Списки аспирантов и портфолио

23

Третьякова Дарья Сергеевна

Дата начала обучения 2015-11-01
Дата окончания обучения 2019-10-31
Руководитель Водовозова Елена Львовна
Специальность Биоорганическая химия [02.00.10]
Статус Обучается

Отчеты аспиранта

0 год обучения (2015)

Реферат для поступления в аспирантуру.

1 год обучения (2015)

Экспериментальная работа:

I семестр

Часть 1. Органический синтез

Объектом исследования являются липосомы, несущие в бислое липофильное пролекарство противоопухолевого препарата. В связи с этим был синтезирован диглицеридный конъюгат препарата метотрексата. Синтез включал три стадии, первая из которых представляла собой синтез п-нитрофенилового эфира йодуксусной кислоты.

Йодуксусную кислоту( 3,496 г/0,0188 моль) растворяли в 20 мл сухого хлороформа, прибавляли раствор п-нитрофенола ( 3,200 г/0,0230 моль) в сухом хлороформе (30 мл) и медленно прикапывали 8 мл DCC, охлаждая реакционную смесь на льду, затем добавили еще 1,5 мл конденсирующего агента-диизопропилкарбодиимида. Реакционную смесь оставляли при охлаждении и перемешивании на ночь. Далее отделяли образовавшуюся мочевину, промывали реакционную колбу сухим хлороформом и упаривали на роторе. Полученное целевое вещество промывали этилацетатом, отфильтровывали осадок, упаривали на роторе. После упаривания этилацетата, выкристаллизовавшуюся массу растворяли в гексане, отделяли декантацией полученный раствор от осадка. Осадок досушивали на роторном испарителе, затем промывали ацетоном с 1% CH3COOH, и добавляли подкисленную воду при перемешивании, вместе с тем наблюдали выпадение осадка. Осадок отфильтровали, высушили и затем перекристаллизовали из этанола при охлаждении до -70°С. Наблюдали образование нескольких видов кристаллов- коричневых, желтых и белых. Фракции разделили, отфильтровали и высушили. Получили слегка желтоватый мелкодисперсный пылеобразный, мягкий порошок. Выход реакции составил (самая чистая фракция)-33,7%. Данное вещество необходимо для дальнейшего синтеза производного.

 

Метотрексат перед модификацией выделяли из его лекарственного препарата, освобождением от мешающих превращению ионов натрия на ионообменной смоле, промывая колонку дегазированной водой, а затем раствором пиридина в метаноле с водой. Фракции с лекарством, упаривали, сушили и затем, полученный порошок вводили в реакцию.

 

В круглодонную колбу вносили полученную пиридиновую соль метотрексата (510 мг), прибавляли ДМСО, после растворения вносили 0,75 экв. предварительно прокаленного карбоната цезия. Оставляли перемешиваться в течение 4,5 часов в темноте. К полученной цезиевой соли прибавляли 1,1 эквивалент п-нитрофенилового эфира йодацетата, реакцию проводили в течение 15 минут, затем добавляли 2% уксусной кислоты от общего объема, чтобы загасить реакцию и нейтрализовать Cs+, так как реакция очень чувствительна к pH. Переносили полученную смесь в колбу на 500 мл, добавляли 250 мл диметилового эфира с 1% уксусной кислоты, перемешивали, декантировали, промывали эфиром несколько раз и упаривали на роторе. Далее приливали 300 мл системы CHCl3:CH3OH:H2O:CH3COOH (70:30:4:2) порциями , растворяли на УЗ-бане в течение 30 мин после каждого добавление системы. Так как в ходе реакции образуется множество побочных продуктов и остается непрореагировавшее вещество проводили отделение целевого продукта на колонке с силикагелем. Сначала добавляли 10 г Supercel, перемешивали и упаривали на роторе. Затем после лиофилизации суспендировали в хлороформе и наносили на колонку с силикагелем, промывая системами на основе компонентов CHCl3:CH3OH:H2O:CH3COOH со все увеличивающимся количеством метанола. Фракции, содержащие продукт объединяли, упаривали на роторе, а затем переупаривали с толуолом для освобождения от уксусной кислоты. Потом упаривали досуха и досушивали на лиофильной сушке.

 

 

 

Полученное соединение MTXONp, растворили в ДМСО перенесли в реакционную колбу, прибавили диолеоилглицерин , триэтиламин, реакцию проводили при перемешивании, добавив вторую аликвоту триэтиламина через 15 минут после начала реакции. Всего реакцию проводили в течение полутора часов.

Полученную смесь разделяли с помощью хроматографии на колонке с силикагелем, промывая ее системой на основе CHCl3:CH3OH:CH3COOH, постепенно увеличивая содержание метанола, и вместе с тем добавляя 1 объемный % воды, так как целевое соединение задерживалось на колонке. Наличие ипофильного производного во фракция контролировали с помощью ТСХ, по результатом которой объединяли фракции и упаривали на роторном испарителе. Наработанное количество производного использовали для приготовления липосом.

 

Часть 2. Изучение стабильности бислоя липосом с липофильными пролекарствами с помощью флуоресцентного индикатора- кальцеина.

 

Липосомы готовили методом экструзии через 100 нм поры. Для этого создавали липидную пленку из яичного фосфатидилхолина и фосфатидилинозита с включением 10 мольных процентов пролекарства. Пленку гидратировали раствором кальцеина в самозатушенной концентрации 80мМ. Полученную экструзией дисперсию отделяли от невключившегося кальцеина с помощью гель-фильтрации на колонке с сефарозой CL-4B (15мл), затем объединили фракции с наибольшей интенсивностью окрашивания. Далее определяли концентрацию по пролекарству и кальцеину в суммарной фракции спекрофотометрически после разрушения липосом спиртом.

Показателем разрушения липосом в среде должен служить сигнал разгорания интенсивности флуоресценции вытекающего кальцеина. В качестве максимума возможного разгорания, соответствующего полному разрушению бислоя и вытеканию всего кальцеина, использовали показания интенсивности флуоресценции при добавлении TritonX100 к образцу. Разгорание после разрушения посредством TritonX100 превышало фон в 6-9 раз в зависимости от свежести образца липосом. За поведением липосом наблюдали в трех системах- буфере PBS, плазме и сыворотке. В плазме и сыворотке наблюдали схожую динамику в первые 3-4 часа инкубации липосом при 37°С. Однако после прохождения 22,5 часов в сыворотке наблюдали значительно большее вытекание кальцеина (22%), чем в плазме (7%).

II семестр

Применение наноразмерных систем доставки лекарств позволяет снизить токсический эффект противоопухолевых препаратов на организм в целом. При контакте с плазмой крови наноноситель мгновенно покрывается белками, которые образуют так называемую белковую корону. Она модифицирует поверхность носителя и влияет на биораспределение и фармакокинетику препарата. Взаимодействия с белками обусловлены структурой поверхности наночастиц: ее кривизной, строением, зарядом.
Липосомы — наиболее био и гемосовместимые системы доставки лекарств. Но при попадании в кровоток они также взаимодействуют с белками, что способствует опсонизации и преждевременному выводу из кровотока. Кроме того, как и другие наночастицы они способны индуцировать развитие каскада cистемы комплемента (СК).

