Списки аспирантов и портфолио

109

Палкина Ксения Андреевна

Дата начала обучения 2017-10-02
Дата окончания обучения 2021-10-01
Руководитель Ямпольский Илья Викторович
Специальность Молекулярная биология [03.01.03]
Статус Обучается

Отчеты аспиранта

0 год обучения (2017)

ОБОСНОВАНИЕ ТЕМЫ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

_____Гиспидин является типичным вторичным метаболитом грибов и растений, который при ферментативном окислении преобразуется в гидроксигиспидин, или люциферин. Люциферин же при окислении кислородом воздуха в ходе катализируемой люциферазой реакции способен производить свечение в видимой области. За биосинтез гиспидина в основном отвечают гиспидин-синтазы в грибных организмах и поликетидсинтазы в растениях, при этом в процессе биосинтеза могут образовываться различные побочные и производные продукты, обладающие разнообразной биологической активностью, имеющие антиоксидантные и антибиотические свойства. Ферменты биосинтеза гиспидина и его аналогов являются объектом пристального внимания исследователей различных биохимических, молекулярнобиологических и фармацевтических направлений. Широкая распространенность гиспидина среди растений и грибов, а также существование похожих соединений среди метаболитов растений может являться потенциальным фундаментом для создания автономной люминисцентной биоинженерной системы.

1 год обучения (2018)

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Российской академии наук



 

Отчет за 1 семестр

аспиранта 1 года обучения лаборатории Химии метаболических путей

Специальность: 03.01.03 Молекулярная биология



 

Тема: “Ферменты биосинтеза поликетида гиспидина из кофейной кислоты”



 

Аспирант:

Палкина К.А.

 

Руководитель:

д.х.н. Ямпольский И.В.



 

Москва 2018

Гиспидин является типичным вторичным метаболитом грибов и растений, который при ферментативном окислении преобразуется в 3-гидроксигиспидин, или люциферин, способный под действием люциферазы и кислорода производить свечение в видимой области. Поликетидсинтазы (PKS) являются одними из основных ферментных систем, участвующих в биосинтезе поликетидов с разнообразными структурами и биологической активностью. Помимо своей биологической роли PKS обладают еще и важными фармакологическими свойствами и сельскохозяйственным значением. Внимание к ним в последнее время обостряется в связи с тем, что они являются перспективными мишенями для синтетической биологии.

Основываясь на данных литературы нами были отобраны 13 генов растительных PKS (Wang X. et al., 2017; Akiyama T. et al., 1999; Colpitts C. C. et al., 2011; Guo Y. W. et al., 2013; Shimokawa Y., 2010; Samappito S., 2003; Brand S. et al., 2006) и заклонированы в вектор pGAPZ для трансформации дрожжей Pichia pastoris (рис.1). Клонирование проводили с помощью классической реакции ПЦР и рестрикции по BstBI и SpeI, а также по методике модульного клонирования (Moore S. J. et al. 2016). Полученные плазмиды линеаризовали по сайту узнавания рестриктазы по Avr II и проводили трансформацию штамма Pichia pastoris, конститутивно экспрессирующего гены 4CL (4-кофеоил-КоА-лигазы), H3H (гиспидин-3-гидроксилазы) и Luz (люциферазы). Положительный ответ на кофейную кислоту продемонстрировали дрожжи, трансформированные векторами, экспрессирующими гены  PKS 1, PKS 2, PKS 3, PKS 4, PKS 5, PKS 6 и PKS 7, причем наиболее яркими были дрожжи, экспрессирующие вектора, кодирующие PKS 3 и PKS 4.

Наиболее яркие в эксперименте с дрожжами поликетидсинтазы были отобраны для клонирования в вектор для временной экспрессии pTurboYFP-C (http://evrogen.ru/products/TurboYFP/TurboYFP.shtml) вместо гена флуоресцентного белка. Рестрикцию проводили по сайтам узнавания рестриктаз Nhe I и Hind III. ПЦР-продукт и вектор после обработки рестриктазами лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (Евроген), трансформировали в бактериальные клетки и высевали на селективную среду. Правильность генетической вставки определяли с помощью автоматического секвенирования по Сэнгеру (Евроген). Полученные вектора назвали C-PKSN, где N - номер закодированной генетической вставкой

поликетидсинтазы.

