Лаборатория механизмов генной экспрессии

Отдел функционирования живых систем

Руководитель: Шпаковский Георгий Вячеславович, д. б. н.
gvs@ibch.ru+7(495)330-65-83

эукариотическая транскрипция, регуляция генной активности, сегментные дупликации, семейства генов POLR2J и PMS2 человека, молекулярная эволюция Homo sapiens, трансгенные растения, цитохром CYP11A1 (P450scc), стероидные гормоны растений, прогестерон, абиотические и биотические стрессы

Основные направления работы лаборатории: изучение молекулярной эволюции транскрипционного аппарата и механизмов экспрессии генов у эукариотических организмов (от дрожжей до человека) [JMolBiol., 2000, 295: 1119-1127; Биоорган. химия, 2004, 30: 621-625; Генетика, 2010, 46: 1254-1257; Cell andTissue Biology, 2013, 7: 314-319] и изучение новой, недавно обнаруженной нами прогестероновой системы гормональной регуляции у высших растений [патент РФ № 2237717 от 10.10.2004; Биоорган. химия, 2010, 36: 241-250; Журнал стресс-физиологии и биохимии, 2014, 10: 85-97; BMC Plant Biology, 2017, 17: 189].

В рамках первого направления установлено, что у человека, в отличие от подавляющего большинства эукариот, существуют множественные варианты субъединицы hRPB11 (POLR2J) РНК-полимеразы II и что эти различные изоформы кодируются в геноме Homo sapiens четырьмя разными генами, расположенными на хромосоме 7. Показано, что специфические для человека изоформы hRPB11 содержат в своём составе пептидные участки, характерные для белков системы репарации из семейства PMS2, которые в геноме человека также кодируются множественными генами (см. рис. 1). В ходе дальнейших исследований мы установили, что молекулярная эволюция генных семейств POLR2J и PMS2, кодирующих базовые, незаменимые компоненты двух важнейших (в том числе и для эволюции) молекулярно-биологических систем клетки, транскрипции и репарации ДНК (MMR, mismatch repair), чётко коррелирует (совпадает) с основными этапами дивергенции высших приматов (Lesser & Great Apes) и привела к появлению у человека новых, уникальных белков, таких как минорные субъединицы РНК-полимеразы II hRPB11ba (hRPB11сa) и hRPB11bb (hRPB11сb) [Генетика, 2010, 46: 1254-1257]. С целью прояснения функций этих специфичных для человека изоформ мы установили спектры взаимодействий (интерактомы) этих белков в нервной и лимфоидной тканях Homo sapiens, впервые выявив уникальные белковые партнёры каждой из изоформ (Биохимия, 2011, 76: 1195-1200; Cell and Tissue Biology, 2013, 7: 314-319). Среди обнаруженных партнеров изоформы hRPB11ba (hRPB11сa) оказались субъединицы РНК-полимераза II hRPB3 и hRPB6, транскрипционный фактор ATF4, а также новая изоформа eIF3 субъединицы фактора инициации трансляции eIF3m [Биохимия, 2011, 76: 1195-1200]. Выясненные нами белковые взаимодействия eIF3указывают на то, что этот ядерно-цитоплазматический белок вовлечен в высокоэффективную систему синтеза и транспорта мРНК мембранных белков. Возможно, эта система играет важную роль в нейронах, где стандартный хромосомный набор клетки должен обеспечивать синтез достаточного количества белков для гигантских мембранных поверхностей. В качестве первого гена человека, в транскрипции которого участвуют транскрипционные комплексы, содержащие изучаемые нами минорные изоформы субъединицы РНК-полимеразы II hRPB11, выявлен CLN3, кодирующий мембранный белок баттенин. Мутации в этом гене приводят к возникновению болезни Баттена, тяжёлого нейродегенеративного заболевания, в патогенезе которого участвуют специфичные для человека гены семейства POLR2J (Biology Direct, 2018, in press).