Объект наших исследований — липосомы, несущие в липидном бислое липофильные пролекарства противоопухолевых препаратов, широко применяемых в онкологической практике: метотрексата (МТХ) — антиметаболита фолиевой кислоты и мелфалана (Mlph) — цитотоксического алкилирующего агента. Главным преимуществом включения водорастворимых лекарств в бислой липосом в виде липофильных конъюгатов является возможность получения наноразмерных липосом с терапевтически эффективной загрузкой лекарственным средством. Пролекарства сконструированы таким образом, чтобы минимально нарушать структуру бислоя. Cвязь между остатком лекарства и остальной частью молекулы сложноэфирная, что обеспечивает гидролиз неспецифическими эстеразами. Матрица липосом состоит из природных липидов: яичного фосфатидилхолина и фосфатидилинозита пекарских дрожжей. Роль фосфатидилинозита заключается в том, что остаток миоинозита за счет полярной высокогидратируемой группы должен обеспечить стабилизацию мембраны липосомы в кровотоке. Эффективность данных липосомальных препаратов показана в экспериментах на животных.

Ранее в лаборатории химии липидов ИБХ РАН в тестах in vitro была установлена гемосовместимость указанных липосом, однако данные о влиянии на каскады системы комплемента и коагуляции свидетельствовали о возможных различиях в состоянии белковых «корон» препаратов. В частности, мелфалан-содержащие липосомы были инертны, а метотрексат-содержащие вызывали активацию СК.

В нашей работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

  • Получить образцы липосом с пролекарством мелфалана, содержащие также полиэтиленгликолилфосфатидилэтаноламин или углеводный адресный лиганд (SiaLeX)

  • Установить влияние состава мелфалан-содержащих липосом на общее количество связанного белка плазмы и на связывание с отдельными функционально значимыми белками

  • Получить образцы липосом с пролекарством метотрексата. Изучить влияние условий инкубации метотрексат-содержащих липосом с плазмой на ассоциацию белков CК


 

Липосомы с мелфалановым пролекарством (Mlph-липосомы) содержали 10 мольн. % пролекарства Mlph-DG в матрице из фосфатидилхолина (РС) с различными добавками: 1) образец L-MlphDG содержал фосфатидилинозит (PI); 2) образец SiaLeX-L-MlphDG дополнительно к PI содержал диглицеридный конъюгат тетрасахаридного лиганда селектинов (SiaLeX-DG) — молекул клеточной адгезии, вовлеченных в развитие процессов воспаления и метастазирования; 3) образец PEGPE-L-MlphDG содержал ПЭГ2000-фосфатидилэтаноламин вместо PI; 4) образец L-MlphDGPI не содержал PI. Липосомы с пролекарством метотрексата (МТХ-липосомы) содержали 10 мольн. % пролекарства MТХ-DG в матрице из РС и PI. Все образцы были получены методом экструзии через 100-нм поры и представляли собой стабильные коллоидные растворы частиц с размером около 100 нм и распределением, близким к монодисперсному.

Образцы инкубировали с плазмой при 37°С в течение 15 мин для серии с Mlph-DG, и в течение 5 или 30 мин для липосом с MТХ-DG. Липосомы со связавшимися белками выделяли с помощью гель-хроматографии на колонке с сефарозой CL-4B. Собирали фракции и анализировали каждую на содержание пролекарства с помощью спектрофотометрии, после разрушения липосом 5-кратным объемом этанола, а также на содержание белка с помощью модифицированного метода Лоури. Приведен пример профилей элюции образцов липосом по белку (Рис. ). Фракции с наибольшим содержанием белка и пролекарства, что соответствует пику выхода липосом, объединяли.

Определяли количество связываемого белка — показатель суммарного количества белка во фракции липосом, отнесенного к общему количеству липидов, который позволяет прогнозировать скорость выведения липосом из кровотока. Hеожиданно липосомы с ПЭГ-липидом показали самый высокий уровень связывания с белками (таблица 2). Очевидно, для экранирования поверхности в липосомы следует вводить значительно больше, чем 2 % ПЭГ2000-фосфатидилэтаноламина.

Далее анализировали связанные белки с помощью электрофореза и иммуноблоттинга. Предварительно делипидизировали фракции липосом экстракцией органическими растворителями и центрифугированием. Электрофорез проводили в востанавливающих условиях в 12% полиакриламидном геле, с обнаружением серебряным реагентом. После переноса белков на PVDF мембрану идентифицировали их с помощью антител. В качестве контроля использовали образец плазмы в разведении 1/100, а также образец плазмы, проинкубированный с буфером и проведенный через гель-хроматографию.

При неспецифическом окрашивании геля серебряным реагентом получили, что во всех образцах Mlph-липосом доминирует полоса, соответствующая по молекулярной массе альбумину (~ 66 кДа). Этот белок, как правило, в больших количествах обнаруживается в комплексах с липосомами, поскольку является самым массовым в плазме. Также в равной мере была представлена полоса, соответствующая молекулярной массе  79 кДа, которая может свидетельствовать о связывании с липосомами различных компонентов системы комплемента, а также цепей иммуноглобулинов.

Наибольший интерес представляло изучение белков СК, вовлеченных в опсонизацию поверхности и вывод липосом из кровотока, а также ответственных за развитие реакций гиперчувствительности, вызванных образованием анафилотоксинов С3а и С5а. Активация СК осуществляется по 3 путям: классическому — когда распознавание происходит с помощью антител, лектиновому — реализующемуся в присутствии клеточной стенки бактерий и альтернативному, когда фрагмент основного компонента СК С3b связывается с чужеродными объектами напрямую. При активации образуются конвертазы, расщепляющие основной компонент СК С3, его фрагмент С3b вызывает опсонизацию поверхности и дальнейшее развитие каскада. Инактивацию конвертаз и опсонина С3b осуществляет множество белков, среди которых регуляторные C4BP, факторы I и H. С помощью иммуноблоттинга было установлено, что все образцы липосом с пролекарством мелфалана связывают компонент C3. Но активации системы комплемента не наблюдалось, поскольку не были детектированы α’-цепь белка С3b (104 кДа) и фрагменты ее дальнейшего расщепления под действием факторов I и Н. На блоте были идентифицированы лишь полосы, соответствующие цепям нерасщепленного белка С3 (118 кДа и 76 кДа), а также небольшое количество связанного фактора H, инактивирующего каскад СК. Идентификацию С4b-связывающего белка проводили по α-цепи — наиболее массивной субъединице (75 кДа). Концентрирование данного регуляторного белка проявилось в большей степени для образцов без ПЭГ-липида и SiaLeХ-конъюгата. Очевидно, тетрасахаридный лиганд, содержащий к тому же олигоэтиленгликольный спейсер, экранирует липосомы от связывания с данным белком подобно ПЭГ-цепям.