С составленными плазмидами, а также плазмидами ранее полученными в нашей лаборатории планируется провести трансфекцию с клетками НЕК 293Т.

 

 

Рис.1. Схема плазмиды pGAPZ-PKS1 собранной для трансформации дрожжей Pichia pastoris.

Используемая литература:

 

Akiyama T., Shibuya, M., Liu, H. M., & Ebizuka, Y., p‐Coumaroyltriacetic acid synthase, a new homologue of chalcone synthase, from Hydrangea macrophylla var. thunbergii //The FEBS Journal. – 1999. – Т. 263. – №. 3. – С. 834-839.

Brand S., Hölscher, D., Schierhorn, A., Svatoš, A., Schröder, J., & Schneider, B. A type III polyketide synthase from Wachendorfia thyrsiflora and its role in diarylheptanoid and phenylphenalenone biosynthesis //Planta. – 2006. – Т. 224. – №. 2. – С. 413-428.

Colpitts C. C., Kim, S. S., Posehn, S. E., Jepson, C., Kim, S. Y., Wiedemann, G., Suh, D. Y. PpASCL, a moss ortholog of anther‐specific chalcone synthase‐like enzymes, is a hydroxyalkylpyrone synthase involved in an evolutionarily conserved sporopollenin biosynthesis pathway //New Phytologist. – 2011. – Т. 192. – №. 4. – С. 855-868.

Guo Y. W., Guo, H. L., Li, X., Huang, L. L., Zhang, B. N., Pang, X. B., Wang H. Two type III polyketide synthases from Polygonum cuspidatum: gene structure, evolutionary route and metabolites //Plant biotechnology reports. – 2013. – Т. 7. – №. 3. – С. 371-381.

Moore S. J., Lai, H. E., Kelwick, R. J., Chee, S. M., Bell, D. J., Polizzi, K. M., & Freemont, P. S. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology //ACS synthetic biology. – 2016. – Т. 5. – №. 10. – С. 1059-1069.

Samappito S., Page, J. E., Schmidt, J., De-Eknamkul, W., & Kutchan, T. M. Aromatic and pyrone polyketides synthesized by a stilbene synthase from Rheum tataricum☆ //Phytochemistry. – 2003. – Т. 62. – №. 3. – С. 313-323.

Shimokawa Y., Morita H., Abe I. Structure-based engineering of benzalacetone synthase //Bioorganic & medicinal chemistry letters. – 2010. – Т. 20. – №. 17. – С. 5099-5103.

Wang X.,  Zhang Z., Dong X., Feng Y., Liu X., Gao B., Wang J., Zhang L., Wang J., Shi S., Tu P., Identification and functional characterization of three type III polyketide synthases from Aquilaria sinensis calli //Biochemical and biophysical research communications. – 2017. – Т. 486. – №. 4. – С. 1040-1047.

 

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Российской академии наук



 

Отчет за 2 семестр

аспиранта 1 года обучения лаборатории Химии метаболических путей

Специальность: 03.01.03 Молекулярная биология



 

Тема: “Ферменты биосинтеза поликетида гиспидина из кофейной кислоты”



 

Аспирант:

Палкина К.А.

 

Руководитель:

д.х.н. Ямпольский И.В.



