Лаборатория биофотоники

Отдел геномики и постгеномных технологий

Руководитель: Лукьянов Константин Анатольевич, чл.-корр. РАН
kluk@ibch.ru+7(495)995-55-57#2518

Флуоресцентные белки, фотоактивируемые флуоресцентные белки, генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры, мечение живых клеток, генетически кодируемые фотосенсибилизаторы

Лаборатория работает над созданием новых флуоресцентных меток и методов флуоресцентного мечения биологических объектов. Особый интерес для нас представляют флуоресцентные белки семейства GFP (Green fluorescent protein) и другие методы неинвазивного флуоресцентного мечения, которые позволяют наблюдать структуры и процессы в живых клетках. Такие методы находят широкое применение в биомедицинских исследованиях, помогая расшифровать молекулярные механизмы разнообразных нормальных и патологических процессов и упрощая проведение доклинических испытаний лекарственных препаратов.

Лаборатория оснащена всем необходимым для проведения генно-инженерных работ, ведения культур клеток млекопитающих, флуоресцентной и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и оптической спектроскопии.

Лаборатория активно сотрудничает со многими лабораториями и группами Института: группой синтеза природных соединений ИБХ по изучению физико-химических свойств хромофоров флуоресцентных белков и созданию методов флуоресцентного мечения на основе их аналогов; с лабораторией молекулярных технологий ИБХ по разработке новых флуоресцентных сенсоров; с лабораторией рентгеноструктурного анализа ИБХ по анализу пространственной структуры флуоресцентных белков и направленному изменению их спектральных свойств; с лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ по применению флуоресцентных инструментов для изучения индивидуального развития.

Кроме того, Лаборатория работает над исследованиями совместно с Научно-исследовательским институтом биомедицинских технологий Нижегородской государственной медицинской академии по развитию методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, а также по применению флуоресцентного мечения в мышиных моделях опухолеобразования; с лабораторией физической биохимии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН по развитию методов время-разрешенной микроскопии для анализа биологических объектов; с Кириллом Солнцевым (Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA) по время-разрешенной спектроскопии флуоресцентных белков и хромофоров; с лабораторией Анны Крыловой (University of Southern California, Los Angeles, CA) по изучению физико-химических процессов во флуоресцентных белках; с лабораторией Владислава Верхуши (Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY) по созданию новых флуоресцентных белков; с лабораторией Jens Meiler (Vanderbilt University, Nashville, TN) по компьютерному моделированию флуоресцентных белков.

Лаборатория была образована в 2009 году путем выделения из лаборатории молекулярных технологий для биологии и медицины под руководством Сергея Анатольевича Лукьянова. Коллектив работает с флуоресцентными белками с 1999 года.

Новые флуоресцентные белки

GFP и другие флуоресцентные белки широко применяются как генетически кодируемые метки для визуализации белков и клеточных популяций в живых системах. Мы используем направленный и случайный мутагенез для создания новых вариантов флуоресцентных белков. Такой подход позволяет получать белки с необычными спектральными свойствами, определяемыми новыми хромофорными группами или аминокислотным окружением хромофора. Кроме того, мы работаем над улучшением таких характеристик, как яркость и фотостабильность, важных для практического применения  флуоресцентных белков. 

Chudakov DM, et al. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 2010, 90, 1103-63.

Pletnev VZ, et al. Structure of the red fluorescent protein from a lancelet (Branchiostoma lanceolatum): a novel GYG chromophore covalently bound to a nearby tyrosine. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013, 69, 1850-60.

Sarkisyan KS, et al. Green fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophys J. 2015, 109, 380-9.

Mishin AS, et al. Novel uses of fluorescent proteins. Curr Opin Chem Biol. 2015, 27, 1-9.

Sarkisyan KS, et al. Local fitness landscape of the green fluorescent protein. Nature. 2016, 533, 397-401.

