marchenkov VV, Shenderova OA, Patsaeva SV, Dolenko TA 2021 High-performance size exclusion chromatography with online fluorescence and multi-wavelength absorbance detection for isolation of high-purity carbon dots fractions, free of non-fluorescent material. J Chromatogr A 1650 462251

Отдел геномики адаптивного иммунитета

Отдел геномики адаптивного иммунитета (Чудаков Д.М.)

Предикция ответа на анти-PD-L1 иммунотерапию при раке мочевого пузыря

Показано, что нормировка цитотоксической сигнатуры на степень инфильтрации опухоли иммунными клетками драматически увеличивает точность предикции ответа на анти-PD-L1 иммунотерапию.

Показано, что соотношение IgG1/IgA экспрессии в опухолевым окружении является важным и независимым прогностическим и предиктивным маркером ответа на анти-PD-L1 иммунотерапию.

Разработан предиктор ответа анти-PD-L1 иммунотерапию, позволяющий надежно идентифицировать респондеров среди пациентов с инвазивной уротелиальной карциномой, включая подгруппу с низкоинфильтрированным “desert” фенотипом опухоли.

  1. Дюгай ИА, Лукьянов ДК, Турчанинова МА, Серебровская ЕО, Брюшкова ЕА, Шугай МА, Шелякин ПВ, Чудаков ДМ 2021 Accounting for B cell behavior and sampling bias predicts anti-PD-L1 response in bladder cancer. Cancer Immunol Res

Лаборатория сравнительной и функциональной геномики (Лебедев Ю.Б.)

,  

Лаборатория методов иммуносеквенирования (Чудаков Д.М.)

Динамика формирования Т-клеток памяти при легкой форме COVID-19

Мы применили масированное секвенирование Т-клеточных рецепторов (TCR) для отслеживания изменений в репертуаре Т-клеток после двух легких случаев COVID-19. У обоих доноров мы идентифицировали клоны CD4 + и CD8 + Т-клеток с высокой клональной экспансией после заражения. Антигенная специфичность CD8 + TCR к эпитопам SARS-CoV-2 была подтверждена как связыванием с тетрамером рMHC, так и структур найденных нами TCR с TCR, присутствующих в международных базах данных SARS-CoV2-специфичных TCR. Мы описываем характерные мотивы в CDR3-последовательностях TCR T-клонов, реагирующих на COVID-19. Мы показываем, что у обоих доноров большинство инфекционно-реактивных клонотипов приобретают фенотипы памяти. Определенные клоны Т-клеток были обнаружены во фракции памяти в момент времени до заражения, что свидетельствует об участии ранее существовавших перекрестно-реактивных Т-клеток памяти в иммунном ответе на SARS-CoV-2.

  1. Minervina AA, Komech EA, Titov A, Koraichi MB, Rosati E, Mamedov IZ, Franke A, Efimov GA, Chudakov DM, Mora T, Walczak AM, Lebedev YB, Pogorelyy MV 2021 Longitudinal high-throughput TCR repertoire profiling reveals the dynamics of T-cell memory formation after mild COVID-19 infection. Elife 10 1–17

Отдел «Учебно-научный центр» (Овчинникова Т.В.)

,  

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

Исследование кателицидинов представителей клады Cetruminantia, объединяющей современных жвачных и китообразных.

Показано, что додекапептидные кателицидины являются широко распространенными антимикробными пептидами у представителей клады Cetruminantia, объединяющей современных жвачных и китообразных. Исследован додекапептид домашней козы Capra hircus, обозначенный как ChDode, и его уникальный ортолог из кашалота Physeter catodon (PcDode). Структуру пептидов изучали методами ЯМР-, КД- и ИК-Фурье спектроскопии. Установлено, что PcDode принимает структуру β-шпильки в водном растворе и по своим свойствам напоминает антимикробные β-шпилечные пептиды, в то время как ChDode образует β-структурный антипараллельный ковалентный димер, стабилизированный двумя межмолекулярными дисульфидными связями. Несмотря на умеренную антибактериальную активность ChDode, наблюдался значительный синергетический эффект этого пептида в комбинации с другим кателицидином козы - α-спиральным пептидом ChMAP-28. Этот эффект основан на увеличении проницаемости бактериальных мембран. Такой механизм может приводить к более эффективному комбинированному действию синергической пары пептидов козы - ChMAP-28 и Pro-богатого пептида mini-ChBac7.5Nα, нацеленного на бактериальную рибосому.

  1. Bolosov IA, Panteleev PV, Sychev SV, Sukhanov SV, Mironov PA, Myshkin MY, Shenkarev ZO, Ovchinnikova TV 2021 Dodecapeptide Cathelicidins of Cetartiodactyla: Structure, Mechanism of Antimicrobial Action, and Synergistic Interaction With Other Cathelicidins. Front Microbiol 12 725526

Отдел «Учебно-научный центр» (Овчинникова Т.В.)