 

Москва 2018

 

Ранее в нашей лаборатории было обнаружено, что за синтез гиспидина, предшественника люциферина, в грибах ответственны крупные многодоменные ферментативные комплексы поликетидсинтаз (PKS) I типа. С точки зрения молекулярно-биологических и генно-инженерных манипуляций, работа с такими гигантскими белковыми конструкциями представляет для исследователя определенные трудности. Ферменты, отвечающие за биосинтез гиспидина в растениях, неизвестны, но мы предполагаем, что искать их надо среди PKS III типа. Кроме того, в последнее время появляется много данных свидетельствующих о том, что PKS этого семейства более удобны для клонирования и оптимизации синтетических реакций (Lim Y.P. et al. 2016; Cai W. & Zhang W., 2018). Растительные PKS III типа лучше всего исследованы и описаны, однако, способны ли PKS синтезировать гиспидин, еще предстоит установить.

PKS III типа используют в качестве субстрата различные KoA-производные, в первую очередь кофеоил-КоА и малонил-КоА (Shimizu Y. et al. 2017). В связи с этим обычно PKS работают вместе со вспомогательным ферментом 4-кумароил-КоА-лигазой (4CL), катализирующей синтез кофеоил-КоА из кофейной кислоты (рис.1) (Rastogi S. et al. 2013). Другим важным ферментом, поставляющим PKS другой субстрат - малонил-КоА, служащий удлиняющим звеном, является ацетил-КоА-карбоксилаза (рис.1) (Choi J. & Da Silva N.A. 2014). Мы предполагаем, что два эти фермента могут помочь нам оптимизировать биосинтез гиспидина.

74zt3OpksuOdV_D7GjgVwwBV_DSnOVyBFAV_LXpmgYFXMJleX51OKup_Eo3V-D89EOFibJiKBQBnZa_vHicgYLOZWA9L65ofi9XKra_1NTJLMLXrgXi6xdF-HdrygRzLnyvNAzGN

Рис.1. Схема реакций со вспомогательными ферментами PKS: 4CL (4-кумароил-КоА-лигазой) и ACC (ацетил-КоА-карбоксилазой).

 

Таким образом, согласно литературным данным, нами была отобрана 4CL из Arabidopsis thaliana и её ген был клонирован в вектор для временной экспрессии pTurboYFP-C (http://evrogen.ru/products/TurboYFP/TurboYFP.shtml) вместо гена флуоресцентного белка. Рестрикцию проводили по сайтам узнавания рестриктаз Nhe I и BstB I, затем затупливали липкие концы с помощью большого фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E. coli и проводили рестрикцию обоих векторов по сайту узнавания рестриктазы Xho I. Полученные продукты лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (Евроген), трансформировали в бактериальные клетки и высевали на селективную среду. Правильность генетической вставки определяли с помощью автоматического секвенирования по Сэнгеру (Евроген). Полученный вектор назвали C-4CL (рис.2).

 

Рис.2.Схема плазмиды pС-4СL, собранной для временной трансфекции клеток млекопитающих HEK293T.

 

Ген АСС1 клонировали в вектор pTurboYFP-N (http://evrogen.com/products/vectors/pTurboYFP-N/pTurboYFP-N.shtml) вместо гена флуоресцентного белка. Для амплификации гена АСС1 с матрицы плазмиды рAW (https://www.addgene.org/64745/) использовали ПЦР со специфических праймеров. Полученный ПЦР-продукт и pTurboYFP-N линеаризовали, соответственно, по сайтам узнавания рестриктаз Xho I и Not I. Затем их лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (Евроген), трансформировали в бактериальные клетки и высевали на селективную среду. Правильность генетической вставки определяли с помощью автоматического секвенирования по Сэнгеру (Евроген).  Полученный вектор назвали N-ACC (рис.3).

 

Рис.3. Схема плазмиды pN-ACC1, собранной для временной трансфекции клеток млекопитающих HEK293T.

 

С составленной плазмидой C-4CL, а также плазмидами С-nnLuz и C-H3H, полученными в нашей лаборатории ранее и кодирующими, соответственно, люциферазу и гиспидин-3-гидроксилазу гриба Neonothopanus nambi, а также плазмидами C-PKS3, содержащей ген растительной PKS III типа из Hydrangea macrophylla (Akiyama T. et al. 1999),  провели пробную трансфекцию с клетками НЕК293Т (рис.4). Трансфекцию проводили с использованием реактива FuGene6 (Promega) в Optimem в течение 4 часов. Через 18 часов клетки, не лизируя, снимали с подложки и ресуспендировали в DPBS. Затем регистрировали люминесценцию при добавлении к суспензии клеток кофейной кислоты до конечной концентрации 2,75 мМ с помощью люминометра  GloMax (Promega).