Bozhanova NG, et al. Yellow and Orange Fluorescent Proteins with Tryptophan-based Chromophores. ACS Chem Biol. 2017 Jul 21;12(7):1867-1873.

Povarova NV, et al. Functioning of Fluorescent Proteins in Aggregates in Anthozoa Species and in Recombinant Artificial Models. Int J Mol Sci. 2017 Jul 12;18(7). pii: E1503. doi: 10.3390/ijms18071503.

Bozhanova NG, et al. Protein labeling for live cell fluorescence microscopy with a highly photostable renewable signal. Chem. Sci., 2017, 8, 7138-7142.

 

Новые генетически кодируемые сенсоры

Мы ведем работу по созданию новых сенсоров на различные регуляторные активности на основе флуоресцентных белков, которые позволяют проводить количественную визуализацию целевых процессов в живых клетках. Например, недавно нами был разработан сенсор активности каскада нонсенс-опосредованной деградации мРНК (nonsense-mediated mRNA decay, NMD), а также дальнекрасный сенсор активности каспазы-3.

Gurskaya NG, et al. Analysis of alternative splicing of cassette exons at single-cell level using two fluorescent proteins. Nucleic Acids Res. 2012, 40, e57.

Pereverzev AP, et al. Method for quantitative analysis of nonsense-mediated mRNA decay at the single cell level. Sci Rep. 2015, 5, 7729.

Zlobovskaya OA, et al. Genetically encoded far-red fluorescent sensors for caspase-3 activity. Biotechniques. 2016, 60, 62-8.

Sergeeva TF, et al. Relationship between intracellular pH, metabolic co-factors and caspase-3 activation in cancer cells during apoptosis. Biochim Biophys Acta. 2017, 1864(3):604-611.

Kost LA, Nikitin ES, Ivanova VO, Sung U, Putintseva EV, Chudakov DM, Balaban PM, Lukyanov KA, Bogdanov AM. Insertion of the voltage-sensitive domain into circularly permuted red fluorescent protein as a design for genetically encoded voltage sensor. PLoS One. 2017 Sep 1;12(9):e0184225.

 

Фотоконверсии флуоресцентных белков

Фотоактивируемые флуоресцентные белки (ФАФБ) широко используются для слежения за движением белков, органелл и клеток в живых системах, а также во флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Ранее нашим коллективом были получены одни из первых ФАФБ, такие как KFP1, PS-CFP и Dendra. В настоящее время мы продолжаем работы по получению новых ФАФБ, а также созданию новых методов их применения.

В 2009 г нами была открыта окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков, основанная на передаче электронов от хромофора на молекулу внешнего акцептора электронов. Мы продолжаем исследование механизмов данного явления и разработку методов его практического использования (например, для увеличения фотостабильн ости флуоресцентных белков).

В сотрудничестве с Нижегородской медицинской академией мы работаем над новыми метками и методами флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения на основе детекции единичных молекул (локализационная микроскопия единичных молекул PALM/STORM).

Chudakov DM, et al. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat Biotechnol. 2003, 21, 191-4. 

Gurskaya NG, et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 2006, 24, 461-5.

Bogdanov AM, et al. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nat Chem Biol. 2009, 5, 459-61.

Bogdanov AM, et al. Cell culture medium affects GFP photostability: a solution. Nat Methods. 2009, 6, 859-60.

Mamontova AV, et al. Influence of cell growth conditions and medium composition on EGFP photostability in live cells. Biotechniques. 2015, 58, 258-61.

Bogdanov AM, et al. Turning On and Off Photoinduced Electron Transfer in Fluorescent Proteins by π-Stacking, Halide Binding, and Tyr145 Mutations. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 4807-4817.

Acharya A, et al. Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing? Chem Rev. 2017 Jan 25;117(2):758-795.

Klementieva NV, et al. Green-to-red primed conversion of Dendra2 using blue and red lasers. Chem Commun (Camb). 2016 Nov 18;52(89):13144-13146.