Второе направление связано с получением и изучением трансгенных растений с гибридными (Animalia-Plantae) стероидогенными системами. В сотрудничестве с белорусскими учёными (Институт генетики и цитологии НАН Беларуси) мы показали, что уникальный только для животных ключевой фермент стероидогенеза CYP11A1 (Р450scc), катализирующий окислительное расщепление боковой цепи холестерина с образованием общего предшественника всех стероидных гормонов – прегненолона, успешно функционирует в трансгенных растениях табака, наперстянки и томата, повышая их устойчивость к фитопатогенам и абиотическим стрессам и ускоряя процессы роста и развития (Генетика, 2009, 45: 1217-1224; Журнал стресс-физиологии и биохимии, 2014, 10: 85-97). Тем самым впервые продемонстрирована совместимость in vivo даже самых специфичных компонентов систем биосинтеза стероидных гормонов растений и животных. Обусловленное повышенным уровнем эндогенного прогестерона формирование вышеупомянутых фенотипов у полученных трансгенных растений семейств Паслёновые и Норичниковые, экспрессирующих кДНК цитохрома P450scc (CYP11A1) млекопитающих, подразумевает, что прогестерон можно считать очень древним биорегулятором  растительных клеток и, пожалуй, первым настоящим гормонов, общим для растений и животных (Биоорган. химия, 2010, 36: 241-250; BMC Plant Biology, 2017, 17: 189). Полученные результаты демонстрируют фундаментальное родство путей биосинтеза стероидных соединений и стероидных регуляторных систем у растений и животных и могут быть использованы в новых биотехнологиях для сельского хозяйства и фармакологии.

В Лаборатории также проводились работы по синтезу и исследованию свойств модифицированных олигонуклеотидов, пригодных в качестве праймеров для кПЦР или стабилизирующих в ДНК и РНК неканонические вторичные структуры – эти соединения могут быть использованы в изучении регуляторных областей генов, а также для детекции и подавления вирусов человека (к.х.н. А.В. Аралов: с апреля 2018 г. – Группа молекулярных инструментов для исследования живых систем).

Лаборатория имеет широкий круг партнеров, как в Институте (Лаборатория оксилипиновЛабораторией инженерии белка), так и за его пределами: Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, Сколковский институт науки и технологийРоссийский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. ТимирязеваСибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск). Совместно с белорусскими партнёрами (Институт генетики и цитологии Национальной Академии наук Беларуси, г. Минск; Белорусский  государственный медицинский университет, г. Минск) в рамках совместного проекта РФФИ и БРФФИ изучается механизм интеграции митохондриального цитохрома P450scc (CYP11A1) животных в стероидогенную гормональную систему растений и его влияние на физиологию, размножение и иммунитет (проекты № 16-54-00227 и № 18-54-00038). Кроме того, Лаборатория сотрудничает с Институтом биологии и технологий в Сакле (iBiTec-S: Dr. Ju. Soutourina, профессор M. Werner; Франция) и Страсбургской Высшей Школой Биотехнологии (Dr. M. Vigneron (Франция).

Лаборатория создана в мае 2007 года на базе группы с тем же названием, которая существовала как независимое структурное подразделение ИБХ РАН с декабря 2001 г.  В более глубокой исторической ретроспективе лаборатория ведёт свой генезис из подразделений института, которыми руководили в своё время академик Михаил Николаевич Колосов (лаборатория химии продуктов микробного синтеза,  лаборатория химии генов) и профессор Юрий Адольфович Берлин (группа интерлейкинов, лаборатория генной экспрессии).

Основным направлением исследований лаборатории является изучение механизмов реализации генетической информации сложных геномов на примере эволюции «молодых», человек-специфичных генов-паралогов POLR2J и hPMS2, кодирующих новые изоформы незаменимых субъединиц аппарата транскрипции и MMR-системы репарации Homo sapiens. В настоящее время основные усилия направлены на установление взаимодействий in vivo и детализацию функций в живой клетке минорных изоформ субъединицы hRPB11 (POLR2J): hRPB11ba, hRPB11bb и hRPB11ca, hRPB11cb, кодируемых соответственно специфичными для человека генами POLR2J2 и POLR2J3