IK5uIeSiSjOJmyRxQzSFcGLMWL6evwYMwgQcb2yNV_GHvjZhcHNFteCm5tCFhrn3vHp1ON-49Le-H8BsuE4lXE7g_Yz3Fx3W64M9ozgqX1Poak5Yl4WW8OlouvAuDGxRA4Ta2bL9

Рис.4. Схема биосинтеза люциферина грибов из кофейной кислоты.

 

В ходе работы нами были созданы 2 новые плазмиды для экспрессии в эукариотических клетках генов вспомогательных ферментов PKS: 4CL, ACC. Кроме того, нам удалось установить, что при добавлении кофейной кислоты к клеткам, котрансфицированным плазмидами C-4CL, C-PKS3, C-H3H и C-nnLuz,  происходит увеличение люминесценции, в то время как добавление кофейной кислоты к контрольным клеткам, не содержащим никаких плазмид, не вызывает свечения совсем (рис.5). Полученный результат может свидетельствовать о том, что наша система биосинтеза люциферина грибов из кофейной кислоты в клетках млекопитающих функциональна (рис.4).

Влияние гена АСС1 на биосинтез гиспидина еще предстоит проанализировать.

nhLfnDl13etLg2vzt8snbaKPCJg6WofAPj9ptble6kWNMKew-6weeQpIIShqdvRlS983gaDsuFxZmSskGEShIc2SAG_OG2uhCQYijFz0cdz79yfVZjG3kHn40ju5TpDZBCDYlEfu

Рис.5. Реакция клеток HEK293T, трансфицированных pC-nnLuz, pC-H3H, pC-PKS3, pC-4CL, на добавление кофейной кислоты.

 

Список литературы:

Akiyama T., Shibuya, M., Liu, H. M., & Ebizuka, Y. p‐Coumaroyltriacetic acid synthase, a new homologue of chalcone synthase, from Hydrangea macrophylla var. thunbergii //European journal of biochemistry. – 1999. – Т. 263. – №. 3. – С. 834-839.

Cai W., Zhang W. Engineering modular polyketide synthases for production of biofuels and industrial chemicals //Current opinion in biotechnology. – 2018. – Т. 50. – С. 32-38.

Choi J. W., Da Silva N. A. Improving polyketide and fatty acid synthesis by engineering of the yeast acetyl-CoA carboxylase //Journal of biotechnology. – 2014. – Т. 187. – С. 56-59.

Lim Y. P., Go M. K., Yew W. S. Exploiting the biosynthetic potential of type III polyketide synthases //Molecules. – 2016. – Т. 21. – №. 6. – С. 806.

Rastogi S., Kumar, R., Chanotiya, C. S., Shanker, K., Gupta, M. M., Nagegowda, D. A., & Shasany, A. K. 4-Coumarate: CoA ligase partitions metabolites for eugenol biosynthesis //Plant and cell physiology. – 2013. – Т. 54. – №. 8. – С. 1238-1252.

Shimizu Y., Ogata H., Goto S. Type III polyketide synthases: functional classification and phylogenomics //ChemBioChem. – 2017. – Т. 18. – №. 1. – С. 50-65.

 

2 год обучения (2019)

 

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Российской академии наук



 

Отчет за 3 семестр

аспиранта 2 года обучения лаборатории Химии метаболических путей

Специальность: 03.01.03 Молекулярная биология



 

Тема: “Ферменты биосинтеза поликетида гиспидина из кофейной кислоты”



 

Аспирант:

Палкина К.А.

 

Руководитель:

д.х.н. Ямпольский И.В.