Klementieva NV, et al. Intrinsic blinking of red fluorescent proteins for super-resolution microscopy. Chem Commun (Camb). 2017 Jan 10;53(5):949-951.

 

Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы

Фототоксичные флуоресцентные белки, первый из которых – KillerRed – был создан нами в 2006 году, продуцируют активные формы кислорода (АФК) при облучении светом. Мы продолжаем развитие данной оптогенетической технологии, которая дает возможность создавать окислительный стресс в целевых клеточных компартментах, инактивировать белки и вызывать клеточную гибель специфических клеточных популяций с помощью света.

Bulina ME, et al. A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol. 2006, 24, 95-9.

Lukyanov KA, et al. Fluorescent proteins as light-inducible photochemical partners. Photochem Photobiol Sci. 2010, 9, 1301-6.

Serebrovskaya EO, et al. Phototoxic effects of lysosome-associated genetically encoded photosensitizer KillerRed. J Biomed Opt. 2014,19, 071403.

Sarkisyan KS, et al. KillerOrange, a Genetically Encoded Photosensitizer Activated by Blue and Green Light. PLoS One. 2015, 10, e0145287.

2002—2006. Создана панель фотоактивируемых флуоресцентных белков с различным типом свето-индуцируемых спектральных переходов: нефлуоресцентный→красный (KFP1), голубой→зеленый (PS-CFP) и зеленый→красный (Dendra). Продемонстрирована применимость KFP1, PS-CFP и Dendra для прицельного фотомечения клеток, внутриклеточных органелл и белков и последующего слежение за их перемещениями, а также для мониторинга деградации целевых белков на уровне отдельных клеток в реальном времени с помощью флуоресцентной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

2005—2006. Создан первый генетически кодируемый фотосенсибилизатор — фототоксичный красный флуоресцентный белок, названный KillerRed, который может быть использован для прицельного свето-индуцированного уничтожения клеток и белков.

2005—2007. Методами направленной молекулярной эволюции получены улучшенные флуоресцентные белки, адаптированные к практическому применению. В частности, получены красные и дальне-красные белки, превосходящие по яркости все известные аналогичные флуоресцентные белки, разработанные в других лабораториях мира. Яркие дальне-красные флуоресцентные белки открывают новые перспективы флуоресцентного мечения лабораторных животных на уровне целых организмов.

2005—2008. Впервые осуществлен синтез «красных» хромофоров природных GFP-подобных белков — asFP595, Kaede и их аналоги. Данная работа позволила выявить закономерности влияния различных заместителей на спектральные свойства хромофоров, а также предложить перспективные направления мутагенеза флуоресцентных белков с целью получения вариантов с новыми спектральными характеристиками.

Ф.И.О.ДолжностьКонтакты
Лукьянов Константин Анатольевич, чл.-корр. РАНрук. подр.kluk@ibch.ru+7(495)995-55-57#2518
Гурская Надежда Георгиевна, к. б. н.с.н.с.ngurskaya@ibch.ru+7(499)742-81-22
Плетнёва Надежда Владимировна, к. х. н.с.н.с.nadand@mail.ru+7(495)3365111
Мишин Александр Сергеевич, к. б. н.с.н.с.mishin@ibch.ru+7(495)995-55-57#2518
Богданов Алексей Михайлович, к. б. н.н.с.noobissat@gmail.com+7(499)742-81-22
Мусаткина Елена Алексеевна, к. б. н.н.с.lenam14@yandex.ru
Рюмина Алина Павловнам.н.с.ryumina-07@mail.ru
Поварова Наталья Владимировнам.н.с.povarovanv@gmail.com+7(915)0447115
Злобовская Ольга Анатольевнам.н.с.olgazlob@yandex.ru+7()
Шемякина Ирина Игоревнам.н.с.
Горбачев Дмитрий Андреевичм.н.с.igorbachev@icloud.com
Божанова Нина Георгиевнаасп.nbozhanova@gmail.com
Кост Любовь Александровнаасп.lu.kurkova@gmail.com
Мамонтова Анастасия Вячеславовнаасп.sphingozin@gmail.com
Перфилов Максим Михайловичасп.sufrep@gmail.com
Гавриков Алексе Семеновичтех.-лаб.
Гладкова Любовь Николаевнаинженер+7(499)742-81-22
Колесов Данила Вадимовичинженерkolesov14@inbox.ru
Кошенкова Анастасия Владимировнаинженер
Шагин Дмитрий Алексеевич, к. б. н.ст. инж.shagdim@evrogen.ru