Изучение аллергенных свойств главного (мажорного) аллергена сои Glycine max Gly m 4

Известно, что главный (мажорный) аллерген сои Gly m 4 способен вызывать тяжелые аллергические реакции, включая анафилаксию, в отличие от многих других гомологов аллергена пыльцы березы Bet v 1, которые в большинстве случаев являются причиной местных аллергических реакций. Цель данного исследования состояла в проверке гипотезы о том, что аллерген сои Gly m 4 может являться сенсибилизатором иммунной системы человека. Нами было показано, что изменение pH при протеолитической деградации, снижение ферментативной нагрузки и присутствие липидов может значительно снижать скорость переваривания данного аллергена в желудке человека. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что Gly m 4 при определённых условиях может достигать кишечника в иммуногенной форме. С использованием монослоя клеток Caco-2, представляющего модель кишечного эпителия, мы впервые показали, что Gly m 4 может преодолевать эпителиальный барьер и индуцировать продукцию IL-4 зрелыми дендритными клетками in vitro. Кроме того, нами было показано, что некоторые из фрагментов аллергена, образующихся под действием ферментов желудочно-кишечного тракта, могут избирательно преодолевать эпителиальный барьер и индуцировать выработку иммунными клетками Th2-поляризующих цитокинов IL-5, IL-10 и IL-13, что может указывать на присутствие Т-клеточного эпитопа среди образующихся протеолитических фрагментов. Впервые продемонстрировано изменение профиля продуцируемых иммунными клетками цитокинов в ответ на инкубацию с Gly m 4. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что аллерген Gly m 4 сои потенциально может выступать в качестве сенсибилизатора иммунной системы человека. По результатам исследования опубликованы 3 научные статьи в журналах Q1.

  1. Melnikova DN, Finkina EI, Bogdanov IV, Ignatova AA, Matveevskaya S, Tagaev A, Ovchinnikova V 2021 Effect of Point Mutations on Structural and Allergenic Properties of the Lentil Allergen Len c 3. Membranes (Basel) 11 (12) 939
  2. Finkina EI, Melnikova DN, Bogdanov IV, Ignatova AA, Ovchinnikova TV 2021 Do lipids influence gastrointestinal processing: A case study of major soybean allergen gly m 4. Membranes (Basel) 11 (10)
  3. Bogdanov IV, Finkina EI, Melnikova DN, Ziganshin RH, Ovchinnikova TV 2021 Investigation of Sensitization Potential of the Soybean Allergen Gly m 4 by Using Caco-2/Immune Cells Co-Culture Model. Nutrients 13 (6)

Отдел функционирования живых систем

Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза (Коршун В.А.)

,  

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий (Кашеверов И.Е.)

,  

Лаборатория молекулярной диагностики (Завриев С.К.)

Оксимное лигирование для сайт-специфического мечения иммуноглобулинов флуоресцентными красителями

Биоконъюгация антител с различными лигандами находит разнообразное применение, например, для доставки лекарств и визуализации. Флуоресцентные иммуноконъюгаты представляют собой перспективный инструмент для диагностики рака благодаря своей высокой яркости, специфичности, стабильности и сродству к мишени. Флуоресцентные антитела широко используются в проточной цитометрии для быстрой и чувствительной идентификации клеток, экспрессирующих целевой поверхностный антиген. Современные подходы к флуоресцентному мечению антител чаще всего используют случайную модификацию, а также несколько довольно сложных сайт-специфических методов. Целью нашей работы была разработка процедуры флуоресцентного мечения иммуноглобулина G посредством периодатного окисления гликанов антитела с последующим оксимным лигированием с флуоресцентными оксиаминами. Мы представляем новую методику, основанную на оксимном лигировании in situ этоксиэтилиден-защищенных аминооксисоединений с окисленными гликанами антител. Этот подход позволяет легко модифицировать любой иммуноглобулин G, при этом антигенсвязывающие домены остаются интактными, что открывает возможности для конструирования флуоресцентных зондов. Этот метод был использован для мечения антитела к PRAME, белку раковой опухоли, сверхэкспрессируемому при ряде раковых заболеваний. Моноклональное антитело 6H8 к белку PRAME было модифицировано защищенными оксиаминовыми производными красителей типа флуоресцеина (FAM, Alexa488, BODIPY FL). Полученные иммунофлуоресцентные конъюгаты были применены для анализа образцов костного мозга пациентов с онкогематологическими заболеваниями и продемонстрировали высокую эффективность при количественной оценке методом проточной цитометрии. Данный подход может быть применен для разработки различных иммунофлуоресцентных зондов для выявления диагностических и прогностических маркеров, которые могут быть полезны в противораковой терапии.

  1. Sapozhnikova KA, Misyurin VA, Ryazantsev DY, Kokin EA, Finashutina YP, Alexeeva AV, Ivanov IA, Kocharovskaya MV, Tikhonova NA, Popova GP, Alferova VA, Ustinov AV, Korshun VA, Brylev VA 2021 Sensitive Immunofluorescent Detection of the PRAME Antigen Using a Practical Antibody Conjugation Approach. Int J Mol Sci 22 (23) 12845
  2. Sapozhnikova KA, Misyurin AV, Pestov NB, Meleshkina EG, Oreshkov SD, Ganzhula EP, Mikhailova AS, Korshun VA, Misyurin VA, Brylev VA 2021 Detection of the PRAME Protein on the Surface of Melanoma Cells Using a Fluorescently Labeled Monoclonal Antibody. Russ. J. Bioorganic Chem. 47 (5) 1077–1085

Лаборатория микрофлюидных технологий для биомедицины (Тоневицкий А.Г.)

