Настоящий проект является логическим продолжением нашей работы в рамках гранта РНФ "Возрастные изменения в структуре гуморального иммунитета" в 2014-2018 гг. В рамках предыдущего гранта, нами были разработаны лучшие на сегодняшний день методы для практически безошибочного массированного анализа репертуаров полноразмерных вариабельных фрагментов генов тяжелых цепей иммуноглобулинов с использованием молекулярного баркодирования (Shugay et al., Nature Methods, 2014; Turchaninova et al., Nature Protocols, 2016). С использованием новых методов построения деревьев гипермутирующих подвариантов иммуноглобулинов, мы провели анализ B-клеточного ответа на вакцинацию живой вакциной желтой лихорадки для здоровых добровольцев молодого (20-30) лет и среднего (около 50 лет) возраста. На основе анализа В-клеточного репертуара методом высокопроизводительного секвенирования ампликонов В-клеточных рецепторов было показано, что иммунный ответ индивидов среднего возраста разительно отличается от ответа молодых добровольцев в сторону менее эффективного использования механизма соматической гипермутации и более слабой селекции В-клеток в герминальных центрах (Davydov et al., Frontiers Immunology, 2018). Было также проведено несколько сопутствующих исследований по репертуарам Т- и В-клеточных рецепторов. В общей сложности, в рамках предыдущего проекта нами было опубликовано более 15 работ, в том числе в ведущих рецензируемых журналах: Nature, Immunity, Nature Methods, Nature Protocols, PLOS Comp Biol., J. Immunology, Frontiers in Immunology. Предметом нашего исследования в рамках нового проекта станут функциональные субпопуляции В лимфоцитов и плазматических клеток. В частности, нас будут интересовать различия между репертуарами B-клеточных рецепторов/продуцируемых антител функциональных субпопуляций B-лимфоцитов памяти и плазматических клеток, отличающихся поверхностными маркерами, статусом донора (в частности, выраженные изменения в представленности субпопуляций В лимфоцитов периферической крови происходят в ходе беременности), пластичность субпопуляций B-лимфоцитов (способность клонов В-клеток в переходить из одной субпопуляции в другую, направленность этих процессов), сцепленность определенных изотипов антител и функционального статуса В-лимфоцитов (спектра продуцируемых цитокинов, поверхностных рецепторов, активных сигнальных путей). Мы также планируем исследовать В лимфоциты и плазматические клетки в периферической крови и в опухолевом инфильтрате пациентов с онкологическими заболеваниями. Ранее нами было показано, что уровень экспрессии, клональность репертуаров, и изотип антител, продуцируемых в опухолевом микроокружении, выраженно коррелирует с прогнозом течения меланомы человека (Bolotin et al., Nature Biotechnology, 2017). Наши данные и целый ряд недавних работ указывают на важнейшую роль B клеток и плазматических клеток в опухолевом окружении, как продуцентов антител, цитокинов, и как антиген-презентирующих клеток, обладающих способностью интернализовать и презентировать антигены, специфично распознаваемые B-клеточным рецептором. В этом контексте нам видится особенно важным сопоставить функциональные свойства опухоль инфильтрирующих B лимфоцитов как продуцентов цитокинов и антиген-презентирующих клеток с репертуаром и изотипом продуцируемых ими антител. Так как переключение B-лимфоцитов на тот или иной изотип напрямую связано с получаемыми B-клеткой сигналами, такое переключение может сопровождаться и другими программными перестройками в экспрессионном профиле. Так, плазматические IgA клетки в опухолевом инфильтрате часто продуцируют IL-10 и ряд других цитокинов иммуносупрессорного ряда. Попутно с фундаментальными исследованиями, мы также продолжим развитие алгоритмов анализа репертуаров антител, начатое нами в недавней работе (Davydov et al., Frontiers in Immunology, 2018). В ходе работы по предыдущему гранту РНФ был также инициирован ряд коллабораций с зарубежными коллективами, и работа в рамках начатых направлений станет составной частью настоящего проекта. В частности, совместно с Проф. Lanzavecchia (Швейцария) и Kathrin Pierper (Берлин) мы начали работу над системным поиском и исследованием необычных вариантов "длинных" антител, несущих трансгеномные экзомные вставки из участков, не имеющих отношения к IG локусу (Tan J et al., Nature, 2016; Pieper K et al, Nature 2017) Также с Проф. Lanzavecchia начат проект по сверх-глубокому изучению репертуара полноразмерных вариабельных фрагментов иммуноглобулинов B лимфоцитов памяти, сопряженного с известной историей вакцинаций для данного пациента и полученной информацией о специфичности для ряда вариантов антител из того же пациента. В данной работе широко используются разрабатываемые нами биоинформатические алгоритмы для реконструкции истории эволюции В-клеток, а также методы сравнительного анализа репертуара донора и базы данных В-клеточных рецепторов с известными антигенными специфичностями. C коллективом Проф. Mårtensson-Bopp (University of Gothenburg) инициирован совместный проект по исследованию происхождения и пластичности популяций B лимфоцитов памяти на мышиной модели. Сходный по сути проект, по исследованию происхождения и пластичности популяций B лимфоцитов памяти, в том числе в контексте беременности, ведется на образцах здоровых доноров совместно с коллективом Проф. Rita Carsetti (Bambino Gesù Children Hospital, Rome). В настоящее время по результатам совместной работы с этим коллективом подготовлена статья, находящаяся на рассмотрении в журнале Nature Immunology. Также нами ведется совместная работы с Проф. Fabio Grassi (Швейцария) по исследованию репертуаров рецепторов В лимфоцитов в кишечнике в контексте различных взаимоотношений иммунной системы и микробиоты. Для исследований в рамках обозначенных выше направлений мы задействуем несколько подходов: - исследование полноразмерных репертуаров тяжелых цепей иммуноглобулинов для сортированных субпопуляций B лимфоцитов по методу (Turchaninova et al., Nature Protocols, 2016). - новые алгоритмы построения и аннотации деревьев гипермутирующих подвариантов антител - исследование транскриптома (RNA-Seq) сортированных субпопуляций B-лимфоцитов периферической крови и опухолевого инфильтрата. - массированное исследование транскриптома единичных B-клеток либо плазматических клеток (с помощью прибора 10x Genomics либо собственной эмульсионной системы, разрабатываемой нами в рамках другого проекта). - флуоцитометрический анализ профиля экспрессии цитокинов с использованием внутриклеточного окрашивания. В совокупности с подходами и моделями, имеющимися в распоряжении наших коллабораторов, мы надеемся данным проектом достичь серьезных успехов в понимании функциональной гетерогенности B лимфоцитов. Такое понимание сегодня необходимо для рационального развития подходов к вакцинации и иммунотерапии онкологических заболеваний.