Ранее здесь работали:

Матвеева Надежда Константиновнапом. дир.luk.officemanager@gmail.com
Саркисян Карен Сергеевичс.н.с.durshlak@gmail.com
Ямпольский Илья Викторович, д. х. н.н.с.ivyamp@ibch.ru
Серебровская Екатерина Олеговна, к. б. н.н.с.katya_akts@ibch.ru
Маркина Надежда Михайловнам.н.с.markina.nadya@gmail.com
Белоусова Анна Алексеевнастуд.amb.ence@gmail.com

Избранные публикации (показать все)

Загружаются...

Лукьянов Константин Анатольевич

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 34, комн. 522
  • Тел.: +7(495)995-55-57#2518
  • Эл. почта: kluk@ibch.ru

Фотопереключаемые красные флуоресцентные белки для наноскопии в живых клетках (2018-11-27)

Мы получили новые обратимо фотопереключаемые красные флуоресцентные белки на основе белка FusionRed. Флуоресценция этих белков, rsFusionRed1, 2 и 3, может быть “выключена” и “включена” облучением оранжевым и зеленым светом, соответственно. Это позволяет избежать облучения фототоксичным фиолетовым и синим светом, обычно используемым для других фотопереключаемых белков. Благодаря высокой яркости, высокой фотостабильности, быстрому фотопереключению и низкой фототоксичности возбуждающего света белки rsFusionRed представляют собой прекрасные метки для наноскопии живых клеток.

Публикации

  1. Pennacchietti F, Serebrovskaya EO, Faro AR, Shemyakina II, Bozhanova NG, Kotlobay AA, Gurskaya NG, Bodén A, Dreier J, Chudakov DM, Lukyanov KA, Verkhusha VV, Mishin AS, Testa I (2018). Fast reversibly photoswitching red fluorescent proteins for live-cell RESOLFT nanoscopy. Nat Methods 15 (8), 601–604

Метод флуоресцентного мечения белков в живых клетках на основе флуорогена и флуороген-связывающего белка (2017-11-28)

Мы разработали новый метод мечения целевых белков в живой клетке, названный Protein-PAINT. Метод основан на обратимом связывании белкового домена с флуорогенным красителем, что приводит к многократному увеличению интенсивности его флуоресценции. На основе результатов компьютерного молекулярного докинга, мы получили три мутантных варианта бактериального липокалина Blc с различным сродством к флуорогену. Было показано, что флуороген быстро проникает в живые клетки и вызывает окрашивание целевых белков, слитых с мутантными Blc. Новый метод обеспечивает на порядок большую фотостабильность сигнала, по сравнению с флуоресцентными белками. Protein-PAINT также позволяет проводить долговременную флуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения живых клеток как в режиме детекции одиночных молекул, так и в режиме STED.

Глубокий структурно-функциональный анализ влияния аминокислотных замен на фотофизические свойства зеленых флуоресцентных белков (2016-11-24)

На примере зеленого флуоресцентного белка GFP впервые удалось экспериментально определить так называемый “ландшафт приспособленности” целого белка. Уникальный подход, разработанный в ходе работы, позволил соотнести функцию (флуоресценцию) и аминокислотную последовательность для нескольких десятков тысяч случайных мутантных вариантов с выявлением множества эпистатических (влияющих друг на друга) замен. Характеризация ландшафта приспособленности GFP делает возможным компьютерное предсказание свойств новых мутаций во флуоресцентных белках, а также имеет большое значение в различных областях науки, например, молекулярной эволюции и белковой инженерии.