Ранее было показано, что МТХ-липосомы активируют СК, поэтому была поставлена задача выяснения возможных путей активации. Для отслеживания динамики связывания компонентов СК инкубацию МТХ-липосом в плазме проводили в течение 5 и 30 мин. Еще один образец пред-инкубировали с добавлением этиленгликольтетраацетата (10 мМ) и Mg2+ (2.5 мМ) с целью ингибирования классического пути СК за счет преимущественного связывания катионов Ca2+. Как и в случае Mlph-липосом, при неспецифическом окрашивании геля было установлено, что альбумин в большом количестве ассоциирован с МТХ-липосомами. Во всех образцах также представлена полоса, соответствующая молекулярной массе  79 кДа, что предположительно является бета субъединицей С3. Степень концентрирования этого белка из плазмы даже в ходе 5-мин инкубации оказалась значительно выше, чем в случае 15‑мин инкубации Mlph-липосом, особенно по сравнению с альбумином. Среди других связанных белков, предположительно, обнаруживались фибриноген и фрагменты расщепления компонента С3.

С помощью иммуноблоттинга мы установили, что с течением времени МТХ-липосомы сорбируют большее количества белка С3, представленного субъединицами α (118 кДа) и β (79 кДа). Причем при длительной инкубации увеличивается количество фрагментов этого белка (~52 кДа и ~46 кДа), которые могут соответствовать альфа1, альфа2 и другим продуктам деградации С3b. Их появление вызвано расщеплением C3b в присутствии факторов I и H, последний из которых также был обнаружен в комплексе с липосомами. Добавление смеси, ингибирующей классический путь активации комплемента (EGTA, Mg2+), значительно снижало количество ассоциированного с липосомами белка С3 и, главное, препятствовало его деградации.

При изучении связывания МТХ-липосом с иммуноглобулинами мы обнаружили, что с течением времени количество IgG увеличивается (полоса 63 кДа). В присутствии ЭГТА и ионов магния, ингибирующих классический путь СК, сорбция данных иммуноглобулинов уменьшалась. В случае иммуноглобулинов класса М, связывание с МТХ-липосомами при увеличении времени инкубации также возрастало, причем вне зависимости от присутствия ингибирующей смеси. Тем не менее, это не может исключить участие IgM в активации СК по классическому пути.

Данные о связывании фрагментов С3, фактора Н, иммуноглобулинов G и M в присутствии и отсутствие ионов Ca2+ в плазме свидетельствуют в пользу включения альтернативного пути активации СК наряду с классическим.

Участие в конференциях: 

XXVIII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, Россия (устный доклад)

«V Съезд биохимиков России», Сочи-Дагомыс, Россия

Сдача кандидатских экзаменов: философия и английский язык

 

Аттестационные материалы: выписки из протоколов коллоквиума за 1 и 2 семестры и индивидуальные планы с отчетом за 1 и 2 семестры

 

Публикация по результатам работы : Взаимодействия противоопухолевых липосом, несущих липофильные пролекарства в бислое, с белками плазмы крови

 

2 год обучения (2016)

Экспериментальная работа:

III семестр

С целью увеличения стабильности противоопухолевых липосомальных препаратов в сыворотке крови человека определяли оптимальное соединение, при включении которого в бислой достигается защита от деструктивного воздействия белков. В матрицу липосом, состоящую из яичного фосфатидилхолина, формирующего жидкий бислой, и 10 мольных % липофильного пролекарства противоопухолевого препарата мелфалана, в качестве стабилизирующих компонентов включали фосфатидилинозит (PI), ганглиозид GM1, CООН-пептидолипид и ПЭГ-липид.

Изначально оценку стабильности липосом проводили включением во внутренний водный объем раствора кальцеина в самозатушенной концентрации. При его высвобождении наблюдается рост сигнала флуоресценции, что свидетельствует о проницаемости бислоя. Нами были получены данные о сдерживании высвобождения кальцеина для образцов с PI и с небольшим содержанием (2%) GM1 или CООН-пептидолипида.

Другим подходом оценки степени воздействия белков на липидный бислой является мониторинг изменения переноса энергии между FRET-парой флуоресцентных зондов (рис. 1), производных фосфатидилхолина, встроенных в мембрану. На стадии приготовления липидной пленки включали 0,5 мольных % донора TMB-PC и 1,5 мольных % акцептора BCHB-PC.

Донор — TMB-PC (1,3,5,7-тетраметил-BODIPY-меченый фосфатидилхолин) обладает следующими спектральными характеристиками: λem =505 нм, ε = 90000 [моль*см]-1, квантовый выход = 1. Акцептор — BCHB-PC (4,4-дифторо-4-боро-3а,4а-диаза-s-индацен-BODIPY-меченый фосфатидилхолин): λem =545 нм, ε = 70000 [моль*см]-1, квантовый выход = 0,7. Когда зонды в мембране находятся на расстоянии радиуса Ферстера (для данной пары он составляет 52 Å), донор переносит энергию возбуждения на акцептор, и регистрируемый сигнал донора оказывается очень мал. При увеличении расстояния между зондами происходит уменьшение эффективности переноса энергии, а значит, рост регистрируемого сигнала флуоресценции донора TMB-PC. Изменение расстояния между донором и акцептором может происходить как при «разбавлении» бислоя другими соединениями, так и при его разрушении и образовании мицелл.

Липосомы с включенными стабилизирующими соединениями инкубировали в течение суток при 37ºС в 80% сыворотке и буфере PBS. Сигнал флуоресценции TMB-PC регистрировали при λex =470 нм, λem =505 нм. Полученные значения для всех образцов нормировали на показание после добавления детергента TritonX100. Он способствует полному разрушению липосом и образованию мицелл, в которых отсутствует перенос энергии. Для образцов в буфере наблюдали небольшое увеличение сигнала, причем с наибольшей скоростью в первый час инкубации (общий прирост за сутки от 3 до 13%). Предположительно, это связано с разбавлением образцов липосом или с повышением температуры от комнатной до 37ºС при переносе образцов в инкубационную смесь и изменением равновесия липидов в системе липидный бислой – водная фаза.

Мы регистрировали рост сигнала флуоресценции донора при инкубации образцов липосом в 80% сыворотке. Сохранение бислойных везикул в сыворотке в течение 24 часов было показано при включении кальцеина во внутренний объем липосом. Тогда рост сигнала донора, регистрируемый нами, можно трактовать как разбавление бислоя молекулами белков, их взаимодействие с поверхностью и внедрение в наружную часть липидного бислоя. В первые пять часов наименьшее нарушение эффективности переноса наблюдается для образца с включением 10% СООН-пептидолипида — конъюгата, несущего протяженную структуру олиго-глицина с четырьмя отрицательно заряженными карбоксиметильными группами. Следовательно, для данной структуры проявляется наименьшее воздействие белков на липидный бислой. Ганглиозид GM1 в течение первых 3 часов так же эффективен, как и СООН-пептидолипид, затем влияние белков на липосомы усиливается. Различные количества включенного ПЭГ-липида (2 или 10%) почти не отличаются по сигналу донора, но немного снижают степень воздействия белков в первое время в сравнении с включением фосфатидилинозита. Интересно, что по истечении 24 часов остаточная эффективность переноса для всех систем была одинаковой: наблюдалось увеличение сигнала флуоресценции донора на 80%. Такое значение достигалось для образца c PI в первые 4 часа, однако при этом бислой был практически непроницаем для кальцеина, то есть везикулярная структура сохранялась. Можно предположить, что в случае ганглиозида GM1 и СООН-пептидолипида примерно после 3-4 часов инкубации количество белка в короне увеличивается уже за счет взаимодействий между белками, составляющими корону мембраны, и свободными белками сыворотки.