Связь генотипов HLA класса I с тяжестью COVID-19 и предсказание изменений презентации пептидов при мутациях SARS-CoV-2

Молекулы человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA) класса I играют решающую роль в развитии специфического иммунного ответа на вирусные инфекции, представляя вирусные пептиды на поверхности клетки, где они в дальнейшем распознаются Т-клетками. Мы изучили, могут ли генотипы HLA класса I быть связаны с критическим течением COVID-19 путем поиска возможных связей между генотипами умерших пациентов и их возрастом на момент смерти. Генотипы HLA-A, HLA-B и HLA-C были определены с помощью секвенирования следующего поколения у 111 умерших пациентов с COVID-19 (Москва, Россия) и 428 добровольцев. Умершие пациенты были разделены на две группы в зависимости от возраста на момент смерти: 26 пациентов в возрасте до 60 лет и 85 пациентов старше 60 лет. Используя генотипы HLA класса I, мы разработали индекс риска (ИР), который был связан со способностью представлять пептиды коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) по набору молекул HLA класса I индивидуума. Полученный показатель ИР был значительно выше в группе умерших пациентов до 60 лет по сравнению с умершими пациентами старше 60 лет [p = 0,00348, площадь под ROC-кривой (AUC) = 0,68)]. В частности, наличие аллеля HLA-A*01:01 было связано с высоким риском, в то время как HLA-A*02:01 и HLA-A*03:01 в основном способствовали низкому риску. Анализ пациентов с гомозиготностью ярко подчеркнул эти результаты: гомозиготность по HLA-A*01:01 сопровождалась ранней смертью, в то время как только один пациент, гомозиготный по HLA-A*02:01, умер в возрасте до 60 лет. Применение построенной ИР-модели к независимой когорте испанских пациентов (n = 45) показало, что ИР также ассоциировался с тяжестью заболевания. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли презентации пептидов HLA класса I в развитии специфического иммунного ответа на COVID-19.

 

Быстро появляющиеся мутации SARS-CoV-2 могут влиять на эпитопы Т-клеток, что может помочь вирусу уклониться от ответа CD8 или CD4 Т-клеток. Мы разработали Т-клеточный атлас COVID-19 - комплексный веб-портал, который позволяет проанализировать, как мутации SARS-CoV-2 изменяют презентацию вирусных пептидов молекулами HLA. Данные представлены для распространенных вариантов вируса и наиболее частых аллелей HLA класса I и класса II. Сродство связывания молекул HLA и вирусных пептидов было оценено с помощью точных методов in silico. Полученные результаты подчеркивают важность учета разнообразия HLA-аллелей: опосредованные мутациями изменения в HLA-пептидных взаимодействиях сильно зависят от HLA-аллелей. Например, мы обнаружили, что пептиды, прочно связывающиеся с HLA-B*07:02 для референсного уханьского варианта вируса, перестали быть прочно связывающимися для индийского (Дельта) и британского (Альфа) вариантов.

  1. Nersisyan S, Zhiyanov A, Shkurnikov M, Tonevitsky A 2021 T-CoV: a comprehensive portal of HLA-peptide interactions affected by SARS-CoV-2 mutations. Nucleic Acids Res
  2. Shkurnikov M, Nersisyan S, Jankevic T, Galatenko A, Gordeev I, Vechorko V, Tonevitsky A 2021 Association of HLA Class I Genotypes With Severity of Coronavirus Disease-19. Front Immunol 12 641900

Лаборатория микрофлюидных технологий для биомедицины (Тоневицкий А.Г.)

HIF-зависимая активация NFATC1 повышает уровень экспрессии ITGA5 и PLAUR в кишечном эпителии при воспалительных заболеваниях кишечника

Эпителиальные клетки кишечника существуют в условиях физиологической гипоксии, что приводит к активации гипоксия-индуцибельного фактора (HIF) и поддерживает барьерную функцию и клеточный метаболизм кишечного эпителия. В противоположность этому, патологическая гипоксия является общей чертой некоторых хронических заболеваний, включая воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). Мы изучили HIF-ассоциированные изменения в кишечном эпителии при ВЗК. На первом этапе в модели клеток кишечника in vitro с помощью секвенирования РНК был получен список генов, реагирующих на химическую активацию гипоксии. Обработка хлоридом кобальта (II) и производным оксихинолина как недифференцированных, так и дифференцированных клеток Caco-2 активировала HIF-сигнальный путь, согласно анализу обогащения групп генов. Основной набор генов, реагирующих на стимуляцию химической гипоксии в модели кишечника, включал 115 генов с повышенной экспрессией и 69 - с пониженной. Из этого набора белковый продукт был обнаружен при анализе протеома для 32 генов, а кратность изменения экспрессии по данным протеома и секвенирования РНК значительно коррелирует. Анализ общедоступного набора секвенирования РНК эпителиальных клеток кишечника пациентов с ВЗК подтвердил активацию сигнального пути HIF-1 в сигмовидной кишке пациентов с язвенным колитом и терминальной части подвздошной кишки пациентов с болезнью Крона. Из набора основных генов, полученных на модели гипоксии кишечника, в образцах ВЗК была обнаружена активация экспрессии генов ITGA5 и PLAUR, кодирующих интегрин α5 и рецептор активатора плазминогена урокиназного типа (uPAR). Взаимодействие этих молекул может активировать миграцию клеток и регенеративные процессы в эпителии. Анализ транскрипционных факторов с помощью ранее разработанного инструмента miRGTF показал возможную роль HIF1A и NFATC1 в регуляции экспрессии генов ITGA5 и PLAUR. Обнаруженные гены могут служить маркерами прогрессирования ВЗК и гипоксии кишечника.

  1. Knyazev E, Maltseva D, Raygorodskaya M, Shkurnikov M 2021 HIF-Dependent NFATC1 Activation Upregulates ITGA5 and PLAUR in Intestinal Epithelium in Inflammatory Bowel Disease. Front Genet 12 791640

Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем (Аралов А.В.)