 

Москва 2019

 

Ранее в нашей лаборатории были созданы 13 плазмид, содержащих гены растительных поликетидсинтаз (PKS), отобранных нами по литературным данным, для экспрессии в дрожжевой культуре Pichia pastoris, которая уже конститутивно экспрессировала гены ферментов биосинтеза люциферина из кофейной кислоты: люциферазы грибов (NNLuz), гиспидин-3-гидроксилазы (Н3Н), 4-кумароил-КоА-лигазы (4СL) (рис.1).

CkaAcuf4uajm5zff3lCdmq9zbP-nFeP4RuxZlyelfU4KnH_oFqaRramitbw9B_xCuhzayTz88eHNCyiS2_JtGEGbo36jbLvOLScSx4atMgM4Q97fEMnC7GjIEr3gruGSHx_3JUk0

Рис.1. Схема биосинтеза люциферина грибов из кофейной кислоты с помощью поликетидсинтаз растений.

m94UpnkshXb11vQvdz1rMiw0QEDxjQUKfndileJ5e-ETl05le-gKPvm3zZGKALhKme7tU3D4TgPwUipmUGVtRk-1dUYlS7fc9k0YsrN0wLD38CQHXxA8Ao2swYsUFbqMBefVIeRh

Рис.2. Сравнение 13 растительных поликетидсинтаз в клетках дрожжей Pichia Pastoris по уровню люминесценции при добавлении кофейной кислоты к клеткам.

 

Гены 7 поликетидсинтаз приводящих к люминесценции рекомбинантных дрожжей мы отобрали для клонирования в вектор для временной экспрессии в клетках млекопитающих НЕК293Т. С составленными плазмидами, а также плазмидами, содержащими Н3Н, NNLuz и 4CL мы провели котрансфекцию клеток НЕК293Т. Кроме того, в клетках млекопитающих удалось сравнить PKS14 и PKS15 из перца опьяняющего (Piper methysticum), которые ранее не были анализированы в клетках дрожжей.  Для отбора эффективных поликетидсинтаз мы планировали ориентироваться на люминесцентный сигнал при добавлении кофейной кислоты. Клетки не лизировали, а снимали с чашки и ресуспендировали в фосфатном буфере (DPBS). Измерение люминесценции проводили при добавлении к ресуспендированным клеткам расствора кофейной кислоты на люминометре GloMAX (Promega). Результаты измерений представлены на рисунке 3.

8co0TlKkLdFozOCe0V6xZt_SHpNAdkgO43d9v91uEdgzjFH9opPjBbb6EGl8cGQXmWGxB9kniUasqbF_i3OtFXuTMvhRsKv05Mo_YQSyKDQ6dFStw7Y4NJyRHWqGb7uHutuH00vH

Рис.3. Сравнение 9 растительных поликетидсинтаз в клетках млекопитающих HEK293T по уровню люминесценции при добавлении кофейной кислоты к клеткам.

 

По полученным данным клетки, экспрессирующие гены PKS14 и PKS15, не отвечали на добавление кофейной кислоты. Не отвечали на добавление кофейной кислоты образцы с PKS1 и PKS2 из аквиларии китайской (Aquilaria sinensis), хотя в эксперименте с дрожжами они были одними из наиболее ярких. Клетки, содержащие поликетидсинтазы PKS3 из гортензии крупнолистной (Hydrangea macrophylla) и PKS4 резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana), наиболее ярко отвечали на добавление кофейной кислоты, как и в эксперименте с дрожжевой культурой.

