Списки аспирантов и портфолио

85

Ерохина Софья Алексеевна

Дата начала обучения 2015-11-01
Дата окончания обучения 2019-10-31
Руководитель Коваленко Елена Ивановна
Специальность Молекулярная биология [03.01.03]
Статус Обучается

Отчеты аспиранта

1 год обучения (2015)

1 семестр

NK-клетки составляют минорную субпопуляцию периферических лимфоцитов крови. Несмотря на это они являются одним из важнейших компонентов врожденной иммунной системы за счет своей способности проявлять цитотоксическую активность по отношению к перерожденным и вирус-инфицированным клеткам, а также некоторым вне- и внутриклеточным патогенам. Кроме того, естественные киллеры способны регулировать как врожденный, так и адаптивный иммунный ответ за счет продукции разнообразных цитокинов и хемокинов. Комбинация этих свойств делает NK-клетки многообещающими кандидатами для применения в адоптивной иммунотерапии. Для этой цели обычно используют NK-клетки, преактивированные различными цитокинами (IL-2, IL-12, IL-15, IL-21) и/или за счет контактных взаимодействий с клетками-мишенями, несущими определенные лиганды на поверхности. Показано, что активирующие цитокины, такие как IL-2, IL-15, IL-21, стимулируют пролиферацию, созревание NK-клеток, увеличение экспрессии ими поверхностных активирующих рецепторов, продукцию перфорина и гранзимов. Кроме того, имеются данные, что IL-2 cтимулирует пролиферацию NK-клеток, экспрессирующих HLA-DR  (молекулу MHC класса II). Высокая экспрессия этой молекулы характерна для антиген-презентирующих клеток, однако функциональная значимость экспрессии HLA-DR в  NK-клетках, так же как и физиологическая роль HLA-DR-позитивных NK-клеток все еще не совсем ясны и нуждаются в более детальном изучении. Известно, что часть NK-клеток человека несет на поверхности молекулы HLA-DR и без стимуляции. Точно не ясно, представляют ли HLA-DR-позитивные NK-клетки отдельную субпопуляцию, формирующуюся на определенной стадии развития, или HLA-DR появляется на клетках в ответ на активацию. 

Недавно было показано, что одним из наиболее перспективных стимулирующих агентов для наращивания NK-клеток для адоптивной терапии являются клетки линии К562, экспрессирующие мембраносвязанный IL-21 (mbIL-21), в комбинации с IL-2 и другими растворимыми цитокинами. mbIL-21 вместе с IL-2 вызывают повышенную пролиферацию NK-клеток, усиление цитотоксичности и продукции NK-клетками провоспалительных цитокинов. Однако нет данных о том, как инкубация с мембраносвязанным IL-21 влияет на экспрессию NK-клетками молекулы HLA-DR, тогда как эта молекула может быть важна для функциональной активности NK-клеток при ответе на определенные патогены и, возможно, для антиген-презентации. В связи с этим изучение экспрессии HLA-DR в условиях стимуляции IL-2 и mbIL-21 и характеристика субпопуляции HLA-DR-позитивных NK-клеток могут оказаться полезными для разработки методов направленного влияния на свойства NK-клеток.

Для получения NK-клеток человека использовали мононуклеары, выделенные из периферической крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3). NK-клетки выделяли с помощью магнитной сепарации. Экспрессию HLA-DR, CD57, CD56, CD20, CD3, CD14 оценивали методом проточной цитометрии. Для ряда экспериментов производили Сортировку субпопуляций NK-клетокна клеточном сортировщике FACSVantage Diva (Beckton Dickinson). Для стимуляции NK-клеток использовали IL-2 в концентрации 100 ед./мл, IL-21 в концентриции 10 нг/мл и фидерные клетки линии К562, экспрессирующие мембраносвязанный IL-21 (K561-mbIL-21). Соотношение количесвтва NK-клеток и фидерных клеток подбирали экспериментально.

В экспериментах по исследованию функциональной активности, цитолитическую активность NK-клеток оценивали по уровню активации каспазы-6 в клетках-мишенях с помощью набора (OncoImmunin, США) по инструкции производителя. В качестве мишеней использовали клетки линии К562, которые предварительно метили прижизненным красителем TFL4. Продукцию NK-клетками IFNγ наблюдали с помощью иммуноферментного анализа, для чего также использовали набор реагентов (Вектор Бест, Россия) согласно инструкции производителя.

В крови добровольцев, участвовавших в исследовании, NK-клетки составляли от 7 до 25% периферических мононуклеаров, после сепарации на магнитной колонке чистоту популяции NK-клеток удавалось повысить до 95-99%. В полученной популяции непосредственно после выделения анализировали экспрессию поверхностных маркеров CD56, CD20, CD3, CD14 (рис. 2). Выделенные NK-клетки соответствовали фенотипу CD3-/CD14-/CD20-/CD56+, что свидетельствует об отсутствии в образцах других лимфоцитов (Т- и В-клеток, моноцитов). Доля HLA-DR-позитивных NK-клеток, циркулирующих в периферической крови здоровых доноров, составляла в среднем 7,93±4,5 %.

