Лаборатория биотехнологии растений

В лаборатории развиваются взаимосвязанные направления научных исследований в области адаптивной эпигенетики, генно-инженерной экспериментальной биологии растений, создания искусственных ассоциативных систем «растение-микроорганизм» и приложения полученных результатов к разработке новых технологий.

Лаборатория проводит совместные исследования с коллегами из лабораторий Института и из других отечественных и зарубежных научных центров. Для изучения экспрессии искусственного гена антимикробного пептида цекропина Р1 в растениях и исследования свойств растений совместно с Группой химии пептидов, Лабораторией иммунохимии и Лабораторией биологических испытаний синтезированы различные формы антимикробного пептида цекропина Р1, получены его антитела и проведены испытания экстракта цекропиновых растений в экспериментах на животных. С Лабораторией иммунохимии также проведено исследование иммуногенных свойств растений картофеля, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В. С Учебно-научным центром ИБХ ведется работа по получению и исследованию трансгенных растений, экспрессирующих ген антимикробного пептида ареницина. Лаборатория сотрудничает и имеет совместные публикации с Институтом белка РАН, Институтом биохимии им А.Н. Баха РАН и Институтом физиологии растений РАН, Институтом физиологии растений РАН, ГУ Республиканским научно-практическим центром трансфузиологии и медицинских биотехнологий (Минск), Калифорнийским университетом (Дэвис), Невадским университетом (Nevada, Reno).

Лаборатория биотехнологии растений была основана в ФИБХ в 1992 году.

Адаптивная эпигенетика

Установлено, что в условиях адаптации факультативных галофитных растений Mesembryanthemum crystallinum к солевому стрессу и водному дефициту, сопровождающейся переключением С-3 фотосинтеза на CAM путь ассимиляции углекислого газа, уровень CpHpG метилирования (H – любой нуклеозид, кроме G) их ядерного генома в последовательностях CCWGG (W = A или T) повышается в два раза и связан с гиперметилированием повторяющихся последовательностей ДНК. Таким образом, впервые обнаружено специфическое CpNpG гиперметилирование повторяющихся последовательностей ДНК в условиях экспрессии новой эпигенетической программы. Функциональная роль CpNpG гиперметилирования ДНК, по-видимому, связана с формированием специализированной структуры хроматина, одновременно регулирующей экспрессию множества генов в клетках растений Mesembryanthemum crystallinum при их адаптации к солевому стрессу.

Установлено, что искусственный ген цекропина Р1 участвует в интегральной адаптивной системе растений. Растения с цекропином проявляли устойчивость к разным стрессам, в том числе солевому стрессу, ультрафиолету, окислительному стрессу. Таким образом, ген цекропина Р1 в трансгенных растениях выполняет функцию антистрессового гена. Исследованы трансгенные растения, экспрессирующие ген цекропина под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (35S) и селективный маркерный ген неомицинфосфотрансферазы II (nptII) под контролем промотора агробактериального гена нопалинсинтазы (nos). Проведено сравнение экспрессии и метилирования промоторов 35S и nos, а также биосинтеза цекропина Р1 трансгенных растений в условиях их роста на среде с канамицином и без канамицина. Метилирование активного промотора 35S отличается низким уровнем, при этом в условиях культивирования растений на среде с канамицином наблюдается дальнейшее снижение его метилирования и повышение синтеза цекропина Р1. Таким образом, активность считающегося конститутивным промотора 35S в трансгенных растениях контролируется его метилированием. Полученные результаты указывают на участие генов cecP1 и nptII в интегрированной системе стрессоустойчивости растений и показывают, что с помощью специфических условий культивирования можно регулировать синтез трансгенных антимикробных пептидов в растениях.

В лаборатории разработаны новые методы применения ДНК-метилтрансфераз в качестве реагентов в молекулярной биологии и структурно-функциональном исследовании энзиматического метилирования ДНК различных организмов. Разработан метод анализа метилирования в ДНК в последовательностях CpWpG. Проведено экзогенное метилирование генома животных и растений гетерологичными цитозиновыми ДНК-метилтрансферазами. Для направленного переноса  гетерологичных ДНК-метилтрансфераз в ядро эукариотических клеток в лаборатории была созданы специальные векторные конструкции.

В клетках культуры HEK 293 экспрессированы гены гетерологичных ДНК-метилтрансфераз со специфичностью CpHpG; обнаружена связь между этим метилированием генома трансформированных клеток и снижением их пролиферации. Обнаружено влияние экзогенного метилирования генома растений на их фенотип.