 

IV семестр

Ранее при проведении исследований стабильности противоопухолевых липосомальных препаратов в сыворотке крови человека с включением в бислой крупных амфифильных молекул по косвенным признакам установили высвобождение молекул ПЭГ-липида из жидкого бислоя с образованием собственных мицелл. В связи с этим, изучали зависимость поведения липосом в сыворотке крови с включением 2 или 10 мольн. % ПЭГ-липида, содержащих пролекарство мелфалана, от фазового состояния бислоя. Липидная матрица состояла из яичного фосфатидилхолина или дистеароилфосфатидилхолина (DSPC) либо из комбинации последнего с холестерином.

Получили, что твердые липосомы из DSPC, с заключенным раствором кальцеина внутри, являются хрупкими и поры, образующиеся после выхода ПЭГ-липида из бислоя, приводят к полной дестабилизации системы. Образец с включением 10% ПЭГ-липида более стабилен, чем с 2%, но, тем не менее, также претерпевает деструкцию. Только после включения 30% холестерина в бислой наблюдается его стабилизация в сыворотке. При этом наиболее стабильной формуляцией является образец, содержащий 30% Chol, 50% DSPC, 10% PEG-PE, 10% Mlph-DG.

Все образцы, содержащие различные стабилизирующие молекулы (фосфатидилинозит, ганглиозид GM1, липопептид, ПЭГ-липид), были охарактеризованы. Методом NTA (aнализ траекторий наночастиц) определялся размер липосом, содержащих буфер PBS во внутреннем водном объеме или раствор кальцеина. Так, для группы содержащей буфер размер варьировался незначительно: 87-90 нм, для образцов, содержащих кальцеин: 99-102 нм. Также измерялся дзета-потенциал липосом с вышеуказанными молекулами для более полного понимания их взаимодействия с белками сыворотки. В серии наибольшую защиту бислоя обеспечивали образцы со значительным отрицательным дзета-потенциалом (GM1, PI, липопептид).

Образец

Значение дзета-потенциала, мВ

ePC-MlphDG

+18

ePC-MlphDG-PEGPE (2%)

+9

ePC-MlphDG-GM1 (2%)

+5

ePC-MlphDG-PEGPE (10%)

-10

ePC-MlphDG-PI

-25

ePC-MlphDG-GM1 (10%)

-30

ePC-MlphDG-lipopeptide (2%)

-31

ePC-MlphDG-lipopeptide (10%)

-66

Педагогическая практика:

для студентов 4 курса биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Участие в конференциях (2017г):

XXIX Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, Россия (устный доклад)

 

Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Россия

 

XIV ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ ИМЕНИ А.Ю. БАРЫШНИКОВА «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ», Москва, Россия

Объединенный научный форум:  Международная научная конференция по биоорганической химии " XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" и VIII Российский симпозиум "Белки и пептиды"

ILS Liposome Advances and Liposome Research Days Combined Conference, Athens, Greece

Публикация по результатам работы : Influence of stabilizing components on the integrity of antitumor liposomes loaded with lipophilic prodrug in the bilayer

 

Аттестационные материалы: выписки из протокола коллоквиума 3 и 4 семестры, индивидуальный план с отзывом 3 и 4 семестры

 

 

3 год обучения (2017)

Экспериментальная работа:

V семестр

Ранее в лаборатории химии липидов было показано на модели Т-клеточной лимфомы мышей, что 100-нм-липосомы на основе природных фосфолипидов, несущие в липидном бислое метотрексат в виде липофильного пролекарства – диолеоилглицеридного сложного эфира (MTXDG) – менее токсичны и более эффективно ингибируют рост опухоли, по сравнению с интактным метотрексатом.

Мы изучали ex vivo с помощью цитофлуориметрии влияние введения MTXDG в состав липосом на их взаимодействия с субпопуляциями лейкоцитов крови человека, а также вклад ганглиозида GM1, фосфатидилинозита (PI) и пептидолипида (AcCMGAd-DOPE) в экранирование липосом от захвата клетками моноцитарно-макрофагальной защитной системы. Известно, что ганглиозид GM1 и PI стабилизируют липосомы в циркуляции; AcCMGAd-DOPE показал защитный эффект в экспериментах с сывороткой крови [Tretiakova et al. Coll Surf B Biointerfaces 2018].

Методом экструзии через 100-нм поры получали липосомы на основе яичного фосфатидилхолина (ePC) следующего состава: L1 – чистый ePC, L2 – ePC—MTXDG, 9:1 (мол.), L3/4/5 – ePC—MTXDG—ганглиозид GM1/PI/AcCMGAd-DOPE, 8:1:1 (мол.). Все препараты липосом содержали 1 мол % флуоресцентно-меченого фосфатидилхолина. Свежую кровь здоровых доноров, собранную над гепарином, инкубировали с липосомами (10:1, об.) при 37 С от 30 мин до 3 ч, затем образцы промывали на холоду, высаживали клетки центрифугированием и обрабатывали гипотоническим буфером, содержащим хлорид аммония, для лизиса эритроцитов. Чтобы исключить сигнал флуоресценции непоглощенных липосом, адсорбированных на поверхности клеток, использовали тушитель флуоресценции — кристаллический фиолетовый. Измерения проведены на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, USA, Florida ) и проанализированы с помощью программного пакета CXPanalysis (Beckman Coulter, USA, Florida ).

Гистограммы FACS-анализа свидетельствуют о принципиальной разнице в связывании с лейкоцитами липосом с MTXDG (L2 - L5) и липосом без пролекарства (L1). Уже через 30 мин инкубации 85 % нейтрофилов содержали липосомы L1, а через 2 ч – все 100 %. Моноциты более медленно поглощали липосомы L1, но к 2 ч инкубации практически вся популяция их захватывала. Напротив, липосомы L2 и L3 в течение 30 мин ассоциировали не более чем с 15 % нейтрофилов. Затем пул отреагировавших нейтрофилов постепенно увеличивался – к 3 ч инкубации он достигал максимальных значений 61.5 и 70 % для липосом L2 и L3, соответственно, тогда как для L4 и L5 не превышал 40%. В ходе всей инкубации степень фагоцитоза липосом L2 и L3 продолжала увеличиваться, тогда как для L4 и L5 значение средней интенсивности флуоресценции «X-mean» после 60 мин практически не изменялось . Моноциты же интенсивнее и быстрее поглощали липосомы L2 и L3: 20 % от их популяции уже через 30 мин показывали максимальный сигнал флуоресценции нейтрофилов. К концу инкубации пул позитивных моноцитов не превышал 70 %. Введение ганглиозида увеличивало интенсивность захвата липосом моноцитами в сравнении с другими экранирующими агентами; причина такого эффекта пока не выяснена. Липосомы с PI (L4) и AcCMGAD-DOPE (L5) умереннее захватывались обоими видами клеток. Поглощение липосом всех типов лимфоцитами не наблюдалось.

 

 

Педагогическая практика:
лабораторная работа для студентов факультета фундаментальной медицины МГУ им. Ломоносова

Участие в конференциях:

XXX Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (устный доклад)

 

Аттестационные материалы - выписка из протокол коллоквиума и индивидуальный план с отзывом.