Была проведена оценка влияния IL-2 и К562-mbIL-21 на экспрессию NK-клетками молекулы HLA-DR. Было установлено, что при культивировании цельной популяции NK-клеток в присутствии следующих стимулирующих факторов: IL-2, комбинации IL-2 и клеток линии К562, экспрессирующих мембраносвязанный IL-21 (К562-mbIL-21) или только К562-mbIL-21, доля HLA-DR-позитивных NK-клеток существенно возрастала во всех трех группах образцов к 6-му дню культивирования. При этом увеличивались размер и гранулярность NK-клеток, они приобретали «неправильную» форму, характерную для подвижных клеток, то есть переходили в активированное состояние. Клетки в контрольных образцах (без стимула) жили не больше 4-5 дней, и на их поверхности экспрессия HLA-DR не увеличивалась. При этом наибольшая экспрессия HLA-DR наблюдалась в образцах, содержащих комбинацию IL-2 и К562-mbIL-21 (до 94% HLA-DR+ клеток). В образцах только с  К562-mbIL-21 доля HLA-DR-позитивных NK-клеток тоже была достаточно большой, однако в отсутствие IL-2 жизнеспособность клеток была невысокой и к 6-му дню они постепенно умирали. Таким образом, наилучшим стимулом для получения  HLA-DR-позитивных NK-клеток оказалось сочетание цитокинов  IL-2 и К562-mbIL-21.

Помимо увеличения экспрессии HLA-DR и CD56, в популяции NK-клеток при длительном культивировании с цитокинами снижалась доля СD57-позитивных клеток. При этом наиболее сильный эффект также наблюдался в образцах с IL-2 и К562-mbIL-21. Молекула СD57 экспрессируется на зрелых NK-клетках, ее относят к маркерам конечной стадии дифференцировки; таким образом, в процессе культивирования с цитокинами выживали и размножались преимущественно менее дифференцированные CD57-отрицательные клетки.

Также было проведено сравнение влияние на NK-клетки растворимой и мембраносвязанной форм цитокина IL-21. Для этого свежевыделенные NK-клетки здоровых добровольцев в течение 6 дней инкубировали со следующими комбинациями стимулов: 1) IL-2; 2) IL-2 и фидерные клетки К562, экспрессирующие мембраносвязанный IL-21 (К562-mbIL-21); 3) IL-21; 4) IL-2 и IL-21; 5) IL-2, IL-21 и клетки линии К562 немодифицированные; 6) IL-21 и клетки линии К562 немодифицированные. Наибольшая экспрессия HLA-DR вновь наблюдалась в образцах с IL-2 и К562-mbIL-21, тогда как использование растворимого IL-21 даже в комбинации с IL-2 и немодифицированными клетками K562 в качестве фидерных не давало таких результатов. Однако при добавлении к IL-21 немодифицированных клеток К562 доля HLA-DR-позитивных клеток все же достоверно возрастала, что указывает на вклад cell-to-cell взаимодействий в активацию NK-клеток.

На следующем этапе были выбраны оптимальные временные условия культивирования, наиболее подходящая плотность NK-клеток и соотношение NK-клеток с фидерными клетками К562-mbIL-21 для получения NK-клеток, высоко экспрессирующих HLA-DR. Было выявлено, что наиболее благоприятная концентрация для NK-клеток - 0,5 млн/мл при концентрации фидерных клеток 0,4 млн/мл (соотношение 5:4). При большей плотности культивирования, так же как и при больших концентрациях клеток К562-mbIL-21 NK-клетки начинали быстро умирать, скорее всего, из-за недостатка питательных веществ и повышенной дегрануляции по отношению к фидерным клеткам. В указанных выше благоприятных условиях NK-клетки демонстрировали наиболее высокую экспрессию HLA-DR начиная с 6-го дня культивирования. На более ранних этапах доля HLA-DR-позитивных NK-клеток была существенно меньше.

Было проведено сравнение функциональных свойств субпопуляций NK-клеток HLA-DR+ и HLA-DR-. Для этого свежевыделенные NK-клетки в течении 6 дней инкубировали с IL-2 и K562-mbIL-21, а затем сортировали на указанные выше субпопуляции. Затем клетки инкубировали 18 ч с IL-2, и на следующий день оценивали цитотоксическую активность (методом регистрации активации каспазы-6 в клетках-мишенях) и продукцию IFNgamma (методом ИФА и внутриклеточного окрашивания цитокинов. В большинстве экспериментов HLA-DR-положительные NK-клетки демонстрировали как большую цитотоксичность, так и более интенсивную продукцию IFNgamma.

2 семестр

На предыдущем этапе работы было установлено, что инкубация NK-клеток в среде с добавлением IL-2 и фидерных клеток K-562, экспрессирующих мембраносвязанный IL-21 (К562-mbIL-21), в течение 6 и более дней приводит к значительному увеличению доли HLA-DR-позитивных NK-клеток: от 5,7% ex vivo (среднее значение по 23 обследованным донорам) до 93% после стимуляции. Использование IL-2, а также растворимого IL-21 и немодифицированных клеток К562 в различных комбинациях давало некоторый прирост доли HLA-DR-позитивных NK-клеток, однако гораздо менее значительный (максимальное зафиксированное значение составляло 42% клеток). На основе полученных данных были подобраны оптимальные временные условия культивирования, наиболее подходящая плотность NK-клеток и соотношение NK-клеток с фидерными клетками К562-mbIL-21 для получения NK-клеток, высоко экспрессирующих HLA-DR. Также было установлено, что параллельно с увеличением доли клеток HLA-DR+ при стимуляции IL-2 и К562-mbIL-21 снижается доля CD57-позитивных NK-клеток и на них увеличивается экспрессия CD56. Это говорит о преимущественном выживании в данных условиях преимущественно менее дифференцированных CD57-отрицательных NK-клеток. Кроме того было проведено сравнение функциональных свойств отсортированных субпопуляций HLA-DR+ и HLA-DR-. Было показано, что в большинстве экспериментов HLA-DR-положительные NK-клетки демонстрировали как большую цитотоксичность, так и более интенсивную продукцию IFNgamma.

На следующем этапе работы основной задачей было показать, за счет чего происходит увеличение доли HLA-DR-позитивных NK-клеток при стимулировании их комбинацией IL-2 и К562-mbIL-21. Также была поставлена цель отработать и улучшить метод сортировки NK-клеток.