,  

Лаборатория молекулярной иммунологии (Деев С.М.)

Феноксазиновые псевдонуклеотиды в ДНК последовательностях, образующих i-мотивы, позволяют точно оценить стабилизирующие свойства низкомолекулярных соединений с помощью регистрации изменения флуоресцентного сигнала

Отсутствие высокопроизводительных методов скрининга (HTS) малых молекул, которые стабилизируют ДНК i-мотивы (iM), ограничивает их разработку в качестве потенциальных кандидатов в лекарственные препараты. Мы показали, что регистрация изменения сигнала флуоресценции для исследования влияния лигандов на стабильность iM, применяя стандартную пару FAM – BHQ1, дает неверные результаты из-за дополнительных взаимодействий, связанных с красителем/тушителем. Мы разработали альтернативную систему с флуоресцентными феноксазиновыми псевдонуклеотидами в петлях, которые не влияют на «разворачивание» iM. В то же время флуоресценция феноксазиновых остатков чувствительна к «разворачиванию» iM, что позволяет точно оценить вызванные лигандом изменения стабильности iM. Полученные результаты могут послужить основой для новых HTS подходов к профилированию лигандов, взаимодействующих с iM.

  1. Tsvetkov VB, Turaev AV, Petrunina NA, Melnik DM, Khodarovich YM, Pozmogova GE, Zatsepin TS, Varizhuk AM, Aralov AV 2021 Phenoxazine pseudonucleotides in DNA i-motifs allow precise profiling of small molecule binders by fluorescence monitoring. Analyst (Lond)  (146) 4436–4440

Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем (Аралов А.В.)

,  

Лаборатория структурной биологии ионных каналов (Шенкарёв З.О.)

,  

Лаборатория молекулярной диагностики (Завриев С.К.)

,  

Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза (Коршун В.А.)

,  

Группа химии гетероциклических соединений (Баранов М.С.)

Исследование аналогов хромофора GFP в качестве агентов против ВИЧ, направлено воздействующих на LTR-III G-квадруплекс

Хромофор зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его аналоги привлекают значительное внимание в основном как элемент систем биоимиджинга. В данной работе мы исследовали эти соединения в качестве противовирусных агентов. Мы выбрали ДНК LTR-III G4, основной G-квадруплекс (G4), присутствующий в промоторной области длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), в качестве мишени для первичного скрининга и разработки кандидатов в противовирусные препараты. Ранее было показано, что стабилизация данного G4 подавляет экспрессию и репликацию вирусных генов. Высокопроизводительный FRET скрининг 449 соединений, аналогов хромофора GFP, выявил ряд лидерных соединений, имеющих общие структурные особенности. Изучение взаимосвязи структура-активность (SAR) для наиболее эффективных стабилизаторов позволили нам установить структурные фрагменты, важные для связывания с данным G4. Синтетические соединения, разработанные на основе SAR анализа, показали высокий уровень стабилизации LTR-III G4. ЯМР-спектроскопия и молекулярное моделирование показали возможное образование комплекса LTR-III G4 с одним из наиболее селективных производных ZS260.1, расположенным внутри полости между двумя модулями, таким образом подчеркивая привлекательность LTR-III G4 мишени для направленного воздействия. Отобранные соединения показали умеренную активность против ВИЧ-I (EC50 1,78–7,7 мкМ) in vitro, но активность сопровождалась заметной цитотоксичностью.

  1. Ryazantsev DY, Myshkin MY, Alferova VA, Tsvetkov VB, Shustova EY, Kamzeeva PN, Kovalets PV, Zaitseva ER, Baleeva NS, Zatsepin TS, Shenkarev ZO, Baranov MS, Kozlovskaya LI, Aralov AV 2021 Probing gfp chromophore analogs as anti-hiv agents targeting ltr-iii g-quadruplex. Biomolecules 11 (10)

Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем (Аралов А.В.)

,  

Лаборатория молекулярного дизайна и синтеза (Коршун В.А.)

Феноксазиновые нуклеозидные производные с множественной активностью против РНК и ДНК вирусов

Новые и вновь появляющиеся вирусы периодически вызывают вспышки и эпидемии во всем мире, что в конечном итоге приводит к глобальным проблемам, таким как нынешняя пандемия новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 COVID-19. Таким образом, совершенно очевидна острая необходимость в новых противовирусных препаратах. Мы осуществили синтез и провели оценку противовирусной активности феноксазиновых нуклеозидных аналогов, разделенных на три группы: (1) 8-алкоксизамещенные, (2) ациклические и (3) карбоциклические. Противовирусная активность оценивалась на структурно и филогенетически разнообразной панели РНК и ДНК вирусов из 25 видов. Четыре соединения ингибировали 4 ДНК/РНК вируса с EC50 ниже 20 мМ. Токсичность соединений для клеточных линий, используемых для культивирования вирусов, в большинстве случаев была незначительной. Кроме того, ранее полученные и новые производные феноксазина были оценены на активность в отношении SARS-CoV-2, и некоторые из них показали многообещающее ингибирование репродукции со значениями EC50 в низком микромолярном диапазоне, хотя это и сопровождалось соразмерной цитотоксичностью.