Кроме того, мы сравнили одну из наиболее эффективных PKS3 с гиспидинсинтазой грибов (HispS) в клетках млекопитающих НЕК293Т, при этом значительной разницы в уровне люминесценции мы не наблюдали (рис.4). Напротив, при сравнении этих ферментов в клетках дрожжей Pichia pastoris было обнаружено, что система с растительным ферментом демонстрирует увеличение люминесценции по сравнению с системой, основанной на ПКС грибов.3-jcJQs4kEBspTNGotI6DchQ19pKSRLVzSBrjNi6taI0nnQ1ZtDNRjWZMWJ-blEezKHb4J31xeDE0DljbNm5FtRtzq1lWTq-mbDr_Vn44wnCVI31wAdmbaA4JHQZsrvE0brINSXD

Рис.4. Сравнение наиболее эффективной PKS3 из Hydrangea macrophylla с гиспидинсинтазой грибов (HispS) в клетках млекопитающих HEK293T и в клетках дрожжей Pichia pastoris по уровню люминесценции при добавлении кофейной кислоты к клеткам.

 

Таким образом по результатам работы сделаны следующие выводы:  

 

  1. Система, включающая в себя 4 гена биосинтеза люциферина из кофейной кислоты, функциональна в клетках млекопитающих НЕК293Т и в дрожжевой культуре Pichia pastoris, как с гиспидинсинтазой грибов, так и с растительными поликетидсинтазами

  2. Дрожжевая культура Pichia pastoris, трансформированная генами биосинтеза люциферина из кофейной кислоты, и генами PKS8 из Rheum tataricum, PKS9 из Wachendorfia thyrsiflora, PKS10, PKS11, PKS12 и PKS13 из Equisetum arvense, не отвечает увеличением люминесценции на добавление кофейной кислоты

  3. Клетки млекопитающих НЕК293Т, трансфицированные генами биосинтеза люциферина из кофейной кислоты, и генами PKS1 и PKS2 из Aquilaria sinensis и PKS14, PKS15 из Piper methysticum, также не реагируют на добавление кофейной кислоты

  4. Клетки млекопитающих НЕК293Т, трансфицированные генами биосинтеза люциферина из кофейной кислоты, включая гиспидинсинтазу грибов и наиболее эффективную растительную поликетидсинтазу, реагируют на добавление кофейной кислоты схожим образом

  5. В клетках дрожжей Pichia pastoris растительные поликетидсинтазы демонстрируют увеличение люминесценции по сравнению с гиспидинсинтазой грибов

  6. Наиболее яркими поликетидсинтазами и в клетках НЕК293Т и в клетках дрожжей Pichia pastoris, по нашим данным, являются PKS3 из Hydrangea macrophylla и PKS4 из Arabidopsis thaliana


 

В наши дальнейшие планы по оптимизации биосинтеза гиспидина входит проверка работы PKS14 и PKS15 в клетках дрожжей Pichia pastoris, а также создание белка слияния 4CL с наиболее яркими PKS. Согласно литературным данным подобный белок слияния может привести к увеличению продуктивности реакции в несколько раз. Мы планируем сравнить работу такого белка слияния с работой отдельных плазмид, содержащих отдельные белки 4CL и PKS3/PKS4, в клетках дрожжей Pichia pastoris и клетках млекопитающих HEK293T. Также в дальнейшем мы планируем создание стабильной клеточной линии с оптимизированным биосинтезом гиспидина.

 

 

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Российской академии наук



 

Отчет за 4 семестр

аспиранта 2 года обучения лаборатории Химии метаболических путей

Специальность: 03.01.03 Молекулярная биология



 

Тема: “Ферменты биосинтеза поликетида гиспидина из кофейной кислоты”



 

Аспирант:

Палкина К.А.

 

Руководитель:

д.х.н. Ямпольский И.В.