Генно-инженерная экспериментальная биологии растений

Лаборатория проводит исследования на полученных трансгенных растениях картофеля, капусты, сахарной свеклы, томата, масличных культурах рапса и камелины, чечевицы, лекарственных растениях каланхоэ и алоэ. В них, в частности, экспрессированы гены антимикробных пептидов. Растения с  этими генами проявляли устойчивость к бактериальным и грибным патогенам. Растения рода Kalanchoe давно используются в качестве лекарственных растений в народной медицине и представляют большой интерес для фармакологии. Сок растений Kalanchoe pinnata применяют для заживлению ран, ожогов, он обладает бактерицидными свойствами. Из этого растения получают лекарственные препараты для применения в хирургической, зубоврачебной, гинекологической практике и при лечении глазных  заболеваний. В Лаборатории исследован экстракт из трансгенных растений каланхоэ, экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина Р1. Антибиотические свойства экстракта сохраняются при выдерживании его при кипячении. Экстракт, добавленный в среду для культивирования растений, усиливает ризогенез каллусов трудных для морфогенеза растений хрустальной травки (Mesembryanthemum crystallinum). Повышенная биологическая активность экстракта обнаружена также в экспериментах на животных по его ранозаживляющим, бактерицидным и иммуномодулирующим свойствам. Полученные результаты указывают на высокую биологическую активность исследованного экстракта растений каланхоэ и перспективность его использования в фармакологии. Получены трансгенные растения табака, картофеля и томата, синтезирующие поверхностный антиген вируса гепатита В. В экспериментах на животных была показана высокая иммуногенность съедобного картофеля содержащего поверхностный антиген вируса гепатита В, что указывает на перспективность получения на основе таких растений съедобной вакцины. В своих исследованиях Лаборатория давно широко использует стратегию антисмысловых РНК (РНК-интерференции). На основе антисмысловых форм агробактериальных фитогормональных генов получены трансгенные растения, устойчивые к агробактериальному раку.

Большинство трансгенных растений экспрессируют нежелательные и даже опасные селективные гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Они используются для выявления трансформированных растений, но после этого они не нужны, но продолжают работать, затрачивая на себя энергию и метаболиты, снижая продуктивность растений. Передача этих генов микрофлоре и сорнякам опасна распространением множественной лекарственной устойчивости среди патогенов и появлением “суперсорняков”. В экспериментальной биологии присутствие этих генов делает невозможным проведение чистых экспериментов только с целевым трансгеном. Но уже возможно получение растений нового поколения без этих генов. В Лаборатории разработан новый метод получения безмаркерных трансгенных растений. Для этого был сконструирован агробактериальный безмаркерный вектор для встройки целевых генов и трансформации и выявления трансформантов на неселективных средах. Метод получения безмаркерных трансгенных растений по прямой детекции продукта экспрессии гена  позволяет в одну стадию выявлять трансгенные растения. У полученных растений изначально нет селективных генов, которые требуется дополнительно вырезать в других трудоемких методах создания безмаркерных трансгенных растений. Трансформанты не подвергаются селективному стрессу, вызывающему гиперметилирование ДНК и «замолкание» целевых генов. В геноме трансформантов меньше «генетического мусора».

С помощью этого метода ускорен процесс получения растений с целевым геном и возможены прямой отбор линий с высоким уровнем экспрессии трансгена и  проведение «чистых» экспериментов только с целевым трансгеном. Полученные таким методом

растения должны иметь более высокую продуктивность и конкурентное преимущество при коммерциализации.

 

Создание искусственных ассоциативных систем «растение-микроорганизм»

Применение традиционных микробиологических препаратов защиты растений и стимуляции их роста не всегда приводит к положительным результатам. Это связано с применением таких микроорганизмов, которые, будучи антагонистами фитопатогенов, не являются активными колонизаторами растений, устанавливающими с ними продуктивную ассоциативную связь. Это может быть также связано с трудностью образования стабильной ассоциативной связи между микроорганизмами и растениями, растущими в окружающей среде и уже «заселенными» неблагоприятной микрофлорой. В Лаборатории проводятся разработки новых технологий защиты с-х растений от фитопатогенов и чужеродных соединений путем создания искусственных ассоциативных систем «растение-микроорганизм». В работе применяется комплексное исследование колонизированных растений полезными природными и модифицированными штаммами микроорганизмов, устанавливающими стабильную ассоциативную связь с растениями. Полезные ассоциированные микроорганизмы оказывают стимулирующее влияние на растения за счет способности к азотфиксации, образованию физиологически активных веществ, мобилизации питательных элементов из почвы, вытеснению и подавлению роста патогенов, а также могут способствовать защите растений от токсичных ксенобиотиков.

Получение искусственных ассоциативных систем «растение-микроорганизм» направлено для решения двух основных задач:

  • повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и их устойчивости к фитопатогенам
  • повышения устойчивости растений к токсичным чужеродным соединениям.

Проводится поиск и отбор полезных ассоциативных микроорганизмов и разработка новых методов колонизации полезной микрофлорой овощных, масличных и плодово-ягодных культур растений. Для колонизации растений используются природные и модифицированные ассоциативные штаммы бактерий, дрожжей и арбускулярных микоризных грибов. Начальные стадии деградации токсичных соединений в системе «растение-микроорганизм» основаны на энзиматическом потенциале микроорганизмов, в то время как последующая трансформация этих продуктов и их полная утилизация в виде естественных метаболитов осуществляется ферментами растений и микроорганизмов. Для формирования устойчивых ассоциативных систем «растение-микроорганизм»  применяется разработанная в Лаборатории технология комбинированного использование методов клонального микроразмножения и микробной колонизации растений.