  1. Kozlovskaya LI, Volok VP, Shtro AA, Nikolaeva YV, Chistov AA, Matyugina ES, Belyaev ES, Jegorov AV, Snoeck R, Korshun VA, Andrei G, Osolodkin DI, Ishmukhametov AA, Aralov AV 2021 Phenoxazine nucleoside derivatives with a multiple activity against RNA and DNA viruses. Eur J Med Chem 220 113467

Группа электронной микроскопии (Образцова Е.А.)

Анализ токсичности углеродных и нитрид борных наноматериалов

Использование наноструктур различного состава перспективно для множества применений от укрепления полимеров и металлов до нано-детекторов и медицинских покрытий. Многие из этих приложений предполагают непосредственное взаимодействие наноматериалов с человеком, животными или окружающей средой. Анализ его действия на биологические объекты становится важным для дальнейшего развития этих приложений.

Ранее нами было обнаружено негативное действие углеродных нанотрубок на бактериальные клетки. Но механизм этого эффекта был неясен. В этом году мы проанализировали взаимодействие 6 типов наноматериалов (алмаз, графит, гексагональный BN, кубический BN, BN и C нанотрубки) с люминесцентными бактериями Escherichia coli K12 TGI. Материалы были выбраны так, чтобы образовать пары схожей кристаллической структуры: алмаз и cBN; графит и hBN; Нанотрубки C и BN; и группы одинакового состава. Таким образом, мы могли измерить влияние состава и кристаллической организации наноструктур на живые клетки.

Используя методы электронной и атомно-силовой микроскопии, мы охарактеризовали исследуемые материалы и бактерии до и после инкубации с наноструктурированными порошками. Мы продемонстрировали, что структуры с кубической и гексагональной кристаллографической организацией не оказывают отрицательного воздействия на клетки. Нанотрубки, как углеродные, так и нитрид борный, являются токсичными. Изменения проявляются как в структуре клеток, что регистрируется методами электронной и атомно-силовой микроскопии, так и в снижении светимости люминесцентных бактерий и количестве колониеобразующих единиц.

Группа химии природных соединений (Михайлов А.А.)

,  

Группа химии гетероциклических соединений (Баранов М.С.)

Исследование фрагментированных по кольцу С производных ангуциклинонов

Совместно с коллегами из Института Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта произведено исследование фрагментированных по кольцу С производных ангуциклинонов. Разработан подход к химическому синтезу Элменолов А и Б и ряда родственных соединений. На основании литературных данных и оригинальной гипотезы пересмотрен путь биосинтеза и потенциальная функция данных соединений. Результаты исследования позволяют взглянуть по-новому на большую группу метаболитов данного класса антибиотиков.

  1. Ikonnikova VA, Solyev PN, Terekhov SS, Alferova VA, Tyurin AP, Korshun VA, Baranov MS, Mikhaylov AA 2021 Total Synthesis of Elmenols A and B and Related Rearranged Angucyclinones. ChemistrySelect 6 (42) 11775–11778
  2. Mikhaylov AA, Ikonnikova VA, Solyev PN 2021 Disclosing biosynthetic connections and functions of atypical angucyclinones with a fragmented C-ring. Nat Prod Rep 38 (8) 1506–1517

Группа химии природных соединений (Михайлов А.А.)

,  

Группа химии гетероциклических соединений (Баранов М.С.)

Универсальный метод синтеза юлолидинов

Совместно с группой химии гетероциклических соединений на основе реакции 1,5-гидридного сдвига/циклизации разработан универсальный подход к синтезу труднодоступных несимметричных производных юлолидина - потенциальной платформы для создания новых биологически активных соединений. Ключом к успешной реализации подхода стала возможность прямого формилирования тетрагидрохинолинов в положение 8 с помощью реакций Вильсмейера-Хаака или С-H активации.

  1. Shirokova VV, Ikonnikova VA, Solyev PN, Lushpa VA, Korlyukov AA, Volodin AD, Baleeva NS, Baranov MS, Mikhaylov AA 2021 1,5-Hydride-Shift-Triggered Cyclization for the Synthesis of Unsymmetric Julolidines. Synthesis (Stuttg) 53 (24) 4689–4699

Отдел метаболизма и редокс-биологии

Группа метаболических основ патологии (Билан Д.С.)

,  

Лаборатория молекулярных технологий (Белоусов В.В.)

Динамика развития ацидоза и окислительного стресса в нейронах в острой фазе ишемического инсульта

Ишемический инсульт является одной из главных причин смертности и инвалидизации населения в мире. Патофизиология инсульта активно исследуется на самых разных уровнях и моделях, однако до сих пор существуют серьезные пробелы в понимании метаболических изменений, сопровождающих данное заболевание. Особенно плохо изучены процессы, которые происходят в ткани мозга на самых ранних стадиях ишемии и реперфузии. В сотрудничестве с коллегами из Федерального центра мозга и нейротехнологий ФМБА России, Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова и других российских и зарубежных институтов мы разработали технологию, позволяющую регистрировать биохимические события в тканях мозга лабораторных животных in vivo.

Путем вирусной доставки в мозге крыс линии SHR были экспрессированы разработанные ранее в нашем институте генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры SypHer3s для регистрации динамики рН (Ermakova et al. Chem. Commun. 2018 doi:10.1039/C7CC08740C) и HyPer7 для регистрации пероксида водорода (H2O2) (Pak et al., Cell Metabolism 2020 doi:10.1016/j.cmet.2020.02.003). Флуоресцентный рациометрический сигнал биосенсоров считывался с помощью специально разработанной системы двухканальной фотометрии через имплантированные в мозг оптические волокна. Ишемический инсульт вызывался путём перекрытия средней мозговой артерии животного (MCAO). Мы зарегистрировали мощный ацидоз в ишемизированной ткани мозга, возникающий с первых секунд развития патологии. Вопреки ожиданиям, значительного образования H2O2, одного из главных представителей активных форм кислорода в клетках, в острой фазе ишемии/реперфузии обнаружено не было. Существенное увеличение концентрации H2O2 в митохондриях нейронов в поврежденной ткани наблюдалось лишь на следующие сутки.