Для получения NK-клеток человека использовали мононуклеары, выделенные из периферической крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3). NK-клетки выделяли с помощью магнитной сепарации. Экспрессию HLA-DR, CD57, CD56, оценивали методом проточной цитометрии. Сортировку субпопуляций NK-клеток производили на клеточном сортировщике FACSVantage Diva (Beckton Dickinson). Для стимуляции NK-клеток использовали IL-2 в концентрации 100 ед./мл и фидерные клетки линии К562, экспрессирующие мембраносвязанный IL-21 (K561-mbIL-21). Соотношение количесвтва NK-клеток и фидерных клеток было подобрано экспериментально, наилучшие результаты достигались используя соотношение 4:5.

В экспериментах по исследованию функциональной активности, цитолитическую активность NK-клеток оценивали по уровню активации каспазы-6 в клетках-мишенях с помощью набора (OncoImmunin, США) по инструкции производителя. В качестве мишеней использовали клетки линии К562, которые предварительно метили прижизненным красителем TFL4. Продукцию NK-клетками IFNγ наблюдали с помощью иммуноферментного анализа, для чего также использовали набор реагентов (Вектор Бест, Россия) согласно инструкции производителя, а также методом внутриклеточного окрашивания цитокинов с последующей цитофлуориметрией.

Чтобы выяснить, связано ли увеличение доли HLA-DR-позитивных NK-клеток с размножением особой, чувствительной к IL-2, HLA-DR-позитивной субпопуляции, как это показано в статье Evans et al., 2011, или же стимуляция IL-2 и/или mbIL-21 индуцирует экспрессию HLA-DR de novo, в первую очередь был проанализирован уровень экспрессии гена альфа-субъединицы HLA-DR по уровню внутриклеточной мРНК в NK-клетках до и после стимуляции IL-2 ± К562-mbIL-21. Мы показали, что уровень мРНК HLA-DR увеличивался после 6 дней стимуляции цитокинами, причем при использовании комбинации цитокинов IL-2 и К562-mbIL-21 этот уровень был значительно выше, чем при использовании только IL-2.

На следующем этапе мы проанализировали реакцию на присутствие цитокинов субпопуляций HLA-DR- и HLA-DR+, выделенных из цельной популяции NK-клеток с помощью клеточной сортировки. Предварительно были подобраны оптимальные условия, позволяющие получить чисто отсортированные субпопуляции HLA-DR- и HLA-DR+. Для этого цельную популяцию свежевыделенных NK-клеток вначале подвергали стимуляции IL-2 и K562-mbIL-21 с целью увеличить долю HLA-DR-позитивных клеток, и лишь затем на 6-ой день подвергали сортировке. Данная методика позволяла выделить субпопуляцию HLA-DR+ с более высокой чистотой, так как в норме в периферической крови NK-клеток с таким фенотипом содержится мало.

После сортировки полученные субпопуляции культивировали in vitro IL-2, IL-2 и K562-mbIL-21, просто с K562-mbIL-21 и с немодифицированными клетками K562 в присутствие IL-2. Немодифицированные клетки К562 были использованы с целью оценить, насколько велико значение иных, кроме mbIL-21, поверхностных молекул на клетках линии К562 в активации NK-клеток и стимуляции экспрессии HLA-DR. Немодифицированные К562 в отсутствие IL-2 оказались неспособны поддержать жизнеспособность NK-клеток, и в этих образцах к 6-му дню живых клеток практически не осталось, поэтому они были исключены из рассмотрения. Под действием активирующих цитокинов экспрессия HLA-DR возрастала в обеих субпопуляциях, однако в разной степени. Реакция HLA-DR-отрицательных NK-клеток на присутствие только IL-2 зависела от особенностей донора: доля HLA-DR+ клеток после 6 дней стимуляции IL-2 могла варьировать от 6,1 до 40,9%. При стимуляции NK-клеток комбинацией двух цитокинов, IL-2 и mbIL-21, в обеих субпопуляциях после 6-дневной инкубации была выявлена высокая доля HLA-DR+-клеток, и, что более важно, экспрессия данной молекулы значительно возрастала и на тех клетках, на которых ее изначально не было зарегистрировано (субпопуляция HLA-DR-). Таким образом, IL-2 и mbIL-21 стимулируют не только размножение позитивных по HLA-DR клеток, но и инициируют экспрессию этой молекулы на изначально отрицательных по этому маркеру клетках. Можно заключить, что HLA-DR является маркером длительной активации NK-клеток.

На NK-клетках HLA-DR-, культивированных в присутствии только К562-mbIL-21, экспрессия HLA-DR также возрастала, хоть и в меньшей степени, чем в присутствии комбинации IL-2 и фидерных клеток. Однако, как уже отмечалось выше, клетки теряли экспрессию CD56 и постепенно погибали, к 6-му дню клеток в образцах оставалось мало, и высокий процент HLA-DR-позитивных клеток может быть результатом преимущественного выживания этой активированной субпопуляции.

Также были проведены дополнительные эксперименты по сравнению функциональных свойств субпопуляций NK-клеток HLA-DR+ и HLA-DR- после 6 дней активации IL-2 и mbIL-21. Была вновь измерена цитотоксическую активность методом регистрации активации каспазы-6 в клетках-мишенях. Исследование продукции IFNgamma  было дополнено использованием метода внутриклеточного окрашивания цитокинов, помимо анализа с помощью ИФА. Мы подтвердили полученные ранее результаты, что в большинстве случаев HLA-DR-положительные NK-клетки демонстриют как большую цитотоксичность, так и более интенсивную продукцию IFNgamma.