 

Москва 2019

 

Одним из подходов оптимизации биосинтеза различных метаболитов является создание белков слияния (фьюзов). Фьюз представляет собой крупный полипептид, включающий в себя 2 белка, соединенных между собой линкером. Считается, что такая стратегия позволяет имитировать колокализацию ферментов в клетках и/или располагать активные центры белков, в которых образуются промежуточные соединения, в непосредственной близости друг от друга, что приводит к увеличению эффективности системы (Zhang Y. et al. 2006). Кроме того, преимуществом таких конструкций является то, что они сокращают количество векторов для гетерологической коэкспрессии, что в случае нашей работы является особенно ценным. На сегодняшний день фьюзы широко применяют для различных экспериментальных задач, начиная от изменения характеристик отдельного белка, таких как, например, локализация, и заканчивая анализом переноса энергии между донором и акцептором (FRET, BRET). Однако применение технологии создания белка слияния не всегда приводит к ожидаемому прогрессу. Так фолдинг некоторых белков является настолько сложным процессом, что добавление к ним полипептида на С- или N-конец приводит к полной или частичной потере ферментативной активности. Несмотря на то, что в некоторых случаях, такая проблема решается (полностью или частично) подбором линкеров, создание белков слияния нельзя назвать универсальным методом. Основываясь на данных литературы, мы обнаружили, что для биосинтеза поликетида ресвератрола ранее было успешно продемонстрировано увеличение эффективности биосинтеза в несколько раз путем создания фьюза стильбен синтазы из Vitis vinifera и 4-кумароил-КоА-лигазы (4СL) из Arabidopsis thaliana, соединенных через 3-х аминокислотный линкер (GSG) (Wang Y. et. al. 2011).  

Еще одним подходом, который широко используется для оптимизации биосинтеза метаболитов, является создание плазмид, приводящих к уменьшению количества экспрессионных векторов. Среди таких методов пользуется популярностью создание фьюзовых конструкций, белки в которых соединены между собой 2А-пептидами в качестве линкера. В геноме многих пикорнавирусов 2А-пептиды разделяют структурные и неструктурные элементы и имеют размер около 20 аминокислот (Agol, V. I., & Gmyl, A. P., 2010). У разных представителей пикорнавирусов N-концевые аминокислотные участки могут различаться достаточно сильно, при этом C-концевой фрагмент достаточно консервативен и содержит классический 4 аминокислоты NPGP. Данный участок котрансляционно расщепляется и приводит к образованию отдельных белков в соотношении примерно 1:1 (Donnelly M. L. L. et al. 2001; Liu Z. et al. 2017). Высокий уровень коэкспрессии трансгенов, возможность коэкспрессии трех и более цистронов и относительно небольшой размер 2А-пептида позволяют широко применять его в различных биотехнологических проектах (Szymczak A. L. et al. 2004; de Felipe P. et al. 2006). Однако, процессинг 2А-пептидов происходит не всегда эффективно, в связи с этим, есть вероятность того, что часть белков так и останутся соединены линкерами во фьюзе, что скорее всего снизит эффективность их работы.

В нашей работе мы хотели проанализировать все три описанных выше подхода по увеличению эффективности биосинтеза метаболитов. Ранее нами было установлено, что наиболее эффективными в дрожжевой культуре Pichia pastoris и в эукариотических клетках НЕК293Т являются поликетидсинтазы из Hydrangea macrophylla (PKS3) и Arabidopsis thaliana (PKS4). Мы хотели проверить, приведет ли создание фьюза отобранных нами PKS и 4CL к увеличению эффективности биосинтеза гиспидина из кофейной кислоты. Для этого с помощью классических методов клонирования мы создали генетические конструкции, эффективность работы которых в дальнейшем мы планируем проверить в дрожжевой культуре Pichia pastoris, конститутивно экспрессирующей гены люциферазы грибов (NNLuz) и гиспидин-3-гидроксилазы грибов (H3H). Клонирование генетической конструкции проводили в вектор с зеоциновой усточнивостью pGAPZ-RFP вместо гена флуоресцентного белка. В ходе работы рестрикцию вестора и ПЦР-продукта проводили по сайтам узнавания BstI и SpeI с помощью аналогов этих рестриктаз компании SibEnzyme. Затем полученные фрагменты лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (Евроген), трансформировали в бактериальные клетки и высевали на селективную среду. Правильность генетической вставки определяли с помощью автоматического секвенирования по Сэнгеру (Евроген). Полученные вектора, кодирующие соответствующие фьюзы назвали pGAPZ-4CL-GSG-PKS3 и pGAPZ-4CL-GSG-PKS4. Схема созданной плазмиды приведена на рис.1. qh9DbzgNyP_23BrtIPvZpCpZJQcivy5nIX0RxPxDzlXrXDdo9fes2_SDYSjAJgtkuY6f3EeawALMLiSTWeFpld5bPV18HIF61b-o2X_HwgaLnh1fJXvZXk10C2-g106WT7sJAlMW