Сравнение результатов экспериментов in vivo с исследованиями на культивируемых нейронах в условиях гипоксии/реоксигенации продемонстрировало, что динамика окислительно-восстановительных процессов в этих моделях значительно различается. Это в очередной раз подтверждает, что культура клеток является плохой прогностической моделью метаболических событий, происходящих внутри организма.

  1. Kelmanson IV, Shokhina AG, Kotova DA, Pochechuev MS, Ivanova AD, Kostyuk AI, Panova AS, Borodinova AA, Solotenkov MA, Stepanov EA, Raevskii RI, Moshchenko AA, Pak VV, Ermakova YG, van Belle GJC, Tarabykin V, Balaban PM, Fedotov IV, Fedotov AB, Conrad M, Bogeski I, Katschinski DM, Doeppner TR, Bähr M, Zheltikov AM, Belousov VV, Bilan DS 2021 In vivo dynamics of acidosis and oxidative stress in the acute phase of an ischemic stroke in a rodent model. Redox Biol 48 102178

Отдел биотехнологии

Лаборатория биофармацевтических технологий (Есипов Р.С.)

,  

Лаборатория биосинтеза низкомолекулярных физиологически активных соединений (Константинова И.Д.)

Сравнение мультиферментативных каскадных синтезов модифицированных нуклеозидов с использованием ферментов из термофильных и мезофильных организмов

Проведено сравнительное изучение возможностей использования каскадов ферментов рибокиназа → фосфопентомутаза → нуклеозидфосфорилаза в синтезе модифицированных нуклеозидов. Показано, что каскадные синтезы модифицированных нуклеозидов можно осуществлять как мезофильным, так и термофильным путем из D-пентоз: рибозы, 2-дезоксирибозы, арабинозы, ксилозы, 2-дезокси-2-фтор-арабинозы. С использованием ферментативного каскада количественно наработаны из D-рибозы и D-арабинозы четыре нуклеозида. Синтезированы рибозиды 8-азагуанозина (термофильный каскад) и аллопуринола (мезофильный каскад). Впервые синтезированы D-арабинозиды 2-хлор-6-метоксипурина и 2-фтор-6-метоксипурина с использованием мезофильного каскада. Несмотря на сравнительно небольшую разницу в температурах при постановке каскадных реакций (50 и 80 °С), скорость образования продуктов в реакциях с ферментами E. coli значительно выше. В мезофильном каскаде достигается более высокий выход продукта, поэтому его целесообразнее использовать для полиферментативного синтеза модифицированных нуклеозидов.

  1. Fateev IV, Kostromina MA, Abramchik YA, Eletskaya BZ, Mikheeva OO, Lukoshin DD, Zayats EA, Berzina MY, Dorofeeva EV, Paramonov AS, Kayushin AL, Konstantinova ID, Esipov RS 2021 Multi-enzymatic cascades in the synthesis of modified nucleosides: Comparison of the thermophilic and mesophilic pathways. Biomolecules 11 (4) 586

Лаборатория биосинтеза низкомолекулярных физиологически активных соединений (Константинова И.Д.)

Новые флексимерные пиразол-содержащие аналоги аденозина: химический, ферментативный и высокоэффективный биотехнологический синтез

Сотрудниками лаборатории совместно с коллегами из Института молекулярной биологии Энгельгардта была впервые синтезирована серия флексимерных пиразол-содержащих 8-аза-7-дезаза-аналогов аденозина – соединений, у которых пуриновое кольцо разделено на две ароматические системы. Было проведено сравнение эффективности химического, ферментативного и биотехнологического подходов синтеза. Показано, что ферментативный подход обладает регио- и стерео селективностью, экологичен и эффективен. Иллюстрация нашей работы была напечатана на обложке номера Organic & Biomolecular Chemistry, в котором вышла статья.

  1. Khandazhinskaya A, Eletskaya B, Fateev I, Kharitonova M, Konstantinova I, Barai V, Azhayev A, Hyvonen MT, Keinanen TA, Kochetkov S, Seley-Radtke K, Khomutov A, Matyugina E 2021 Novel fleximer pyrazole-containing adenosine analogues: chemical, enzymatic and highly efficient biotechnological synthesis. Org Biomol Chem 19 (34) 7379–7389

Группа химии пептидов (Азев В.Н.)

,  

Группа молекулярной биотехнологии (Микулинская Г.В.)

Химический синтез миметика фрагмента клеточной стенки бактерии и его гидролиз эндолизинами бактериофагов

С целью изучения механизма протеолитического гидролиза пептидогликана эндолизинами некоторых бактериофагов был осуществлено конструирование и химический синтез искуственного субстрата указанных ферментов, поскольку применение природного пептидогликана имеет значительные трудности в проведении экспериментальной работы. Синтезированное вещество является миметиком фрагмента пептидогликана и представляет собой N-ацетилглюкозаминил-β-(1-4)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-γ-D-глутамил-L-аланил-D-аланин. Гидролиз миметика литическими L-аланил-γ-D-глутаматными пептидазами бактериофагов T5, RB43 и RB49 изучали методом ЯМР. Было показано, что ферменты распознают синтезированый миметик в качестве субстрата, а его гидролиз протекает по связям L-аланил-γ-D-глутамат, как это имеет место быть в природном пептидогликане. Проведена оценка кинетических параметров реакций гидролиза рядом эндолизинов.