2 год обучения (2016)

1 семестр

На предыдущем этапе работы было установлено, что увеличение доли HLA-DR-позитивных NK-клеток при стимулировании их комбинацией IL-2 и К562-mbIL-21 происходит за счет появления экспрессии HLA-DR de novo на пверхности NK-клеток. Это было подверждено увеличением доли HLA-DR-позитивных клеток даже в предварительно отсортированной HLA-DR-негативной субпопуляции после стимуляции IL-2 и К562-mbIL-21, а также путем анализа уровня экспрессии гена альфа-субъединицы HLA-DR методом ПЦР в NK-клетках до и после стимуляции. Была отработана методика сортировки NK-клеток через 3-6 дней после стимуляции IL-2 и К562-mbIL-21.

На следующем этапе работы основной задачей было сравнить экспрессию некоторых поверхностных маркеров на HLA-DR-позитивных и негативных NK-клетках в процессе стимуляции комбинацией IL-2 и К562-mbIL-21. Также была поставлена цель усовершенствования методики стимуляции NK-клеток соникатом M. tuberculosis.

Для получения NK-клеток человека использовали мононуклеары, выделенные из периферической крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3). NK-клетки выделяли с помощью магнитной сепарации. Экспрессию HLA-DR, CD57, CD56, NKG2A, NKG2D, NKG2C, KIR, CD8, CD86, CD69, CD16, LAMP-1 оценивали методом проточной цитометрии. Для стимуляции NK-клеток использовали IL-2 в концентрации 100 ед./мл и фидерные клетки линии К562, экспрессирующие мембраносвязанный IL-21 (K561-mbIL-21) в соотношении 4:5 (фидерные клетки:NK-клетки).

В экспериментах по исследованию влияния сониката M. tuberculosis на функциональную активность NK-клеток, цитолитическую активность NK-клеток оценивали по экспрессии маркера дегрануляции LAMP-1 после инкубации с клетками-мишенями К562. Продукцию NK-клетками IFNγ наблюдали с помощью иммуноферментного анализа, для чего также использовали набор реагентов (Вектор Бест, Россия) согласно инструкции производителя.

В первую очередь было проведено сравнение динамики некоторых поверхностных маркеров на HLA-DR+ и HLA-DR- NK-клетках. Была исследована экспрессия CD57, NKG2A, NKG2D, NKG2C, KIR, CD8, CD86, CD69, CD16, LAMP-1 в течение 6 дней культивирования, измерения проводились ex vivo и на 1-ый, 3-ий и 6-ой день у 5 разных доноров. Экспрессия  KIR, CD8, CD16 сильно разнилась между донорами, так что сделать какие-то определенные выводы на основе полученных данных не представляется возможным, и требуется проведение дополнительных экспериментов. Динамика экспрессии CD69, CD57 и NKG2A в субпопуляциях HLA-DR+ и HLA-DR- оказалась сходной. Экспрессия CD69 на всех клетках возрастала, что характерно для клеток в состоянии активации. Доля CD57-позитивных клеток в обоих субпопуляциях преимущественно снижалась, тогда как NKG2A-позитивных – возрастала. Это свидетельствует о том, что выживают и размножаются преимущественно незрелые NK-клетки на ранних стадиях дифференцировки, для которых характерен фенотип CD57-NKG2A+.

Нам удалось установить, что экспрессия маркеров LAMP-1, NKG2C, NKG2D, CD86 различается между субпопуляциями HLA-DR+ и HLA-DR-. HLA-DR-позитивные NK-клетки демонстрировали гораздо более высокую экспрессию LAMP-1, которая к тому же увеличивалась гораздо быстрее, чем у HLA-DR-негативных клеток; у некоторых доноров к 6-му дню количество LAMP-1-позитивных клеток начинало уменьшаться, вероятно, за счет истощения пула гранзима В. Поскольку LAMP-1 – маркер дегрануляции NK-клеток, это свидетельствует о том, что HLA-DR-позитивные NK-клетки обладают более интенсивной естественной цитотоксической активностью.

Доля NKG2C+ NK-клеток также оказалась выше в субпопуляции HLA-DR+ по сравнению с субпопуляцией HLA-DR-. В процессе культивирования экспрессия этого рецептора у большинства доноров сначала возрастала, затем после 3-его дня у некоторых начинала снижаться. Ранее было показано, что количество NKG2C-позитивных NK-клеток возрастает при некоторых патологических состояниях, в особенности, при заражении цитомегаловирусом; при этом активирующий рецептор NKG2C характеризует субпопуляцию дифференцированных клеток, потенциальных продуцентов противовирусного IFNγ. По-видимому, экспрессия этого маркера может возрастать и в определенных активирующих условиях в ответ на стимуляцию цитокинами. Снижение доли экспрессирующих NKG2C NK-клеток к 6-му дню у некоторых доноров может быть связано с тем, что, как уже было сказано выше, в присутствие IL-2 и K562-mb-IL21 выживают и размножаются преимущественно незрелые NK-клетки, в то время как NKG2C-позитивные клетки – это по большей части клетки на более поздних стадиях развития (Lopez-Vergès et al. 2011).

Количество NKG2D на поверхности NK-клеток также возрастало в условиях стимуляции, однако на HLA-DR-позитивных клетках экспрессия этого рецептора возрастала интенсивнее, и на 6-ой день у большинства доноров она была уже значительно выше, чем на клетках HLA-DR-.  NKG2D – один из активирующих рецепторов NK-клеток, и увеличение его экспрессии свидетельствует об активации функциональной активности NK-клеток.