VI семестр

В ходе ex vivo изучения взаимодействия 100-нм-липосом на основе яичного фосфатидилхолина, нагруженных пролекарством метотрексата (MTXDG), с субпопуляциями лейкоцитов крови человека с помощью цитофлуориметрии установили, что липосомы поглощаются большой фракцией моноцитов вне зависимости от структуры введенного стабилизирующего агента. Причем включение в липосомы фосфатидилинозита, пептидолипида или ганглиозида, а также и самого пролекарства приводит к увеличению доли позитивных клеток по сравнению с липосомами из одного яичного фосфатидилхолина. К концу первого часа инкубации почти все клетки популяции поглощают липосомы. Введение ганглиозида увеличивало интенсивность захвата липосом моноцитами в сравнении с другими экранирующими агентами, что отслеживали по средней интенсивности флуоресценции клеток; предполагается, что причиной этого может быть рецепторное распознавание GM1. Захват липосом нейтрофилами в первые 30 минут инкубации практически не отличается для всех вариантов липосом. Можно предположить, что уже до взаимодействия с клетками липосомы быстро покрываются белковой короной, которая, до некоторой степени, нивелирует различия поверхностей. Возможно, для всех образцов захват клетками реализуется посредствам узнавания на поверхности липосом компонентов системы комплемента.

 

Для липосом с пролекарством мелфалана (MlphDG) исследовали связывание сывороточного альбумина и возможное влияние на целостность бислоя с помощью ИК спектроскопии с преобразованием Фурье. Сначала получали ИК спектр липосом в буфере PBS, а затем добавляли альбумин и инкубировали в течение 20 мин при 37С. В ходе инкубации записывали спектры через каждые 5 минут и определяли изменения в положениях пиков. Так, на липосомах с пролекарством, но без защитных молекул, образуется плотная белковая корона из агрегированных молекул альбумина, а изменения в области углеводородных пиков свидетельствуют о внедрении альбумина в бислой. Добавление 10% фосфатидилинозита в состав бислоя защищает от воздействия белка жирнокислотные остатки. Молекулы альбумина взаимодействуют в этом случае только с полярными частями липидов. Замена фосфатидилинозита на 10 % пептидолипида, по-видимому, снижает количество ассоциированного с поверхностью липосом белка, так как доля агрегированного альбумина снижается, а также приводит к частичной защите бислоя от взаимодействия белка с углеводородными цепями. Введение 10% ганглиозида GM1 также препятствует внедрению альбумина в бислой, что наблюдается по отсутствию изменений в пиках симметричных и ассиметричных колебаний СН2; при образовании белковой короны молекулы альбумина структурируются с остатками углевода (кластеры?) и не агрегируют между собой.

Педагогическая практика - отчет

Участие в конференциях:

XV ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ ИМЕНИ А.Ю. БАРЫШНИКОВА «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ», 29-30 марта 2018, Москва, Россия

CLINAM, 11th European and global summit for clinical nanomedicine, targeted delivery and precision medicine, 2-5 september, Basel Switzerland

Biomembranes 2018, 1-5 октября, Долгопрудный, Россия

Липиды XXI века. Первая четверть, 22-23 октября, Москва, Россия

Аттестационные материалы:

-выписка из протокола

- индивидуальный план

 

 

 

4 год обучения (2018)

VII семестр

Отчет

Для липосом с пролекарством мелфалана (MlphDG) продолжили исследование связывания сывороточного альбумина и возможного его влияния на целостность бислоя с помощью ИК спектроскопии с преобразованием Фурье. Сначала получали ИК спектр липосом в буфере PBS, а затем добавляли альбумин и инкубировали в течение 20 мин при 37С. В ходе инкубации записывали спектры через каждые 5 минут и определяли изменения в положениях пиков. Для определения влияния пролекарства на взаимодействие липидного бислоя с белком исследовали также и образцы липосом только из ePC или с добавлением амфифильных защитных молекул (PI, GM1, CMG-липид), но без MlphDG.

О характере взаимодействия липосом с альбумином судили по нескольким параметрам: изменению подвижности углеводородных цепей (сдвиг частот пиков в области валентных колебаний CH2 2930-2850 см-1), изменению степени гидратации карбонильных групп липидов (вклад колебаний от высоко гидратированных липидов в области частот 1719-1732 см-1) и изменению структуры белка (количественные изменения % элементов вторичной структуры белка – α-спираль/β-лист/β-поворот/неупорядоченная цепь, с течением времени инкубации в пике амид I и вклад агрегатов белка в областях частот 1618-1627 см-1 и 1686-1696 см-1).

Для липосом только из фосфатидилхолина в ходе инкубации с БСА не наблюдаются изменения в области CH2 пиков, % высоко гидратированных карбонильных групп значительно снижен уже после 5 минуты инкубации с белком, % α-спиральных участков самого БСА уменьшается, % агрегатов белка мал. Это свидетельствует о том, что альбумин формирует плотную белковую корону на поверхности липосом, разрывая водородные связи карбонилов бислоя с молекулами воды и, по-видимому, замещает их собой. Однако его внедрения в равномерный бислой ePC не происходит, так как нет влияния на подвижность цепей.

Введение только молекул пролекарства в бислой, создает некоторые локальные дефекты поверхности, изменяющие взаимодействие с альбумином. В этом случае наблюдается изменение подвижности цепей CH2 – увеличивается текучесть бислоя, что говорит о внедрении белка. Количество его агрегатов максимально на 10 минуте инкубации, а затем снижается. Количество высоко гидратированных карбонильных групп изменяется симбатно с количеством агрегатов. Так, можно предположить, что белок подходит все ближе к карбонильным группам липидов принося свою гидратную оболочку, а затем происходит взаимодействие карбонильных групп уже с самим альбумином. Его структура постоянно изменяется в течение инкубации. К ее концу – 20 минутам большая часть белка находится в конформации β- поворота и листа.

Введение 10% фосфатидилинозита в бислой только из ePC также вносит некоторые дефекты для облегчения взаимодействия с альбумином в дальнейшем. При добавлении БСА увеличивается текучесть бислоя и наблюдается сдвиг пика асимметричных колебаний CH2 – 2923см-1. Процент высоко гидратированных карбонильных групп значительно снижен уже после добавления БСА, хотя к 20-минуте инкубации возвращается к прежнему значению, % α-спиральных участков самого БСА уменьшается, % агрегатов незначительно увеличивается при инкубации. Так можно предположить, что альбумин заякоривается в бислое взаимодействуя с карбонильными группами липидов.

Хотя по отдельности MlphDG и PI создают некоторые дефекты в бислое, липосомы с 10% пролекарства и 10% фосфатидилинозита наоборот не позволяют альбумину глубоко внедриться в бислой. При инкубации с БСА не было влияния на подвижность углеродных цепей. Процент высоко гидратированных карбонильных групп увеличивался лишь первые 5 минут, что может свидетельствовать о появлении гидратной оболочки альбумина вблизи этих карбонилов. Видимо, белок агрегирует и создает слабосвязанную корону на поверхности бислоя без его нарушения так как % агрегатов немного увеличивался, % α-спиральных участков самого БСА уменьшался.