  1. Azev V, Chulin A, Molchanov M, Prokhorov D, Mikoulinskaia G, Uversky VN, Kutyshenko V 2021 Chemical synthesis of peptidoglycan mimetic–disaccharide-tetrapeptide conjugate and its hydrolysis by bacteriophage T5, RB43 and RB49 L-alanyl-D-glutamate peptidases. PeerJ 9 e11480

Группа молекулярной биотехнологии (Микулинская Г.В.)

Сравнительный анализ активных центров эндолизинов бактериофагов Т5, RB43 и RB49

Целый спектр физических методов (ядерный магнитный резонанс, круговой дихроизм, дифференциальная сканирующая калориметрия) использованы для сравнительного анализа активных центров трех цинк-зависимых металлопептидаз – эндолизинов псевдо Т-четных миовирусов (RB43 и RB49) и сифовируса (T5). Показана аминокислотная и структурная консервативность сайта связывания цинка и ключевая роль этого иона в стабилизации пространственной укладки белка. Мы продемонстрировали, что связывание Zn2+ в активном центре пептидазы EndoRB49 вызывает конформационные перестройки, аналогичные тем, что происходят в молекуле EndoT5 при связывании двух ионов – каталитического Zn2+ и регуляторного Ca2+ – и приводят к формированию каталитически активной формы фермента.

  1. Kutyshenko VP, Prokhorov DA, Mikoulinskaia GV, Molochkov NV, Yegorov AY, Paskevich SI, Uversky VN 2021 Comparative analysis of the active sites of orthologous endolysins of the Escherichia lytic bacteriophages T5, RB43, and RB49. Int J Biol Macromol 166 1096–1105

Отдел биофотоники

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Лукьянов К.А.)

Фотовосстановление дальнекрасного флуоресцентного белка mKate2

Дальнекрасный флуоресцентный белок mKate2 способен к формированию зеленой формы под действием интенсивного облучения. Мы исследовали его фотоповедение и обнаружили также переход белка в синее флуоресцентное состояние. Более того, выявлено влияние на кинетику фотоконверсии концентрации белка, удельной мощности облучения и наличия редокс-активных молекул в среде. Стационарная и времяразрешенная флуоресцентная спектроскопия позволила определить, что наблюдаемая эволюция спектральных форм не является истинной фотоконверсией, а происходит в основном вследствие «демаскировки» незрелых форм хромофора типа GFP при обратимом фотовосстановлении красного хромофора типа DsRed.

  1. Protasova EA, Mishin AS, Lukyanov KA, Maksimov EG, Bogdanov AM 2021 Chromophore reduction plus reversible photobleaching: how the mKate2 photoconversion works. Photochem Photobiol Sci 20 (6) 791–803

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Лукьянов К.А.)

Поведение обонятельных рецепторов насекомых в клетках млекопитающих

Обонятельные рецепторы насекомых семейства OR представляют собой гетеромерные молекулы, состоящие из лиганд-специфической (OrX) и регуляторной (Orco) субъединиц. Предполагается, что гетеромеры OR способны и к ионотропной, и к метаботропной активации. Мы исследовали функционирование двух гетеромерных обонятельных рецепторов дрозофилы в клетках млекопитающих. Рецепторы нативного состава (OrX/Orco) показывают различия по чувствительности к лиганду в ~100 раз, по кинетике электрического ответа в 25-30 раз (на рисунке (А) сверху показаны кинетические характеристики гетеромеров Or49/Orco и Or59/Orco, снизу – их чувствительность к лигандам. Замена регуляторной субъединицы на модифицированную, не связывающую цАМФ (т.н. Orco-PKC), не повлияла на работу рецептора метилацетата (Or59), но резко изменила проводимость рецептора о-крезола (Or49; на рисунке Б приведены вольтамперные характеристики рецептора с нативной и модифицированной субъединицами). Мы заключили, что рецепторы одного семейства могут существенно отличаться по своей настройке, в т.ч., механизмами трансдукции сигнала.

  1. Kolesov DV, Ivanova VO, Sokolinskaya EL, Kost LA, Balaban PM, Lukyanov KA, Nikitin ES, Bogdanov AM 2021 Impacts of OrX and cAMP-insensitive Orco to the insect olfactory heteromer activity. Mol Biol Rep 48 (5) 4549–4561

Лаборатория рентгеноструктурных исследований биополимеров (Плетнёв В.З.)

,  

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Лукьянов К.А.)

Структурно-функциональные исследования EYFP-F165G. Дизайн флуоресцентных биомаркеров с повышенной яркостью.

Рентгеноструктурным методом установлена пространственная структура и изучены биохимические свойства EYFP-F165G - варианта яркого желтого биомаркера EYFP. Структура EYFP-F165G выявила два независимых пути посттрансляционной модификации, отвечающих двум состояниям полипептидной цепи - с интактной хромофор-образующей триадой (~85%) и зрелым хромофором (~15%). На основе пространственной структуры EYFP-F165G осуществлен дизайн новых генно-инженерных вариантов. Наиболее совершенный вариант EYFP-F165H с 2.2 -кратным увеличением яркости эмиссии по отношению к желтому предшественнику EYFP входит в десятку известных самых ярких биомаркеров.