Значимая разница в динамике экспрессии была также зарегистрирована в отношении маркера CD86, костимуляторной молекулы, необходимой для активации Т-клеток через взаимодействие молекул MHC и TCR в процессе антигенпрезентации. Экспрессия CD86 возрастала в большей степени на HLA-DR-положительных клетках, что может косвенно свидетельствовать о наличии на NK-клетках, полученных при стимуляции IL-2 и mbIL-21, полноценно функционирующего антиген-презентирующего комплекса. Это согласуется с имеющимися работами по особенностям фенотипа поверхностных маркеров HLA-DR-позитивных NK-клеток: активированные IL-2 HLA-DR-позитивные NK-клетки характеризуются повышенной экспрессией CD80, CD86, CD70, OX40-L – молекул, играющих важную роль во взаимодействии с Т-клетками и антигенпрезентации (Hanna et al. 2004).

Таким образом, на основании полученных данных можно сказать, что HLA-DR-положительные NK-клетки, полученные после 6-тидневной стимуляции IL-2 и mbIL-21, –это клетки преимущественно на ранних стадиях дифференцировки, которые характеризуются состоянием повышенной активации: они демонстрируют более высокую, нежели HLA-DR-негативные NK-клетки, экспрессию активирующих рецепторов NKG2C и NKG2D, более интенсивную и быструю дегрануляцию по отношению к фидерным клеткам, и в процессе роста экспрессии HLA-DR начинают коэкспрессировать CD86, молекулу, необходимую для антиген-презентации.

В результате предварительных экспериментов по усовершенствованию условий стимуляции NK-клеток соникатом M. tuberculosis было установлено, что концентрация сониката, при которой удается зарегистрировать его воздействие на цитотоксическую активность NK-клеток и продукцию ими IFNγ, составляет 40 мкг/мл, при времени воздействия 18 ч.

2 семестр

На предыдущем этапе работы было проведено сравнение экспрессии некоторых поверхностных маркеров на HLA-DR-позитивных и негативных NK-клетках в процессе стимуляции комбинацией IL-2 и К562-mbIL-21. Было выявлено, что динамика экспрессии CD69, CD57 и NKG2A в субпопуляциях HLA-DR+ и HLA-DR- оказалась сходной, тогда как экспрессия маркеров LAMP-1, NKG2C, NKG2D, CD86 различалась между субпопуляциями HLA-DR+ и HLA-DR-. Экспрессия CD69 на всех клетках возрастала, что характерно для клеток в состоянии активации. Доля CD57-позитивных клеток в обоих субпопуляциях преимущественно снижалась, тогда как NKG2A-позитивных – возрастала. Это свидетельствовало о том, что при стимуляции комбинацией IL-2 и К562-mbIL-21выживают и размножаются преимущественно незрелые NK-клетки на ранних стадиях дифференцировки, для которых характерен фенотип CD57-NKG2A+. При этом HLA-DR-позитивные NK-клетки демонстрировали более высокую экспрессию LAMP-1, NKG2D и CD86. Доля NKG2C+ NK-клеток также оказалась выше в субпопуляции HLA-DR+ по сравнению с субпопуляцией HLA-DR-. Таким образом, удалось установить, что HLA-DR-положительные NK-клетки, полученные после 6-тидневной стимуляции IL-2 и mbIL-21, характеризуются состоянием повышенной активации: демонстрируют более высокую экспрессию активирующих рецепторов, более интенсивную и быструю дегрануляцию по отношению к фидерным клеткам, и приобретают экспрессию CD86, молекулы, необходимую для антиген-презентации.

Также в результате предварительных экспериментов по усовершенствованию условий стимуляции NK-клеток соникатом M. tuberculosis было установлено, что концентрация сониката, при которой удается зарегистрировать его воздействие на цитотоксическую активность NK-клеток и продукцию ими IFNγ, составляет 40 мкг/мл, при времени воздействия 18 ч.

 

Целью следующего этапа работы было изучение связи экспрессии HLA-DR in vivo со стадиями дифференцировки NK-клеток, изучение функциональных особенностей свежевыделенных из крови человека HLA-DR-позитивных NK-клеток, сравнение их с особенностями HLA-DR+ NK-клеток, полученных ранее in vitro при стимуляции комбинацией IL-2 и К562-mbIL-21.

Для получения циркулирующих NK-клеток человека использовали мононуклеары, выделенные из периферической крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3). NK-клетки выделяли с помощью магнитной сепарации. Экспрессию HLA-DR, CD57, CD56, NKG2C, LAMP-1 оценивали методом проточной цитометрии. Для проведения функциональных тестов по сравнению активности свежевыделенные NK-клетки были предварительно разделены на 4 субпопуляции (CD56brightHLA-DR-, CD56brightHLA-DR+, CD56dimHLA-DR-, CD56dimHLA-DR+) с помощью клеточного сортировщика FACS Diva. Для стимуляции NK-клеток использовали IL-2 в концентрации 100 ед./мл, IL-12 и IL-15 в концентрации 10 нг/мл, фидерные клетки линии К562, экспрессирующие мембраносвязанный IL-21 (K561-mbIL-21) в соотношении 4:5 (фидерные клетки:NK-клетки).

В экспериментах по сравнению функциональной активности свежевыделенных из периферической крови HLA-DR-позитивных и негативных NK-клеток: 1) естественную цитотоксичность оценивали по экспрессии маркера дегрануляции LAMP-1 в присутствие клеток-мишеней К562 (немодифицированных) после предварительной стимуляции IL-2 в течении 20 часов; 2) антителозависимую цитотоксичность оценивали по экспрессии маркера дегрануляции LAMP-1 в присутствие клеток-мишеней C1R и антитела anti-CD20 (Rituximab); 3) продукцию IFNγ оценивали с помощью иммуноферментного анализа, для чего  использовали набор реагентов (Вектор Бест, Россия) согласно инструкции производителя, а также методом внутриклеточного окрашивания с помощью набора Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience, USA) согласно инструкции производителя.

