Лаборатория химии белка

Отдел биоинженерии (ФИБХ)

Руководитель: Липкин Валерий Михайлович, чл.-корр. РАН
vmlipkin@ibch.ru+7(4967)79-39-71, +7(4967)73-37-49

В лаборатории ведутся работы по нескольким направлениям исследований: структурно-функциональное исследование зрительных сигнальных белков и разработка новых подходов к лечению рассеянного склероза.

Под руководством Дмитрия Валерьевича Зинченко проводится структурно-функциональное исследование зрительных сигнальных белков. Система фототрансдукции была использована как модельная система для изучения трансмембранной передачи химического сигнала – одного из ключевых элементов клеточной регуляции, лежащего в основе действия гормонов, нейромедиаторов, биологически активных белков и пептидов.

В последние годы коллективом Лаборатории проведены структурно-функциональные исследования молекулы рековерина. Показано, что клеточной мишенью молекулы рековерина является родопсинкиназа. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза сотрудники получили различные мутантные формы рековерина, что позволило провести функциональное картирование молекулы рековерина и выяснить роли отдельных аминокислотных остатков. Также сотрудники получили мутантные формы с модифицированными кальций связывающими EF-hand центрами, которые позволили собрать данные о механизме связывания ионов кальция отдельными  участками рековерина и выявить роль кальций связывающих EF-hand центров в процессе связывания белка с фоторецепторной мембраной и в процессе ингибирования фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой.

Сейчас продолжается комплексное исследование механизмов, лежащих в основе регуляции функциональной активности не только рековерина и некоторых других нейрональных кальциевых сенсоров (НКС) в условиях, моделирующих различные состояния, возникающие внутри фоторецепторной клетки. Показано, что особенности структурной организации С-концевого сегмента НКС определяют механизм, в соответствии с которым достигается селективность Са2+-зависимого действия каждого из белков семейства. Сотрудники исследовали влияние окислительных модификаций НКС по консервативному остатку цистеина, в том числе, димеризации НКС с образованием дисульфидной связи, на функционирование этих белков. Продолжается исследование механизма регуляции функционирования НКС за счет взаимодействия с каркасным белком из рафт-структур кавеолином-1. Показано, что транслокация рековерина в фоторецепторные рафт-структуры, содержащие кавеолин-1, повышает Са2+-чувствительность регуляторной активности белка, адаптируя ее к физиологическому диапазону изменения концентрации катиона в фоторецепторной клетке.

По этому направлению ведутся исследования в области молекулярных механизмов зрения около 15 лет. За это время Лаборатория провела совместных работ с лабораторией зрительной рецепции НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ и лабораторией новых методов в биологии ИБП РАН. Новые исследования проводятся также в тесном сотрудничестве с этими коллективами.

Межлабораторные рабочие группы под руководством Алексея Викторовича Данилковича и Игоря Петровича Удовиченко занимаются разработкой новых подходов для получения терапевтических средств для лечения рассеянного склероза, биогенных субстратов, – биогелей на основе сомоорганизующихся пептидных фибрил, применимых для тканезаместительной терапии и в качестве искуственного депо для перманентной дозоконтролируемой доставки лекарственных средств в организм.

Рассеянный склероз (РС) – хроническое, прогрессирующее аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (ЦНС) с множественной симптоматикой, характеризующееся демиелинизацией белого вещества (аксонов мозга). Очаги демиелинизации в центральной  нервной системе вызывают аксональную дегенерацию, что является причиной развития  стойкой патологии центральной нервной системы, приводящей к ранней инвалидности больных. Разрабатывая новые подходы для получения терапевтических средств для РС, сотрудники Лаборатории занимались поиском и анализом потенциальных структур, представляющих из себя вещества пептидной немиелиновой природы. Поскольку в  развитии РС  доминирующую роль играют иммунологические процессы, то требуются лекарственные средства, позволяющие модулировать функциональное состояние аутоиммунных клеток, активность которых вызывает аутоиммунное заболевание.

В ходе работы сотрудники обнаружили, что пептид A8AMS, гомологичный участку VH  домена IgG человека, способен при стимуляции КонА ингибировать пролиферативную активность праймированных лимфоцитов из  аутбредных крыс линии Dark Agouti (DA) с  экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЭАЭ), – животной  модели РС. Лимфоциты, выделенные из животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломелитом, использовали в культуре клеток для исследования действия различных  концентраций экспериментального пептида A8AMS на клетки при инкубации в течение 72 ч. Жизнеспособные клетки детектировали с помощью витального агента AlamarBlue.