В совместной работе с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН показано, что метилобактерии  и другие рост-стимулирующие бактерии легко образуют с растениями ассоциативную связь и стабильно ее сохраняют при клональном микроразмножении растений. Колонизированные растения отличаются улучшенными физиологическими характеристиками и проявляют повышенную устойчивость к фитопатогенам. Колонизация растений бактериями, устойчивыми к ксенобиотикам нафталину и глифосату, придавала эту устойчивость растениям. Таким образом, разработанные технологии должны способствовать повышению продуктивности растений и получению экологически чистой сельскохозяйственной продукции, а также применяться для ремедиации территорий, загрязненных токсичными соединениями.

 

Патенты

1. Захарченко Н.С., Кочетков В.В., Бурьянов Я.И., Боронин А.М. Способ защиты посадочного материала растений против заболеваний, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами. Патент № 2380886 от 10 февраля 2010 г.
2. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Юхманова А.А., Пиголева С.В., Рукавцова Е.Б., Чеботарева Е.Н., Гаязова А.Р. Рекомбинантная плазмида pBMи способ получения с ее
использованием безмаркерных трансгенных растений, синтезирующих целевые продукты. Патент №. 2410433 от 27 января 2011 г.
3. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Лебедева А.А., Захарченко А.В., Сизова О.И., Анохина Т.О., Сиунова Т.В.,Кочетков В.В., Боронин А.М. Способ получения растительно-микробных ассоциаций для фиторемедиации на основе микроразмножаемых растений и плазмидосодержащих ризосферных бактерий. Патент № 2443771 от 27 февраля 2012 г.
4. Захарченко Н.С., Лебедева А.А., Бурьянов Я.И. Способ получения генетически модифицированных растений каланхоэ, экспрессирующих ген цекропина Р1. Патент № 2445768 от 27 марта 2012 г.

5. Захарченко Н.С., Лебедева А.А., Бурьянов Я.И. Способ получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1. Патент №
2624042 от 30 июня 2017 г.
6. Бурьянов Я.И., Лебедева А.А., Захарченко Н.С. Способ получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1. Заявка №
2015154311 от 17.12.2015.
7. Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Способ получения антимикробного пептида цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого. Заявка № 2016133605 от 16.08.2016.

Избранные публикации (показать все)

Загружаются...

Бурьянов Ярослав Иванович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. ФИБХ, комн. Переход/439
  • Тел.: +7(4967)73-09-21#3228
  • Эл. почта: buryanov@bibch.ru

Биологическая активность экстракта цекропин Р1 экспрессирующих растений каланхоэ (2017-11-27)

В экспериментах на растениях и животных исследован водный экстракт полученных в лаборатории растений каланхоэ перистого (Kalanchoe pinnata L.), экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина P1 (сесР1). Экстракт эффективно индуцирует ризогенез у каллусов трудных для дифференцировки in vitro растений Mesembryanthemum crystallinum. Обнаружена высокая ранозаживляющая (рис. 1) и антимикробная активность экстракта сесР1-растений, превосходящая эффективность антибиотика цефазолина в отношение возбудителей гнойных инфекций Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa (рис. 2) и противогрибкового препарата клотримазола в отношение высоковирулентного клинического изолята Candida albicans. Полученные результаты указывают на перспективность использования сесР1-растений каланхоэ в экспериментальной биологии и фармакологии.

Публикации

  1. Zakharchenko NS, Furs OV, Pigoleva SV, Lebedeva AA, Shchevchuk TV, Dyachenko OV, Buryanov YI (2018). Biological Activity of Leaf Extracts from Cecropin P1-Synthesizing Kalanchoe Plants: Pharmacological Prospects. Russ J Plant Physiol 65 (1), 136–142
  2. Lebedeva AA, Zakharchenko NS, Trubnikova EV, Medvedeva OA, Kuznetsova TV, Masgutova GA, Zylkova MV, Buryanov YI, Belous AS (2017). Bactericide, immunomodulating, and wound healing properties of transgenic Kalanchoe pinnata synergize with antimicrobial peptide cecropin P1 in Vivo. J Immunol Res 2017 (0), 4645701
  3. Zakharchenko NS, Belous AS, Biryukova YK, Medvedeva OA, Belyakova AV, Masgutova GA, Trubnikova EV, Buryanov YI, Lebedeva AA (2017). Immunomodulating and Revascularizing Activity of Kalanchoe pinnata Synergize with Fungicide Activity of Biogenic Peptide Cecropin P1. J Immunol Res 2017 (0), 3940743

Получение растений с повышенной экспрессией HBsAg в качестве съедобной вакцины против гепатита В (2016-03-18)

Создана новая экспрессионная система для повышенного синтеза белков в растениях под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S), содержащего 4 энхансерных последовательности CaMV 35S и нетранслируемую лидерную последовательность Ω РНК вируса табачной мозаики. В опытах на лабораторных животных продемонстрирована иммуногенность клубней картофеля, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Повышенный синтез целевых белков позволяет использование трансгенных растений в качестве съедобной вакцины против гепатита В без дополнительных инъекций рекомбинантной вакцины.