Добавление ганглиозида 10% GM1 к ePC сильно увеличивает долю высоко гидратированных групп относительно чистого ePC за счет воды на углеводе, тогда как рассмотренные ранее амфифильные защитные молекулы и пролекарство снижают их количество за счет разрыва водородных связей с водой и замены взаимодействий ePC – молекулы воды на компенсирующее взаимодействие ePC – защитные молекулы/пролекарство. В случае липосом ePC-
GM1 при инкубации с альбумином не было выявлено изменений в области CH2 пиков, % агрегатов был незначителен, а % α-спиральных участков самого БСА снижался на 5 минуте инкубации, и далее слегка рос к исходному значению. Симбатные изменения, но с более заметным ростом в конце, наблюдали и для высоко гидратированных компонентов. Возможно, что альбумин и его агрегаты не могут легко проникнуть между углеводными цепями и плохо удерживаются на подобном бислое, покидая его со временем.

Схожий тренд наблюдается и при введении в этот бислой пролекарства. При инкубации с белком изменений в подвижности CH2 пиков не наблюдается, % агрегатов белка к концу инкубации и % α-спиральных участков совпадают с контрольными значениями для чистого альбумина, % высоко гидратированных карбонильных групп также возвращается к исходному значению. По-видимому, альбумин в начале инкубации образует некоторую белковую корону вокруг липосом, а затем диссоциирует с их поверхности.

Введение 10% CMG-липида в бислой из ePC также вносит некоторые дефекты для облегчения взаимодействия с альбумином в дальнейшем. При добавлении БСА увеличивается текучесть бислоя и наблюдается сдвиг пика асимметричных колебаний CH2 – 2922см-1. Процент высоко гидратированных карбонильных групп растет после добавления БСА, хотя к 15-минуте инкубации возвращается к прежнему значению, % α-спиральных участков самого БСА уменьшается, % агрегатов незначительно увеличивается при инкубации. Так можно предположить, что альбумин заякоривается в бислое взаимодействуя с карбонильными группами липидов увеличивая долю высоко гидратированных компонентов на 10-й минуте инкубации за счет своей гидратной оболочки вблизи карбонильных групп бислоя и дополнительных групп на CMG-липиде вблизи поверхности. Возможно также взаимодействие БСА с пептидным фрагментом CMG-липида.

Добавление в этот бислой пролекарства изменяет характер подвижности липидов бислоя, теперь при взаимодействии с альбумином наблюдаются только симметричные колебания цепей, а асимметричные становятся невыгодными. Процент высоко гидратированных карбонильных групп уменьшается в первые 5 минут после добавления БСА, это значение становится постоянным в ходе всей инкубации, % α-спиральных участков самого БСА уменьшается, % агрегатов незначительно увеличивается. Основным отличием от липосом с CMG-липидом без пролекарства является отсутствие колоколообразного изменения % высокогидратированных компонентов. Возможно, при введении MlphDG карбонильные группы, формировавшие водородные связи с гидратной оболочкой белка, теперь находятся в постоянном взаимодействии с самим пролекарством и таким образом недоступны для подобного ответа. Так, можно предположить, что БСА как агрегирует с пептидным фрагментом, карбонилы которого могут взаимодействовать с пролекарством, так и внедряется непосредственно в бислой.

Независимо от экспериментов ИК-спектроскопии связывание сывороточного альбумина с поверхностью липосом исследовали также с помощью флуоресцентной спектроскопии, а именно с использованием метода переноса резонансной энергии Ферстера (FRET). Сначала конъюгировали БСА с изотиоцианатом флуоресцеина (FITC). Сывороточный альбумин растворяли в карбонат-бикарбонатном буфере (pH 9.5) в концентрации 2 мг/мл. FITC растворяли в сухом ДМСО до концентрации 2 мгмл. Раствор сывороточного альбумина (0.5 мл) переносили в виалу темного стекла и без света при постоянном перемешивании добавляли по каплям 10 мкл раствора FITC. После добавления каждой аликвоты контролировали pH среды, оптимальное значение для проведения реакции: 9.3-9.5. Реакция проходила при комнатной температуре и постоянном перемешивании 4 ч. После окончания конъюгации реакционную смесь наносили на колонку Sephadex G-50 ( V= 10мл) и промывали буфером PBS pH 7.4. Конъюгат с белком выходит со свободным объемом колонки. Выход белка и метки в одной фракции контролировали спектрофотометрически (284 нм и 485 нм, соответственно). Эффективность мечения — 1.3 молекулы FITC на молекулу БСА.

Образцы липосом содержали акцептор флуоресценции — бициклогексил-BODIPY — производное фосфатидилхолина (BCHB-PC). Он встраивался в липидную матрицу из ePC. Кроме «пустых» образцов (из ePС) также готовили липосомы с добавлением молекул GM1 или MlphDG, а также c GM1 и MlphDG одновременно. Липосомы с пролекарством MlphDG, но без защитной молекулы — GM1, по-видимому, взаимодействуют с большим количеством белка, что приводит к большему переносу энергии донора — FITC-БСА на акцептор
BCHB-PC в липосомах. Эксперименты с FRET позволили сделать вывод, что в случае GM1-cодержащих липосом БСА остается на их поверхности в течение всего времени инкубации (предположение о диссоциации БСА было сделано на основании результатов исследований методом ИК-спектроскопии, см. выше).

Ранее в ходе ex vivo изучения взаимодействия 100-нм-липосом на основе яичного фосфатидилхолина, нагруженных пролекарством метотрексата (MTX-DG), с субпопуляциями лейкоцитов крови человека с помощью цитофлуориметрии установили, что липосомы поглощаются большой фракцией моноцитов вне зависимости от структуры введенного стабилизирующего агента. Для липосом с MTX-DG запланировали анализ белковой короны этих образцов после инкубации в сыворотке. Взаимодействие с белками крови происходит быстрее и может влиять на захват моноцитами и распознавание их рецепторами. Готовили липосомы из ePC с добавлением амфифильных защитных молекул (PI, GM1, CMG-липид) и пролекарства MTX-DG. Образцы инкубировали с плазмой при 37°С в течение 15 мин. Липосомы со связавшимися белками отделяли от свободных компонентов с помощью гель-хроматографии на колонке с сефарозой CL-4B. Собирали фракции и анализировали каждую на содержание пролекарства спектрофотометрически, после разрушения липосом 5-кратным объемом этанола, а также на содержание белка с помощью модифицированного метода Лоури. Фракции с наибольшим содержанием белка и пролекарства, что соответствует пику выхода липосом, объединяли. Далее необходимо проанализировать состав белковой короны с помпомощью Вестерн-блоттинга.

 

Участие в конференциях:

 

Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Россия, 25-27 февраля 2019, финалист конкурса молодых ученых

Сдача кандидатских экзаменов: специальность

 

Аттестационные материалы - выписка из протокол коллоквиума и индивидуальный план с отзывом.