Рис.1. Схема плазмиды pGAPZ-4CL-GSG-PKS3, созданной для трансформации дрожжевой культуры Pichia pastoris.

 

Кроме того, мы создали бицистронный вектор, включающий в себя ген 4CL соединенный с PKS3/PKS4 через 2А-пептид. Данная конструкция была клонирована в вектор для временной экспрессии pTurboYFP-C (http://evrogen.ru/products/TurboYFP/TurboYFP.shtml) вместо гена флуоресцентного белка. Рестрикцию проводили по сайтам узнавания рестриктаз NheI и HindIII (ThermoFisher). Полученные продукты лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (Евроген), трансформировали в бактериальные клетки и высевали на селективную среду. Правильность генетической вставки определяли с помощью автоматического секвенирования по Сэнгеру (Евроген). Полученный вектор назвали pC-4CL-2A-PKS3 и pC-4CL-2A-PKS4 (рис.2). Эффективность такого подхода мы планируем проанализировать в дальнейшем на клетках млекопитающих НЕК293Т, проводя котрансфекцию новых созданных плазмид и векторов, содержащих гены NNLuz и H3H.

uzA3lZSw5y1c19SiG-JvyF6EuVervr5b40zLK8ujYhCvecMVdJcOckukJ1xKvFJy9J_awRbCu9e-PdCHd-TFC2APklA8If2lX3vXNKfrdZUhFfFi-Sw9MmQ34yg83sB5wDmfsOlP

Рис.2. Схема плазмиды pC-4CL-2A-PKS3, созданной для временной трансфекции клеток млекопитающих НЕК293Т.

 

Список литературы:

Agol V. I., Gmyl A. P. Viral security proteins: counteracting host defences //Nature Reviews Microbiology. – 2010. – Т. 8. – №. 12. – С. 867.

De Felipe P., Luke, G. A., Hughes, L. E., Gani, D., Halpin, C., & Ryan, M. D. E unum pluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein //Trends in biotechnology. – 2006. – Т. 24. – №. 2. – С. 68-75.

Donnelly M. L. L.,  Hughes, L. E., Luke, G., Mendoza, H., ten Dam, E., Gani, D., & Ryan, M. D. The ‘cleavage’activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’sequences //Journal of General Virology. – 2001. – Т. 82. – №. 5. – С. 1027-1041.

Liu Z., Chen, O., Wall, J. B. J., Zheng, M., Zhou, Y., Wang, L., Liu, J. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector //Scientific reports. – 2017. – Т. 7. – №. 1. – С. 2193.

Szymczak A. L., Workman, C. J., Wang, Y., Vignali, K. M., Dilioglou, S., Vanin, E. F., & Vignali, D. A. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single'self-cleaving'2A peptide–based retroviral vector //Nature biotechnology. – 2004. – Т. 22. – №. 5. – С. 589.

Wang Y., Wang M., Yu O., Jez J. M. Structural and kinetic analysis of the unnatural fusion protein 4-coumaroyl-CoA ligase:: stilbene synthase //Journal of the American Chemical Society. – 2011. – Т. 133. – №. 51. – С. 20684-20687.

Zhang Y.,  Li, S. Z., Li, J., Pan, X., Cahoon, R. E., Jaworski, J. G., Yu, O.  Using unnatural protein fusions to engineer resveratrol biosynthesis in yeast and mammalian cells //Journal of the American Chemical Society. – 2006. – Т. 128. – №. 40. – С. 13030-13031.