Анализ экспрессии HLA-DR на разных стадиях дифференцировки свежевыделенных NK-клеток на 21 доноре показал, что наибольшая доля клеток HLA-DR+ представлена в менее дифференцированной субпопуляции CD56bright, а наименьшая - в сравнительно более зрелой субпопуляции CD56dimCD57+ (группа 1).  Однако у некоторых индивидов в крови был заметно повышен уровень CD56dimCD57+HLA-DR+ NK-клеток, которые в некоторых случаях также высоко экспрессировали NKG2C (группа 2). Такая комбинация поверхностных маркеров позволяет предположить  связь экспрессии HLA-DR c разновидностью NK-клеток «памяти», однако данный вопрос нуждается в дополнительном исследовании. Также у доноров из группы 2 была зарегистрирована более высокая доля HLA-DR-позитивных NK-клеток в крови в целом. Учитывая, что по литературным данным экспрессия HLA-DR также связана с пролиферацией NK-клеток, можно предположить, что у доноров из группы 2 произошла экспансия субпопуляции  CD56dimCD57+HLA-DR+ в ответ на некие изменения в организме.

Затем была произведена оценка способности свежевыделенных HLA-DR-позитивных NK-клеток продуцировать IFN-γ в ответ на стимуляцию IL-12+IL-15. Мы выявили, что у клеток CD56brightHLA-DR+ и CD56brightHLA-DR абсолютные количества синтезированного IFN-γ и процент продуцирующих клеток практически не различались. В то же время, в субпопуляции CD56dim HLA-DR-позитивные NK-клетки оказались более интенсивными продуцентами IFN-γ по обоим параметрам, чем HLA-DR-негативные клетки. Помимо этого, был произведен анализ естественной и антителозависимой цитотоксической активности среди тех же субпопуляций (CD56brightHLA-DR-, CD56brightHLA-DR+, CD56dimHLA-DR-, CD56dimHLA-DR+). По естественной цитотоксичности значимых различий между разными группами клеток выявлено не было. Однако, по результатам теста на антителозависимую цитотоксичность, HLA-DR-позитивные клетки проявили более низкую киллерную активность по сравнению с HLA-DR-негативными клетками в обеих субпопуляциях, CD56bright и CD56dim. Таким образом, если сравнивать свежевыделенные HLA-DR-позитивные NK-клетки и клетки, полученные на более ранних этапах работы при стимуляции комбинацией IL-2 и К562-mbIL-21, то можно сделать вывод о том, что эти клетки не идентичны и различаются по степени функциональной активности и ответу на цитокины. Скорее всего, более активные функциональные проявления HLA-DR-позитивных NK-клеток, полученных in vitro при многодневной стимуляции, связаны не только с наличием на поверхности молекулы HLA-DR, но и с комплексными внутренними перестройками, включающими в себя повышение экспрессии рецепторов активации, приобретение ко-стимуляторных молекул, таких как CD86, и т.д. Кроме того, при длительной стимуляции выживают и размножаются преимущественно клетки с более «молодым» фенотипом (CD56brightCD57-NKG2A+); in vivo же, как показало наше исследование, в крови могут встречаться как похожие клетки CD56brightCD57-HLA-DR+, так и более зрелые клетки CD56dimCD57+HLA-DR+. Физиологическую значимость тех и других разновидностей HLA-DR-позитивных клеток еще предстоит установить.

3 год обучения (2017)

1 семестр

На предыдущем этапе работы было установлено, что in vivo в периферической крови HLA-DR-позитивные NK-клетки встречаются преимущественно среди менее дифференцированных клеток CD56bright, однако у части обследованных добровольцев была также выявлена группа клеток CD56dimCD57+HLA-DR+ с признаками терминально дифференцированных. Также было показано, что свежевыделенные CD56dimHLA-DR+  NK-клетки обладают повышенной способностью продуцировать IFNγ в ответ на стимуляцию цитокинами по сравнению с клетками CD56dimHLA-DR, и что и в обеих субпопуляциях CD56bright и CD56dim HLA-DR-позитивные NK-клетки демонстрировали пониженную антител-зависимую цитотоксичность.

Целью следующего этапа работы было выявить связь увеличения экспрессии HLA-DR при стимуляции NK-клеток с их пролиферацией, а также сравнить воздействие модифицированных (с IL-21 на поверхности) и немодифицированных фидерных клеток линии К562 на активацию и пролиферацию NK-клеток для выявления причин столь интенсивной экспрессии HLA-DR в присутствие K562-mbIL21. Кроме того, планировалось провести эксперименты по титрованию сониката M. tuberculosis для определения подходящей концентрации для стимуляции NK-клеток, так как было выявлено, что использование выбранной ранее концентрация 40 мкг/мл приводит к повышенной смертности NK-клеток.

Для получения периферических NK-клеток человека использовали мононуклеары, выделенные из периферической крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3). NK-клетки выделяли с помощью магнитной сепарации. Для экспериментов по оценке пролиферативной активности свежевыделенные NK-клетки метили CFSE, затем размытие CFSE в делящихся клетках, а также поверхностную экспрессию HLA-DR, CD56 оценивали методом проточной цитометрии. Для элиминации из анализа клеток, ушедших в апоптоз, использовали краску SytoxRed, проникающую в гибнущие клетки. Для стимуляции NK-клеток использовали IL-2 в концентрации 100 ед./мл, IL-21 в концентрации 10 нг/мл, фидерные клетки линии К562, экспрессирующие мембраносвязанный IL-21 (K561-mbIL-21), и немодифицированные клетки линии К562 в соотношении 4:5 (фидерные клетки:NK-клетки) в разных комбинациях.