К потенциальным ограничениям и рискам разрабатываемого лекарственного средства относится возможная токсичность разрабатываемого лекарственного  средства, но, в отличие  от «малых молекул» фарминдустрии, пептидная природа сводит эти риски к минимуму, с учетом того, что структура лекарственного средства присутствует у человека как составная  часть  молекул нескольких типов антител и не является чужеродной. Более того, использование современных методов моделирования биологических структур и расчёта их термодинамических характеристик с использованием элементов многофакторного анализа позволяет создавать целый набор пептидных молекул с заданными свойствами, учитывая высокую степень индивидуальных особенностей организма человека.

Известно, что некоторые полярные и амилоидогенные пептиды способны проявлять в водных растворах склонность к самоорганизации, формируя наноструктуры в виде фибрилл длиною в сотни нанометров. Изучение и определение факторов,  оказывающих влияние на процесс самоорганизации молекул пептидов, является важной задачей в свете поиска подходов к профилактике и лечению заболеваний, сопровождаемых накоплением в тканях и клетках амилоидных телец, создания новых материалов для медицины, в том  числе — получения биогелей с целью их использования в тканевой инженерии и в качестве имплантируемого контейнера, позволяющего реализовать доз-контролируемую доставку лекарственных средств. Этим вопросом также занимается межлабораторная группа.

В экспериментах in vitro показано (рис. 1, a-b),  что в ходе самоорганизации ионных пептидов формируется пространственная сеть из искусственных волокон, в которых молекулы пептидов ориентированы перпендикулярно продольной оси филамента, диаметр которых зависит от размера боковых заместителей соответствующих аминокислотных остатков (рис. 1, c-d). Поскольку все детали процесса самоорганизации комплекса молекул пептидов на стадии инициации, особенно начальные этапы сборки протофиламента, до конца не выяснены, нами были изучены характеристики разно размерных комплексов антипараллельных пептидов H-(RADA)4-OH и H-(RLDL)4-OH с целью определения пространственной организации протофиламента.

unnamed.jpg

Рис. 1. Атомно-силовое детектирование линейных размеров фибрилл, образованных самоорганизующимися пептидами H-(RADA)4-OH (a,c); и H-(RLDL)4-OH (b,d). Распределение величин поперечных размеров фибрилл каждого вида отражает различия размеров групп боковых заместителей аминокислотных остатков в составе пептидов.

В результате молекулярной стыковки пространственных структур пептидов H-(RLDL)4-OH в b-конформации были получены стабильные комплексы: димер, тетрамер, тетрамер-«лист» и октамер, для которых рассчитаны соответствующие МД-траектории длительностью по10 нс в каждом случае.

Сравнительный анализ характеристик пептидных комплексов показал, что все структуры, за исключением комплекса тетрамер-«лист», стабилизированы в b-конформации (рис.2). Также отмечено, что димер молекул H-(RLDL)4-OH в явном водном окружении значительно более устойчив в b-конформации (рис.3), чем димер пептида H-(RADA)4-OH . Это позволило сделать вывод о том, что формирование антипараллельных димеров в b-конформации можно рассматривать как первую стадию процесса самоорганизации молекул H-(RLDL)4-OH в воде. Данному выводу полностью соответствуют результаты сравнительного анализа величин свободных энергий Гиббса пептидных структур.

unnamed.jpg

Рис. 2. Изменение длин (L) непрерывных сегментов последовательности - числа аминокислотных остатков в -конформации для комплексов антипараллельных пептидов H-(RLDL)4-OH на отрезке времени 10 нс (по данным МД: AMBER ff03, 300K).

 

unnamed.jpg

Рис. 3а. Свободная энергия (PBSA) мономеров и комплексов пептидов на экспериментальном отрезке времени 10 нс в условиях явного водного окружения (AMBER ff03, 300K). Комплексы пептидов H-(RLDL)4-OH.

unnamed.jpg

Рис. 3б. Комплексы пептидов H-(RADA)4-OH. РЕЗУЛЬТАТ: В случае H-(RLDL)4-OH свободная энергия октамера меньше, чем сумма энергий компонентов, слагающих пептидный комплекс. В случае H-(RADA)4-OH свободная энергия додекамера меньше, чем сумма энергий компонентов, слагающих пептидный комплекс. ВЫВОД: Возможность самоорганизации рассматриваемых пептидов с образованием антипараллельных комплексов термодинамически обоснована.

Характерная топология и стабильность пептидов H-(RLDL)4-OН в составе комплексов димера, тетрамера и октамера характеризует основные стадии процесса самоорганизации молекул ионных пептидов в воде, что в конечном итоге обеспечивает образование наноструктур в виде филаментов. 

Лаборатория химии белка основана в 1990 году.

