Потенциалозависимые Na+ и K+ каналы (Nav и Kv каналы) активируются при изменении трансмембранного (ТМ) электрического потенциала и играют ключевую роль в функционировании сердечно-сосудистой, нервной и мышечной систем организма, в частности, отвечая за проведение нервного импульса и болевых сигналов. Нарушение работы Nav и Kv каналов человека приводит к развитию ряда заболеваний, например, судорожных расстройств, периодического паралича, миотонии, миастении, атаксии и аритмий. Кроме того, K+ каналы играют важную роль в работе иммунной и эндокринной систем, в частности регулируя выброс инсулина в бета-клетках поджелудочной железы. В настоящее время соединения, действующие на потенциалозависимые каналы, широко используются при терапии ряда заболеваний ЦНС. Эти каналы также рассматриваются в качестве перспективных мишеней для лечения мигрени, хронической боли, аутоиммунных заболеваний и диабета. Несмотря на огромную фундаментальную значимость и важность для практических разработок в области медицины и фармакологии, многие аспекты структурной организации Nav и Kv каналов, а также механизмы их потенциалозависимой активации и регуляции остаются малоизученными. Потенциалозависимые ионные каналы имеют гомологичное модульное строение и состоят из четырех одинаковых субъединиц (Kv) или четырех псевдо-субъединиц в составе одной слитной полипептидной цепи (Nav), окружающих ионную пору. Каждая из псевдо-субъединиц включает в себя потенциалочувствительный (сенсорный) домен (ПЧД), сформированный четырьмя трансмембранными спиралями (S1-S4), и фрагмент (S5-S6), участвующий в формировании поры. На поровом домене локализованы сайты связывания различных блокаторов, способных полностью перекрывать ток ионов через пору канала. В свою очередь на ПЧД локализованы сайты связывания природных и синтетических соединений, которые модулируют процесс потенциалозависимой активации. Подобные лиганды, например, «вольт-сенсорные» токсины пауков, ингибирующие активацию, и бета-токсины скорпионов, усиливающие активацию, могут рассматриваться в качестве прообразов семейств новых лекарственных препаратов, позволяющих «регулировать» работу ионных каналов, не блокируя их. В цикле активации-инактивации ионного канала, при различных значениях ТМ потенциала, ПЧД Nav и Kv каналов переключаются между двумя конформационными состояниями, отличающимися положением датчика потенциала – спирали S4. Активированное состояние ПЧД (спираль S4 поднята) наблюдается при деполяризации мембраны, а состояние покоя (спираль S4 опущена) наблюдается при гиперполяризации мембраны. В настоящее время структура и динамика активированного состояния сравнительно хорошо охарактеризованы методами структурной биологии, в то время как состояние покоя остается малоизученным из-за невозможности воспроизвести ТМ потенциал покоя в условиях эксперимента. В то же время именно на это состояние действуют многие модуляторы каналов, например, токсины пауков. Целями проекта являются: разработка метода, позволяющего фиксировать ПЧД Nav каналов в состоянии покоя для структурных исследований, изучение структурно-функциональных аспектов взаимодействия ПЧД каналов человека с токсинами, влияющими на процесс потенциалозависимой активации, а также исследование механизмов фолдинга ПЧД в мембраномоделирующем окружении in vitro. Для решения задач, стоящих перед проектом, предлагается применить биоинженерный подход, основанный на стабилизации определенных конформационных состояний ПЧД с помощью кросс-сшивок, например, используя введенные в молекулы остатки цистеина, замкнутые в дисульфидную связь. Ранее такой подход успешно применялся в электрофизиологических экспериментах. В качестве объекта исследования выбран ПЧД II-й псевдо-субъединицы (ПЧД-II) Na+ канала скелетных мышц человека – Nav1.4. Ранее структура и динамика ПЧД-II была исследована авторами в рамках Проекта-2016 методами ЯМР- и ЭПР-спектроскопии. Был охарактеризован комплекс ПЧД-II с токсином Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei, однако конформационное состояние, в котором находился изучаемый домен, так и не было однозначно определено. В Проекте-2019 предлагается зафиксировать ПЧД-II как в состоянии покоя, так и в активированном состоянии. Это позволит исследовать структуру и динамику определенных состояний ПЧД, а также их взаимодействие с «модулирующими» лигандами: «вольт-сенсорными» токсинами пауков и бета-токсинами скорпионов. В результате будет изучена структура и динамика ПЧД в состоянии покоя, ранее не доступном для прямых исследований, будут картированы интерфейсы взаимодействия ПЧД в состоянии покоя с лигандами, влияющими на процесс потенциалозависимой активации и определены пространственные структуры комплексов ПЧД/токсин. На основании полученных данных будут предложены модели потенциалозависимой активации и регуляции работы Nav каналов высших организмов. Кроме того, на примере ПЧД канала Kv2.1 человека, представленного в мозге и бета-клетках поджелудочной железы, предлагается исследовать термодинамику процесса фолдинга ПЧД in vitro. Ранее мы показали, что фолдинг этого домена (переход из развернутого в свернутое состояние) проходит в два этапа и включает дополнительное промежуточное состояние. Это позволит впервые изучить структуру и термодинамику образования промежуточного состояния в процессе фолдинга небольших мембранных белков. В процессе выполнения проекта будет получен ряд уникальных результатов, не имеющих мировых аналогов. Выполнение проекта позволит получить новые данные о структурной организации и механизмах регуляции потенциалозависимых каналов экзогенными лигандами (токсинами), а также лучше понять природу сил, отвечающих за стабилизацию пространственной структуры мембранных белков. Результаты исследования будут интересны не только с фундаментальной точки зрения, но, в перспективе, могут быть полезны при создании новых биомедицинских препаратов направленного действия.