С помощью расчетов возможных путей передачи электрона от возбужденного хромофора GFP к внешним молекулам и последующей экспериментальной проверки этих предположений удалось создать мутантные варианты с нарушением данных путей и, соответственно, повышенной фотостабильностью. Разработанный подход является новым в актуальной проблеме направленного создания фотостабильных вариантов флуоресцентных белков.

 

Рисунок. (А) Схема ландшафта приспособленности GFP по результатам анализа 51000 мутантов. Последовательность GFP представлена как круг, где каждая колонка соответствует одному аминокислотному остатку. Зеленым обозначены флуоресцентные варианты, черным – нефлуоресцентные. Цифры слева обозначают количество внесенных аминокислотных замен. Сайты с позитивным и негативным эпистатическим влиянием показаны зелеными и черными линиями, соответственно. Схема показывает узость пика ландшафта приспособленности GFP: 3/4 одиночных замен приводит к уменьшению яркости флуоресценции, а половина мутантов с 4-мя заменами полностью теряют флуоресценцию. (Б) Перенос электрона в GFP. Вверху - схема расчетного пути переноса электрона от хромофора на молекулу внешнего акцептора через тирозин-145 в качестве промежуточного акцептора. Внизу – кривые фотообесцвечивания EGFP и его вариантов с заменой тирозина-145 на фенилаланин или лейцин в присутствии окислителя в среде, демонстрирующие многократное увеличение фотостабильности мутантных вариантов благодаря блокировке пути переноса электрона. 

Публикации

  1. Acharya A, Bogdanov AM, Grigorenko BL, Bravaya KB, Nemukhin AV, Lukyanov KA, Krylov AI (2017). Photoinduced chemistry in fluorescent proteins: Curse or blessing? Chem Rev 117 (2), 758–795
  2. Sarkisyan KS, Bolotin DA, Meer MV, Usmanova DR, Mishin AS, Sharonov GV, Ivankov DN, Bozhanova NG, Baranov MS, Soylemez O, Bogatyreva NS, Vlasov PK, Egorov ES, Logacheva MD, Kondrashov AS, Chudakov DM, Putintseva EV, Mamedov IZ, Tawfik DS, Lukyanov KA, Kondrashov FA (2016). Local fitness landscape of the green fluorescent protein. Nature 533 (7603), 397–401
  3. Bogdanov AM, Acharya A, Titelmayer AV, Mamontova AV, Bravaya KB, Kolomeisky AB, Lukyanov KA, Krylov AI (2016). Turning on and off Photoinduced Electron Transfer in Fluorescent Proteins by π-Stacking, Halide Binding, and Tyr145 Mutations. J Am Chem Soc 138 (14), 4807–4817

Метод определения активности нонсенс-опосредованной деградации мРНК в единичных живых клетках с помощью флуоресцентных белков (2016-03-17)

Нонсенс-опосредованная деградация мРНК (NMD) является эволюционно консервативным механизмом распознавания и уничтожения транскриптов, несущих преждевременный стоп-кодон. Исследования последних лет показали, что NMD играет важную роль в глобальной регуляции экспрессии генов. Мы разработали новый репортер активности NMD, основанный на флуоресцентных белках. Особенностью данного репортера является возможность количественной оценки активности NMD на уровне единичных живых клеток, что не достигается ни одним из других известных методов. Используя NMD-репортер, мы обнаружили сильные различия активности NMD между линиями клеток млекопитающих. Также, мы впервые обнаружили явление существенной гетерогенности NMD внутри одной линии (например, HEK293, Jurkat, HaCaT), с выявлением субпопуляций клеток с высокой и низкой активностью NMD. Разработанный метод открывает принципиально новые возможности изучения как механизмов регуляции NMD, так и влияния низкой активности NMD на паттерн генной экспрессии и физиологическое состояние клетки.