 

4 год обучения (2019)

Отчет аспиранта Третьяковай Д.С. за 8 семестр

Завершение экспериментов по изучению связывания белков с MTX-липосомами и их захвата моноцитами

В ходе исследований сравнивали экранирующие способности разных молекул в бислое липосом: фосфатидилинозита, ганглиозида GM1 и конъюгата фосфолипида с карбоксилированным олигоглицином (CMG-PE) (Рис. 1). Рис. 1. Структуры ганглиозида GM1 и пептидного конъюгата CMG-PE. По данным литературы, включение фосфатидилинозита (PI) в бислой уменьшало захват липосом клетками ретикуло-эндотелиальной системы. Такой эффект можно объяснить отрицательным зарядом фосфолипида с относительно крупной головной группой, а также стерическими препятствиями, которые создают высокогидратированные остатки мио-инозита на поверхности липосом. Ганглиозид GM1 в липосомах увеличивал время циркуляции в кровотоке еще больше, чем PI, благодаря объемистому и жесткому отрицательно заряженному остатку пентасахарида. Взаимодействие липосом с субпопуляциями лейкоцитов цельной крови исследовали методом проточной цитофлуориметрии. Для исключения из регистрации адсорбированных, но не фагоцитированных клетками липосом, был использован тушитель флуоресценции – краситель фиолетовый кристаллический . Критическими стадиями дизайна эксперимента стали подбор времени инкубации и условий для лизиса эритроцитов при сохранении целостности нейтрофилов. С учетом времени, необходимого для подготовки пробы перед цитометрией (после инкубаций липосом с кровью), и времени хранения цельной крови не более 8 ч в одном эксперименте можно было проанализировать не более трех вариантов липосом, каждый в двух повторах. На Рис. 2 представлены репрезентативные гистограммы FACS-анализа поглощения субпопуляциями лейкоцитов крови меченых TMB-PC липосом различных составов. Образцы донорской крови были получены с интервалом в один день, и количества клеток в субпопуляциях слегка варьируют. Рис. 2. Гистограммы FACS-анализа образцов крови после инкубации с липосомами и лизиса эритроцитов. Верхняя панель: распределение клеток периферической крови в образцах без липосом, FS – малоугловое светорассеяние, SS – светорассеяние под углом 90о, А – лимфоциты, В – моноциты, С – нейтрофилы. Панели 0, 30, 60 min: флуоресценция фагоцитированных липосом «гейтированная» по субпопуляциям лейкоцитов после инкубаций 0, 30, 60 мин (добавлен тушитель флуоресценции адсорбированных липосом). TMB-PC липосомы следующих составов: только из ePC (образец L) и МТХ-липосомы ePC–MTXDG, 9:1 (образец L–MTXDG), ePC–MTXDG–PI, 8:1:1 (образец L–MTXDG–PI), ePC–MTXDG–CMG-PE, 8:1:1 (образец L–MTXDG–CMG-PE), ePC–MTXDG–GM1, 8:1:1 (образец L–MTXDG–GM1). Очевидно, что лимфоциты не аккумулируют липосомы, что соответствует отсутствию функции фагоцитов у этих клеток и согласуется с современными представлениями о том, что основное количество наночастиц в кровотоке фагоцитируется моноцитами и нейтрофилами. На Рис. 3 результаты FACS-анализа представлены в виде кинетики роста процента клеток, поглотивших липосомы в течение 1 ч инкубации. Рис. 3. Кинетика поглощения липосом моноцитами (А) и нейтрофилами (Б) цельной крови человека ex vivo. Приведены средние значения ±SE двух независимых экспериментов, каждый в двух повторах. С учетом разброса данных в повторах примерно 10 %, можно сделать вывод, что МТХ-липосомы быстрее накапливаются в моноцитах, чем липосомы без пролекарства, вне зависимости от наличия тех или иных защитных амфифильных молекул. То есть как таковые молекулы MTXDG в мембране способствуют ускорению поглощения липосом популяцией моноцитов. Введение в мембрану пептидолипида лишь незначительно замедляет фагоцитоз МТХ-липосом моноцитами. В случае же ганглиозида GM1 и PI липосомы медленнее накапливаются в моноцитах по сравнению с МТХ-липосомами без амфифила (Рис. 3). Но к 60 мин все различия между образцами МТХ-липосом нивелируются, в их фагоцитозе участвуют примерно 60-70 % моноцитов и около 98 % нейтрофилов. При этом интенсивность поглощения липосом нейтрофилами (средняя интенсивность флуоресценции, Х-mean) значительно ниже, чем моноцитами (Рис. 4): с учетом примерно в 7 раз большей численности популяции нейтрофилов каждая клетка поглощает примерно в 15 раз меньше липосом, чем моноцит. Можно связать низкий уровень фагоцитоза и быстрый выход на насыщение липосомами в случае нейтрофилов с тем, что ведущая роль этих клеток состоит в защите от бактериальных, но не вирусных инфекций, а липосомы по размерам сравнимы с вирусными частицами. Рис. 4. Cредняя интенсивность флуоресценции (Х-mean) поглощенных липосом для позитивных популяций моноцитов (А) и нейтрофилов (Б). Эндоцитоз липосом фагоцитами крови опосредуют рецепторы белков плазмы, ассоциированных с липосомами. Основными рецепторами для захвата липосом считаются рецепторы к константным областям иммуноглобулинов класса G (FcγR I-III) и рецепторы компонентов системы комплемента C3b и iC3b (CR1 и CR3, соответственно). В наших работах было установлено, что компонент C3b на поверхности липосом без MTXDG не детектировался при иммуноблоттинге, то есть его количество было ничтожно мало, в то время как для L–MTXDG–PI наблюдались полосы его фрагментов. Эти данные и различный уровень поглощения клетками МТХ-липосом и липосом без пролекарства (при инкубации 60 мин, Рис. 4, кроме CMG-липосом) согласуются с данными литературы о поглощении липосом моноцитами через узнавание опсонинов на поверхности липидного бислоя. Анализ средней интенсивности флуоресценции поглощенных липосом для позитивных популяций моноцитов и нейтрофилов (Рис. 4) позволяет также сделать следующие выводы. Наличие CMG-PE (независимо от присутствия пролекарства) способствовало интернализации моноцитами. Для нейтрофилов, в целом, имеется тенденция более активного фагоцитоза липосом с пролекарством клетками, независимо от наличия амфифила в бислое. Однако достоверны различия лишь для CMG-липосом и липосом без стабилизирующего агента. Неожиданный эффект обнаружили МТХ-липосомы с ганглиозидом GM1. Несмотря на то, что через 30 мин большее число моноцитов поглощает MTX-липосомы без амфифилов, чем MTX-липосомы с GM1 (Рис. 3), средняя интенсивность флуоресценции моноцитов достоверно больше для липосом L–MTXDG–GM1 по сравнению с липосомами без ганглиозида L–MTXDG как через 30, так и через 60 мин инкубации (Рис. 4). При том, что само по себе присутствие GM1 не приводило к более интенсивному фагоцитозу липосом моноцитами, при наличии в бислое сочетания пролекарства и ганглиозида моноциты поглотили этих липосом больше, чем любых других. Можно предположить, что в данном случае рецепторы моноцитов распознают молекулы ганглиозида GM1 либо белков плазмы, ассоциированных с данными липосомами. Мы решили сравнить