Списки аспирантов и портфолио

112

Спеченкова Надежда Андреевна

Дата начала обучения 2017-10-02
Дата окончания обучения 2021-10-01
Руководитель Тальянский Михаил Эммануилович
Специальность Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) [03.01.06]
Статус Обучается

Отчеты аспиранта

0 год обучения (2017), 0 семестр

ОБОСНОВАНИЕ  ТЕМЫ  ДИССЕРТАЦИОННОЙ  РАБОТЫ

 

В последнее время появился широкий спектр научной информации, свидетельствующей о существенной роли клеточного ядра и субъядерных структур в защите эукариотических организмов, и в том числе растений, от экологических стрессов и болезней. В частности, был идентифицирован ряд белков ядрышка и телец Кахаля, контролирующиx устойчивость растений к вирусам и абиотическим стрессам.

Целью данной диссертационной работы является глобальный протеомный анализ белков ядра растений картофеля до и после воздействия комбинированного биотического и абиотического стресса. В качестве биотического стресса предполагается инфицирование растений картофеля вирусом У картофеля (PVY) и бактерией Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus (Cms) на фоне повышенных температур в качестве абиотического (экологического) стресса. Предварительная работа, проведённая в ФИБХ РАН, позволила отобрать сорта картофеля, контрастные по физиологической реакции на данный комплексный стресс, которые и будут использованы в качестве основных объектов исследования.

Предполагается провести сравнительный анализ протеомов ядра контрастных сортов до и после воздействия комбинированным стрессом. В результате работы будут идентифицированы стресс-зависимые (up- и down-регулируемые) ядерные белки, а также белки посттрансляционно-модифицируемые или ре-локализуемые  под воздействием стресса. Дальнейший биоинформатический анализ позволит выявить наиболее подходящие белки-мишени, контролирующие устойчивость растений к комплексному стрессу. Экспериментальное доказательство функций данных генов будет получено при их пониженной (knock-down RNAi или knock-out геномное редактирование) или гипер-экспрессии в трансгенных растениях. В результате работы будет получена коллекция генов картофеля для дальнейшего использования в селекционных программах.

 

1 год обучения (2018), 1 семестр

Проведена оптимизация метода выделения ядерных белков для проведения протеомного анализа. 

Завершён суммарный протеомный анализ здоровых растений контрастных сортов картофеля Гала и Чикаго и растений, заражённых У-вирусом картофеля при нормальной и повышенной температуре.

Осуществляется подбор литературы по изучению протеома картофеля в норме и в условиях различных стрессов.

1-й семестр:

Отчёт за 1 семестр+выписка

Отчёт о научно-исследовательской практике с отзывом научного руководителя

Публикация "First Report of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Infecting Sugar Beet in Russia"

 

2 год обучения (2019), 3 семестр

В соответствии с индивидуальным планом был проведён протеомный анализ контрастных сортов картофеля с использованием изобарных меток iTRAQ.

У устойчивого сорта Гала при нормальной температуре мы идентифицировали 59 дифференциально экспрессирующихся белков, принадлежащих к 43 белковым группам. Экспрессия 32 групп падала по сравнению с контролем, а 11 групп росла. Из растущих белков можно отметить хлоропластные белки, участвующие в световой фазе фотосинтеза, такие как белки фотосистемы I и II, связывающий хлорофилл белок 6A, а также белки, участвующие в метиониновом цикле, например  S-аденозилметионин метилтрансфераза (SAMDM). Среди белков с пониженной экспрессией можно отметить глутанион-S-трансферазу, про которую известно, что изменение уровня её активности влияет на скорость размножения растительных патогенов (например, ослабление патогенных токсинов путём их коньюгации с глутатионом). Также падает экспрессия белка профилина, участвующего в регуляции динамики актина в цитоскелете.

При комплексном стрессе, то есть вирус + повышенная температура, количество меняющихся белков возрастает до 246 белковых групп, из которых 114 растут, 132 падают. Помимо растущих при нормальной температуре хлоропластных белков, здесь можно отметить цистатион бета лиазу (CBL), также свзязанную с метиониновым циклом. Растут белки теплового шока, белки, связанные с процессингом белка в ЭПС и с биосинтезом вторичных метаболитов. Из групп белков с пониженной экспрессией можно отметить кластер рибосомальных белков. Так как вирусы зависят от механизмов клетки-хозяина, в том числе и трансляции, мы видим снижение рибосомальных белков. Это является распространённой стратегией растений в реагировании на вирусную инфекцию. Как при нормальной, так и при повышенной температуре у сорта Гала наблюдается понижение экспрессии групп белков, ответственных за трансляционные и биосинтетические процессы.