Ф.И.О.ДолжностьКонтакты
Липкин Валерий Михайлович, чл.-корр. РАНрук. подр.vmlipkin@ibch.ru+7(4967)79-39-71, +7(4967)73-37-49
Зинченко Дмитрий Валерьевич, к. б. н.с.н.с.zdv@bibch.ru
Муранова Татьяна Анатольевна, к. х. н.с.н.с.muranova@bibch.ru
Удовиченко Игорь Петрович, к. х. н.н.с.iudovichenko1@yandex.ru
Данилкович Алексей Викторович, к. х. н.н.с.danilkovich@bibch.ru+7(4967)73-08-93

Ранее здесь работали:

Матвеев Сергей Валентинович, к. ф.-м. н.н.с.sergey.matveev@uky.edu

Избранные публикации

  1. Sobolev E.V., Danilkovich A.V., Udovichenko I.P., Lipkin V.M., Tikhonov D.A. (2013). Methods of the theory of liquids as an efficient approach to the analysis of polar peptide complexes. Doklady Physical Chemistry 450 (1), 122–5 [+]

    Применение метода средней матрицы позволило использовать модель взаимодействующих центров масс (RISM) для определения энергии взаимодействия комплексов протофиламентов ряда самоорганизующихся пептидов по результатам анализа траекторий состояний молекул и комплексов пептидов на отрезке 10 н.с.

    ID:964
  2. Соболев Е.В., Данилкович А.В., Тихонов Д.А. (2012). Метод интегральных уравнений теории жидкостей в приближении RISM для исследования термодинамики самоорганизующихся ионных пептидов. Математическая биология и биоинформатика 7 (2), 493–507 [+]

    Была применена модификация метода RISM с использованием средней матрицы внутримолекулярных корреляционных функций.  Для расчетов свободной энергии, наряду с приближенными формулами был использован метод численного термодинамического интегрирования. Сравнение результатов расчетов свободной энергии разными способами показало, что использование метода термодинамического интегрирования позволяет получить наиболее адекватные величины энергий взаимодействия пептидных наноструктур в составе протофиламента.

    ID:965
  3. Данилкович А.В., Соболев Е.В., Тихонов Д.А., Шадрина Т.Е., Удовиченко И.П. (2011). Молекулярная динамика комплексов самоорганизующихся ионных пептидов (RADA)4. Математическая биология и биоинформатика 6 (1), 92–101 [+]

    По результатам молекулярного моделирования (MD) комплексов H-(RADA)4-OH на временном отрезке 10 нс отмечено, что с увеличением размеров надмолекулярных структур повышается стабильность антипараллельных β-структур пептидов и межмолекулярных водородныхc связей. Показано также, что наибольшие величины флуктуаций атомарных координат пептидного остова характерны для аминокислотных остатков, расположенных на флангах молекул пептидов. Сделан вывод о том, что минимально достаточной структурой протофиламента может выступать тетрамер H-(RADA)4-OH, в котором пептиды находятся в антипараллельной β-конформации, а также комплексы более высокого уровня, при формировании которых определяющую роль играют гидрофобные взаимодействия остатков аланинов, слагающих «внутренний слой» структур тетрамеров и формирующегося филамента.

    ID:962
  4. Данилкович А.В., Соболев Е.В., Тихонов Д.А., Удовиченко И.П. (2011). К вопросу о выборе потенциальных полей для изучения молекулярной динамики ионных пептидов и их димеров. Математическая биология и инфрматика 6 (1), 53–62 [+]

    Показано, что моделирование в условиях явного водного окружения наиболее информативно по сравнению с неявными методами, при этом использование различных полей сил оказывает существенное влияние на стабильность исходной конформации пептидной молекулы во времени. Сделан вывод о том, что модельная среда ff99SB обеспечивает большую стабильность антипараллельных β-структур в составе димера при 300К, в то время как ff96 не только обеспечивает наибольшую устойчивость исходной конформации пептида к изменению температуры, но также обладает высоким потенциалом удержания молекулой пептида антипараллельной β-конформации, определяющей способность

    NH2-(RADA)4-COOH к самоорганизации.

    ID:963
  5. Danilkovich A.V., Lipkin V.M., Udovichenko I.P. (2011). [Classification of self-organizing peptides]. Bioorg. Khim. 37 (6), 780–5 [+]

    Amino acid sequences of known natural and synthetic self-assembling peptides were searched and analyzed for their characteristic patterns. The attempted formal numerical description of the repeating motifs, which have been revealed, resulted in building of general classification system embracing core-sequences of the peptides capable of nanostructure formation. Advantages and potency of the proposed rational classification were demonstrated via its comparison with the output from the earlier system described by the others.

    ID:950

Липкин Валерий Михайлович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. ФИБХ, комн. БОН/203
  • Тел.: +7(4967)79-39-71
  • Эл. почта: vmlipkin@ibch.ru