В экспериментах по титрованию сониката M. tuberculosis функциональную активность NK-клеток оценивали по продукции IFNγ с помощью иммуноферментного анализа, для чего  использовали набор реагентов (Вектор Бест, Россия) согласно инструкции производителя, а также методом внутриклеточного окрашивания с помощью набора Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience, USA) согласно инструкции производителя. Продукцию IFNγ индуцировали смесью цитокинов IL-12+IL-15, по 10 нг/мл, в присутствие и в отсутствие сониката, в течении 24 ч. Выживаемость клеток регистрировали по окрашиванию красителем SytoxRed.

Для анализа связи экспрессии HLA-DR на NK-клетках с пролиферацией были использованы следующие стимулирующие условия: IL-2, IL-21, K562-mbIL-21, IL-2+IL-21, IL-2+K562 (немодифицир.), IL-2+K562-mbIL21. При использовании последней комбинации (IL-2+K562-mbIL21) нам ранее удалось получить наибольшую долю HLA-DR-экспрессирующих NK-клеток в течении 6-дневной стимуляции. В присутствии только немодифицированных клеток К562 NK-клетки быстро погибали, поэтому данный контроль не использовался. Измерения внутриклеточного свечения CFSE в HLA-DR+ и HLA-DR NK-клетках производили на 4 и 7 день стимуляции. Было выявлено, что HLA-DR-позитивные NK-клетки вступали в пролиферацию при всех условиях стимуляции, и пролиферировали гораздо активнее HLA-DR-негативных NK-клеток. Особенно высокий процент делящихся клеток наблюдался в образцах, где присутствовали IL-2 и фидерные клетки K562-mbIL21. HLA-DR-негативные клетки значительно пролиферировали только в образцах с чистым IL-2 и IL-2+ K562-mbIL21, в остальных образцах пролиферация была в среднем ниже 30% или вовсе отсутствовала. Выявленные закономерности согласуются с полученными ранее данными о том, что большая часть полученных in vitro HLA-DR-позитивных NK-клеток имеет фенотип CD57, то есть малодифференцированных клеток, способных интенсивно пролиферировать.

Была выдвинута гипотеза, что повышение экспрессии HLA-DR и высокая пролиферативная активность NK-клеток в присутствие модифицированных фидерных клеток K562-mbIL21 обуславливается более интенсивными межклеточными взаимодействиями и индукцией повышенного цитотоксического ответа этими клетками, в отличие от обычных К562. Однако, анализ дегрануляции NK-клеток после 2, 4 и 24 часов совместной инкубации c фидерными клетками показал, что значимой разницы между цитотоксическим ответом NK-клеток (как HLA-DR-позитивных, так и HLA-DR-негативных) на K562 и K562-mbIL21 нет. Также не было выявлено различий между динамиками гибели обоих типов фидерных клеток. Таким образом, интенсивный ответ NK-клеток на присутствие фидерных клеток K562-mbIL21 является, вероятно, по большей части результатом активации путей, связанных с рецептором к IL-21.

Помимо вышеперечисленного, была также проведена серия экспериментов по инкубации NK-клеток с соникатом микобактерий в присутствие IL-12+IL-15 в течении 24 ч с последующей оценкой IFNγ-продуцирующей активности. Было выявлено, что все опробованные концентрации от 10 мкг/мл до в среднем 200 нг/мл приводили к ингибированию продукции IFNγ, при этом данный эффект имел дозозависимый характер. При использовании концентраций ниже 100-200 нг/мл ингибирование прекращалось и даже была зарегистрирована тенденция к увеличению продукции IFNγ в CD56bright NK-клетках, однако, недостоверная. Аномальная смертность NK-клеток по истечении 24 часов была выявлена только при высоких дозах сониката, более 5 мкг/мл. Разницы в ответе HLA-DR-позитивных и HLA-DR-негативных клеток на соникат выявлено не было. Таким образом, требуется постановка дополнительных экспериментов с низкими дозами сониката (менее 100 нг/мл) для решения вопроса о возможном ответе NK-клеток на присутствие разрушенных микобактерий в среде, и роли в этом HLA-DR-позитивных клеток.

4 год обучения (2018)

На предыдущем этапе работы было установлено, что как у здоровых, так и у больных туберкулезом доноров, в культуре PBMC HLA-DR-позитивные NK-клетки демонстрируют более интенсивную продукцию IFNγ в ответ на стимуляцию соникатом, по сравнению с HLA-DR-негативными NK-клетками.  В то же время, в культуре изолированных NK-клеток наблюдалось дозозависимое ингибирование продукции IFNγ после 24 ч инкубации с IL-2 и микобактериальными антигенами, как в HLA-DR+, так и в HLA-DRNK-клетках, в широком диапазоне концентраций сониката (от 0,1-0,25 до 40 мкг/мл). При более низких концентрациях никакого эффекта на продукцию IFNγ отмечено не было. Этот факт свидетельствует о том, что в отсутствие клеточного микроокружения (РВМС) функционирование NK-клеток существенно подавляется продуктами разрушенных микобактерий.

Также было ваыявлено, что при долговременном культивировании изолированных NK-клеток от здоровых доноров в присутствии IL-2 и сониката M. tuberculosis увеличиваетсмя доли HLA-DR-экспрессирующих клеток, по сравнению с образцами только с IL-2. Также возрастало процентное содержани NKG2A+ NK-клеток, тогда как доля клеток CD57+ и KIR+ снижалась. Таким образом, NK-клетки с фенотипом менее зрелых (NKG2A+CD57KIR), экспрессирующие маркер активации HLA-DR, преимущественно выживают и пролиферируют в присутствии разрушенных микобактерий.

Были проведены подготовительные эксперименты по титрованию блокатора IL-21 (rhIL-21R), для оценки его ингибирующего действия на индукцию экспрессии HLA-DR в NK-клетках.