У Чикаго, восприимчивого сорта, мы наблюдали слабый ответ на вирусную инфекцию при нормальной температуре. Всего 16 белковых групп. Растёт экспрессия таких белков, как супероксиддисмутаза, гистон H2A, фибриллин 8. Последний является членом семейства консервативных липидсвязывающих белков, которые индуцируются в условиях абиотического стресса. Как и у Галы здесь мы видим снижение экспрессии рибосомальных белков. Кроме того падают такие белки, как глутамин циклотрансфераза и моногидроаскорбат редуктаза.

Протеомный ответ на комплексный стресс был более выражен, идентифицировано 64 белковые группы. Из них 15 экспрессируются и 49 подавляются. Из растущих можно выделить следующие белки, связанные с реакцией на стресс - это кальретикулин, кислая эндохитиназа, 4й белок устойчивости к соли. Про снижающиеся белки можно сказать, что они задействованы в таких процессах, как трансляция, клеточный амидный метаболический процесс, амидный биосинтетический процесс.

 

3-й семестр:
Отчёт за 3 семестр+выписка

Отчёт о научно-исследовательской практике с отзывом научного руководителя (3 сем)

Публикация "First Report of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Infecting Potato in Russia"

3 год обучения (2020), 5 семестр

В результате сравнительного протеомного анализа двух контрастных по устойчивости сортов картофеля – Гала и Чикаго при заражении Y вирусом картофеля (YВК) и комплексном стрессе (вирус и повышенная температура) было установлено, что наиболее существенные изменения протеома инфицированных растений наблюдаются на 14-й день при повышенной температуре. Протеомный анализ с изобарными метками для относительного и абсолютного количественного анализа (iTRAQ) показал дифференциальную экспрессию большого числа белков в ответах на комбинированный стресс. Составлена база данных белков и потенциальных генов-мишеней, индуцируемых и подавляемых в условиях стресса.

Среди белков, определяющих устойчивость растений к вирусам и экологическим стрессам, обнаружен кластер белков, участвующих в контроле метаболизма и метилирования РНК, что позволяет предполагать участие некодирующих РНК в процессах индукции устойчивости растений к вирусам и стрессам.

Можно отметить группу белков, относящихся к метиониновому циклу. Известно, что продукты метионинового цикла являются донорами метильных групп для метилирования различных субстратов. Кроме того, метилирование вирусных РНК обеспечивает их распознавание защитными механизмами растения.

У чувствительного сорта (Чикаго) к восьмому дню опыта снижается представленность (fold change) 4 белков: S-аденозилметионин синтаза 1 (SAMS), сериновая гидроксиметил-трансфераза (SHM), аденозилгомоцистеиназа (SAH), метилентетрагидрофолат редуктаза (MTHFR). У устойчивого сорта (Гала) к 8dpi растёт представленность белков S-аденозилметионин метилтрансферазы (SAMDM) и цистатион β-лиазы (CBL) и снижается представленность метионин синтазы (MS). К 14 dpi растёт представленность белков SHM, SAMS и MS.

Были проанализированы уровни экспрессии генов некоторых из белков метионинового цикла методом количественной ПЦР в реальном времени. Сравнение полученных данных с результатами протеомного анализа показало, что снижение количества белков метионинового цикла у восприимчивого сорта Чикаго происходит на трансляционном, а не на транскрипционном уровне. Мы предполагаем, что восприимчивость к стрессам растений картофеля сорта Чикаго может быть связана с пониженным уровнем белков, участвующих в метилировании.

5-й семестр:

Отчёт за 5 семестр+выписка

Отчёт по педагогической практике (окт-дек 2019)

Учебно-методическое пособие для студентов

Тезисы "Поиск белковых маркеров устойчивости картофеля к комплексным стрессам" - симпозиум по итогам реализации мегагранта № 14.W03.31.0003 «Новые функции клеточного ядра и комплексная устойчивость растений картофеля к болезням и физиологическим стрессам 2017-2019 гг.

Тезисы «Поиск белковых маркеров устойчивости картофеля Solanum tuberosum к комплексным стрессам методом протеомного профилирования» и устный доклад на XXXII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».