Подпись к Рисунку: Карта электронной плотности 2Fo-Fc (синий цвет) в ближайшем окружении хромофора. Карта разностной электронной плотности FoFc (зеленый цвет) для созревшего хромофора (коричневый цвет) и интактной хромофоробразующей) триады GYG (желтый цвет).

  1. Pletneva NV, Maksimov EG, Protasova EA, Mamontova AV, Simonyan TR, Ziganshin RH, Lukyanov KA, Muslinkina L, Pletnev S, Bogdanov AM, Pletnev VZ 2021 Amino acid residue at the 165th position tunes EYFP chromophore maturation. A structure-based design. Comput Struct Biotechnol J 19 2950–2959

Группа молекулярных меток для оптической наноскопии (Мишин А.С.)

,  

Лаборатория генетически кодируемых молекулярных инструментов (Лукьянов К.А.)

,  

Группа химии гетероциклических соединений (Баранов М.С.)

Компьютерный редизайн флуороген-активирующего белка

Флуороген-активирующие белки – это новейшие системы обратимого флуоресцентного мечения, состоящие из генетически кодируемого белка и флуорогена, добавляемого извне. Доступный исследователям набор таких меток крайне ограничен, а разработка новых вариантов происходит медленно. Мы применили компьютерное моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий и компьютерный редизайн лиганд-связывающего кармана для создания улучшенного флуороген-активирующего белка.

Разработанный белок DiB-RM демонстрирует большую молекулярную яркость в сверхразрешающей локализационной микроскопии protein-PAINT по сравнению с белком-предшественником DiB1. На основе белка DiB-RM также создана эффективная сплит-система, а во флуоресцентной микроскопии DiB-RM показал увеличенную фотостабильность мечения. Сопоставление экспериментальных данных, кристаллических структур и результатов компьютерного моделирования улучшили понимание взаимосвязи структура-функция во флуороген-активирующих белках на основе бактериального липокалина.

  1. Bozhanova NG, Harp JM, Bender BJ, Gavrikov AS, Gorbachev DA, Baranov MS, Mercado CB, Zhang X, Lukyanov KA, Mishin AS, Meiler J 2021 Computational redesign of a fluorogen activating protein with Rosetta. PLoS Comput Biol 17 (11) e1009555
  2. Perfilov MM, Gavrikov AS, Lukyanov KA, Mishin AS 2021 Transient fluorescence labeling: Low affinity—high benefits. Int J Mol Sci 22 (21)

Группа химии гетероциклических соединений (Баранов М.С.)

,  

Лаборатория биомолекулярной ЯМР-спектроскопии (Арсеньев А.С.)

,  

Группа молекулярных меток для оптической наноскопии (Мишин А.С.)

Новые системы мечения на основе флуороген-активирующих белков

Флуоресцентные белки - важнейший инструмент в современных биологических исследованиях. Однако такие белки обладают рядом выраженных недостатков: им требуется кислород и некоторое время для созревания, их цветовое разнообразие ограничено хромофорами сформированными из природных аминокислот, после фотообесцвечивания они не могут более выступать в роли метки, а также все они имеют достаточно большой размер, что сказывается на поведении изучаемого объекта. Отличной алтернативой таким белкам стали в последние годы так называемые флуороген-активирующие белки. Флуороген-активирующие белки не имеют собственного флуорофора, а принимают его из раствора. Этот механизм заметно повышает фотсотстабильность такой метки, а также позволяет индуцировать сигнал строго при необходимости. Подобный комплекс не требует времени и кислорода для созревания, цветовое разнообразие флуорогенов потенциально ничем не ограничено, а размер таких белков как правило заметно меньше.
В ходе работ 2021 года в нашей группе совместно с Группой молекулярных меток для оптической наноскопии была создан целая серия новых флуорогенов для известного флуороген-активируюещго белка FAST. Также совместно с этой же группой, Лабораторией биомолекулярной ЯМР-спектроскопии и коллегами из МФТИ мы разработали флуороген-активирующий белок nanoFAST размером всего 98 аминокислот, и это наименьший размер среди всех генетически кодируемых флуоресцентных меток.

  1. Chen C, Tachibana SR, Baleeva NS, Myasnyanko IN, Bogdanov AM, Gavrikov AS, Mishin AS, Malyshevskaya KK, Baranov MS, Fang C 2021 Developing Bright Green Fluorescent Protein (GFP)-like Fluorogens for Live-Cell Imaging with Nonpolar Protein−Chromophore Interactions. Chemistry 27 (35) 8946–8950
  2. Mineev KS, Goncharuk SA, Goncharuk MV, Povarova NV, Sokolov AI, Baleeva NS, Smirnov AY, Myasnyanko IN, Ruchkin DA, Bukhdruker S, Remeeva A, Mishin A, Borshchevskiy V, Gordeliy V, Arseniev AS, Gorbachev DA, Gavrikov AS, Mishin AS, Baranov MS 2021 NanoFAST: structure-based design of a small fluorogen-activating protein with only 98 amino acids. Chem Sci 12 (19) 6719–6725
  3. Sokolov AI, Myasnyanko IN, Baleeva NS, Baranov MS 2021 Styrene Derivatives of Indole and Pyranone as Fluorogenic Substrates for FAST Protein. Russ. J. Bioorganic Chem. 47 (1) 334–337

10 января