В задачи следующего этапа работы входило:

  1. На основании проведенных титровочных экспериментов, поставить ряд экспериментов по блокированию взаимодействия IL-21 и IL-21R при активации NK-клеток in vitro в двух системах: с использованием растворимого IL-21 или фидерных клеток K562, экспрессирующих мембраносвязанный IL-21, в комбинации с IL-2. Оценить влияние данной блокировки на экспрессию NK-клетками маркера активации HLA-DR;
  2. По сходной схеме провести ряд экспериментов по блокированию взаимодействия IFNγ и IFNγR, чтобы проверить влияние произведенного самими NK-клетками IFNγ на индукцию экспрессии HLA-DR;
  3. Для изучения внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в индукции экспрессии HLA-DR, поставить пробные эксперименты по ингибированию активности транскрипционных факторов STAT1, STAT3 и ERK1/2 в условиях стимуляции NK-клеток in vitro комбинацией IL-2+IL-21.

Для получения периферических NK-клеток человека использовали мононуклеары, выделенные из периферической крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3). NK-клетки выделяли с помощью магнитной сепарации. Для стимуляции NK-клеток в экспериментах с блокаторами IL-21 использовали IL-2 в концентрации 100 ед./мл, IL-21 в концентрации 50 нг/мл и фидерные клетки линии К562, экспрессирующие мембраносвязанный IL-21 (K561-mbIL-21), в соотношении 4:5 (фидерные клетки:NK-клетки).

Для блокировочных экспериментов использовали соответствующие ингибиторы в следующих концентрациях: растворимая форма rhIL-21R –  5, 10 и 25 мкг/мл; антитело к IFNγR1 – 0.01, 0.05, 0.1, 1, 10 мкг/мл; флурадабин фосфат (ингибитор STAT1) – 0.1, 1, 10 мкг/мл; Cryptotanshinone (ингибитор STAT3) – 0.1, 1, 10 мкг/мл; FR 180204 (ингибитор ERK ½) – 0.5, 5, 50 мкг/мл.

Изменения в экспрессии HLA-DR оценивали методом проточной цитометрии, выживаемость клеток регистрировали с помощью внутриклеточного красителя SytoxRed (окрашивает апоптотические клетки).

Было выявлено, что при стимуляции NK-клеток IL-2 и растворимым IL-21 в присутствии растворимой формы rhIL-21R блокируется IL-21-обусловленный эффект повышения экспрессии HLA-DR (по сравнению с образцом только с IL-2) уже начиная с концентрации 5 мкг/мл, причем снижается как доля HLA-DR-экспрессирующих клеток, так и интенсивность экспрессии данной молекулы (измерения производились на 6-ой день). В то же время, при стимуляции NK-клеток IL-2 и фидерными клетками K561-mbIL-21 ингибирующий эффект растворимой формы rhIL-21R был гораздо ниже либо, в некоторых экспериментах, отсутствовал вовсе. Полученные данные говорят о том, что, вероятнее всего, в процессе взаимодействия с фидером NK-клетки получают активирующий сигнал не только за счет распознавания мембраносвязанного IL-21 на поверхности K562, но и других потенциально активирующих молекул.

При стимуляции NK-клеток IL-2 и растворимым IL-21 в присутствии антител к IFNγR1 при концентрациях 0.1 и 1 мкг/мл на 6-ой день было зарегистрировано значимое снижение доли HLA-DR-экспрессирующих клеток и интенсивности экспрессии данной молекулы по сравнению с образцами без блокатора. При концентрации антител к IFNγR1 10 мкг/мл (на данный момент проведен только 1 эксперимент) наблюдалось падение процентного содержания HLA-DR-экспрессирующих клеток практически до нуля в сравнении с контролем, причем и в образцах только с IL-2, и в образцах c IL-2+IL-21. Данный эффект указывает на то, что, по крайней мере частично, индукция экспрессии HLA-DR в NK-клетках, активированных IL-2 и IL-21, происходит за счет запуска синтеза IFNγ, который, в свою очередь, связывается с собственными  рецепторами IFNγ на поверхности NK-клеток (аутостимуляция) и стимулирует повышение экспрессии HLA-DR. Подобный путь активации экспрессии гена альфа-цепи HLA-DR, с участием IFNγR1, STAT1 и непосредственного транскрипционного регулятора MHC II класса CIITA, описан в литературе и может быть реализован в NK-клетках.

Использование антител к IFNγR1 при стимуляции NK-клеток IL-2 и фидерными клетками K561-mbIL-21 не дало однозначных результатов: в некоторых экспериментах была отмечена немного сниженная доля HLA-DR-позитивных клеток по сравнению с образцом без блокатора, тогда как в части экспериментов, наоборот, в образцах с антителом к IFNγR1 процентное содержание HLA-DR-позитивных клеток было выше (были использованы концентрации от 0.01 до 0.1 мкг/мл). Для прояснения картины необходимо проведение дополнительных экспериментов и тестирование более высоких концентраций антител к IFNγR1.

В результате пробных экспериментов по ингибированию активности транскрипционных факторов STAT1, STAT3 и ERK1/2 в условиях стимуляции NK-клеток in vitro комбинацией IL-2+IL-21 были отмечены следующие тенденции (измерения проводились на 6 день):

  • использование флурадабин фосфата (ингибитора STAT1) в концентрации 10 мкг/мл в большинстве экспериментов приводило к снижению доли HLA-DR-позитивных NK-клеток, по сравнению с образцами без ингибитора, либо эффект был не зничителен;
  • использование в-ва FR 180204 (ингибитор ERK ½) в концентрациях 5 и 50 мкг/мл в большинстве экспериментов приводило к усилению экспрессии HLA-DR на NK-клетках, и в некоторых случаях – к снижению; требуются дополнительные исследования;
  • эффект от использования в-ва Cryptotanshinone (ингибитор STAT3) не однозначен и требует ряда дополнительных экспериментов.