МТХ-липосомы, содержащие различные экранирующие молекулы, на предмет связывания в плазме компонента С3 и продуктов его расщепления. Для этого препараты липосом инкубировали в 80%-ой плазме крови 15 мин (так же, как при изучении гемосовместимости, когда было показано влияние МТХ-липосом на СК). Затем гель-хроматографией на сефарозе выделяли фракции, содержащие липосомы, и определяли в них суммарное количество белка. В качестве контроля эффективности отделения липосом-белковых комплексов от основного количества не связавшихся белков плазмы использовали образцы плазмы, проинкубированные с PBS. В результате иммуноблоттинга с антителами к белку С3 (Рис. 5A) установлено, что МТХ-липосомы с ганглиозидом GM1 и пептидолипидом CMG-PE вызывают значительную фрагментацию этого компонента СК с образованием продуктов расщепления С3b. В случае липосом L–MTXDG–PI и L–MTXDG количество связанного С3 и продуктов его расщепления заметно меньше. Сопоставление с данными цитометрии на 30 мин (Рис. 4А) показывает, что именно липосомы L–MTXDG–GM1 и CMG-липосомы проявляют примерно одинаковую и наибольшую из всех липосом интенсивность поглощения моноцитами. Причем в случае CMG-липосом усиления фагоцитоза моноцитами за счет присутствия в мембране MTXDG не наблюдается, в отличие от GM1-липосом (Рис. 4А). Очевидно, именно остаток CMG-PE определяет взаимодействие с белками (и последующее взаимодействие с моноцитами), поскольку в силу своей структуры он экспонирован над поверхностью липосом в большей степени, чем остаток МТХ. Иммуноблоттинг с антителами к IgG (Рис. 5Б) не выявил различий между вариантами липосом, причем уровень связывания иммуноглобулинов оказался значительно ниже, чем в случае компонента С3. Рис. 5. Идентификация белков, ассоциированных с липосомами, с помощью иммуноблоттинга с использованием антител к компоненту системы комплемента С3 (А), к иммуноглобулинам класса G (Б): “+” — положительный контроль, плазма в разведении 1/500; “-” — отрицательный контроль, плазма после инкубации с PBS, гель-фильтрации и делипидизации; 1-5 — образцы липосом L (1), L–MTXDG (2), L–MTXDG–PI (3), L–MTXDG–GM1 (4), L–MTXDG–CMG-PE (5) после 15-мин инкубации с плазмой крови человека, выделения липосом-белковых комплексов и делипидизации. Наши результаты показывают, что наличие в мембране липосом пролекарства метотрексата, в целом, усиливает их фагоцитоз как моноцитами, так и нейтрофилами (последние значительно менее активно поглощают липосомы). Введение фосфатидилинозита в МТХ-липосомы практически не влияет на их поглощение, а пептидолипид CMG-PE скорее способствует накоплению липосом моноцитами. Ганглиозид GM1 оказывает двойственный эффект: предположительно, он экранирует МТХ-липосомы от фагоцитоза одной популяцией моноцитов (отсюда значительно меньшая доля позитивных моноцитов после 30 мин инкубации), но увеличивает эффективность поглощения моноцитами другой популяции, вероятно, c повышенной экспрессией рецепторов к фрагментам С3b, что выражается в высокой средней интенсивности флуоресценции моноцитов. Лимфоциты – главные клетки иммунной системы, обеспечивающие гуморальный и клеточный иммунитет – по нашим данным составили примерно 40 % всей популяции лейкоцитов крови (Рис. 2). За 1 час инкубации с кровью мы не наблюдали поглощения липосом лимфоцитами. Более того, по данным липтературы, через 3 ч инкубации лимфоциты также не аккумулировали липосомы (другого состава), причем в цитируемой работе учитывались не только интернализованные, но и адсорбированные/связанные на поверхности клеток липосомы. Исследование удерживания пролекарств в бислое с помощью фракционирования в асимметричном потоке Аликвоту липосом, содержащих пролекарство (ePC–MTXDG, ePC–MTXDG–PI или ePC–MlphDG–PI) смешивали с равным объемом DSPE-PEG мицелл в соотношении 1 к 1 по концентрации так, чтобы суммарно в виале получить смесь 1 mg/ml. Смесь инкубировали при 37°C при постоянном перемешивании в течение 24 часов. Каждый час 30-μl инъекция отбиралась инжектором и поступала в канал ячейки AF4. Для разделения липосом и мицелл в ячейке подавался перпендикулярный основному поток буфера. В качестве контроля мы использовали пустые липосомы (ePC или ePC–PI) с конечной концентрацией липидов в виале, аналогичной изучаемой смеси – 0.5 мг/мл, второй контроль - мицеллы (0.5 мг/мл) и третий – смесь мицелл с пустыми липосомами (ePC или ePC–PI) с суммарной концентрацией веществ в виале 1 мг/мл. Контрольные аликвоты отбирались трижды для определения вклада рассеяния липосом и мицелл в величину оптической плотности формуляций с пролекарством. Разделение проводилось в течение 35 мин. Детектировали сигнал при длинах волн 300 нм (MTXDG) и 260 нм (MlphDG). Скорость потока в детекторе – 1 мл/мин. Использована мембрана в ячейке Membrane for Eclipse LC channel: RC Membrane 10 kDa LC (Millipore). Перпендикулярный поток растворителя задерживает более крупные частицы и способствует разделению фракций. Мы наблюдали выход мицеллярной фракции через 15 мин после поступления аликвоты в канал и липосом с 21 по 26 мин. Рис. 6. Хроматограмма переноса MTXDG из ePC–MTXDG липосом на мицеллы с УФ-детекцией. Мицеллы выходят на 15 минуте после поступления аликвоты в канал; пик выхода липосом — 23 минута. Рис. 7. Хроматограмма с наложением контрольных образцов: ePC–MTXDG и мицелл (УФ-детекция). Мицеллы выходят на 15 минуте после поступления аликвоты в канал; пик выхода липосом —23 минута. Рис. 8. Хроматограмма переноса MTXDG из ePC–MTXDG–PI липосом на мицеллы с УФ-детекцией. Мицеллы выходят на 15 минуте после поступления аликвоты в канал; пик выхода липосом — 23 минута. Рис. 9. Хроматограмма переноса MlphDG из ePC–MlphDG–PI липосом на мицеллы с УФ-детекцией. Мицеллы выходят на 15 минуте после поступления аликвоты в канал; пик выхода липосом — 23 минута. Рис. 10. Кривые переноса пролекарств на мицеллы в процентах (%), где 100% - все содержащееся в бислое пролекарство. A. липосомы ePC–MTXDG–PI B. липосомы ePC–MTXDG C. липосомы ePC–MlphDG–PI За 24 ч инкубации липосом с мицеллами, во всех трех случаях наблюдали лишь незначительный перенос пролекарств в мицеллы. Для пролекарства метотрексата полученные значения похожи для двух исследованных составов бислоев и за сутки составляют около 5% от всего содержащегося в бислое пролекарства. Считая, что полное количество пролекарства это лишь 10 мольных % из бислоя, получаем потерю лишь 0.5% от всех компонентов мембраны. Для пролекарства мелфалана значение еще меньше и составляет меньше 0.2% от всех компонентов мембраны.

 

отчет за 8 семестр с рисунками

 

Индивидуальный план на 8 семестр

Краткий отчет по форме

Отзыв руководителя

 

Выписка из  лабораторного коллоквиума

 

Итоговая аттестация:

Текст НКР

Публикации

0 год обучения (2019)