Важнейшими предпосылками для данной работы было обнаружение того факта, что у человека, в отличие от подавляющего большинства эукариотов, существуют множественные варианты субъединицы hRPB11 (POLR2J) РНК-полимеразы II и что эти различные изоформы кодируются в геноме Homo sapiens четырьмя разными генами, расположенными на хромосоме 7 (Биоорган. химия, 2004, 30: 621-625). Впервые данные нами в этой публикации названия генов POLR2J1POLR2J4, их основные характеристики и классификация кодируемых ими изоформ в настоящее время признаны HUGO и всем научным сообществом. Очень важной «функциональной» предпосылкой было обнаружение Г.В. Шпаковским того факта, что из трёх основных типов изоформ субъединицы hRPB11 (POLR2J) человека (мажорная hRPB11a и минорные hRPB11ba и hRPB11bb) только МИНОРНАЯ hRPB11ba способна, пусть и с определёнными трудностями, комплементировать нулевую аллель Drpb11-HIS3 Sacharomyces cerevisiae (BMC Mol. Biol., 2001, 2: 14). Проведённый нами филогенетический анализ семейств генов POLR2J (RPB11) и PMS2 приматов ясно показал, что в эволюции обоих этих генных семейств имеются стадии, специфичные для человека. Определена анатомия всех четырёх POLR2J и всех шестнадцати PMS2-подобных генов человека, содержащих от 4 до 16 экзонов каждый, проводится работы по изучению тканеспецифичности экспрессии важнейших из кодируемых ими мРНК в норме и патологии (при некоторых формах рака). С помощью генетических (дрожжевая двухгибридная система, мутагенез, супрессорный анализ) и биохимических (соосаждения белков из клеточных лизатов, иммунопреципитация) подходов изучаются белки, взаимодействующие с человек-специфичными изоформами субъединицы hRPB11 (POLR2J), hRPB11ba (hRPB11ca) и hRPB11bb (hRPB11cb), в нервной (эмбриональный мозг) и иммунной (клеточная линия Jurkat) тканях человека. Спектр выявленных нами на сегодняшний день  взаимодействий hRPB11ba и hRPB11сa показывает, что эти белки являются минорными изоформами субъединицы РНК-полимеразы II hRPB11 и входят в состав специфичных
РНК-полимеразных комплексов, по-новому регулирующих экспрессию целого ряда важнейших генов человека – нами впервые обнаружены некоторые из таких генов, в частности CLN3 (Biology Direct, 2018, in press).  Изучаются также партнёры и функции in vivo впервые обнаруженным нами (среди партнёров минорных изоформ субъединицы hRPB11 РНК-полимеразы II Homo sapiens) белков протеома человека: eIF3mb (Биохимия, 2011, 76: 1195-1200), COMMD4d и DROSHPA (Цитология, 2013, 55: 172-177). В перспективе эти исследования могут привести к разработке новых подходов к диагностике и мониторингу ряда онкологических и неврологических заболеваний человека.

Для изучения механизма интеграции митохондриального цитохрома P450scc (CYP11A1) животных в стероидогенную систему растений и его влияния на физиологию, размножение и иммунитет трансгенных растений томата и табака, экспрессирующих полноразмерную кДНК CYP11A1 быка, ведётся работа по установлению локализации белка CYP11A1 в клетках трансгенных растений, изучаются его функциональные партнёры в протеомах томата (известен и хорошо аннотирован полный геном), табака (нами создана представительная клонотека кДНК трансгенного по CYP11A1 растения) и наперстянки (единственное растение, для которого описана реакция отщепления боковой цепи холестерина с превращением его в прегненолон и предсказаны основные пути биосинтеза и дальнейших превращений прогестерона), анализируются фенотипы и физиология новых поколений (T3 и T4) трансгенных растений томата. Анализируются также партнёры и функции охарактеризованных нами ранее адренонодоксинподобных ферредоксинов (MFDX1 и MFDX2) табака, томата и наперстянки (Журнал стресс-физиологии и биохимии, 2014, 10: 85-97) – компонентов митохондриальной электронтранспортной цепи растений и возможных партнёров  цитохрома P450scc (CYP11A1) в их протеоме. Изучение трансгенных растений, экспрессирующих гены стероидогенных белков животных, представляется актуальной научной и прикладной задачей. С одной стороны, эти растения являются удобной моделью для изучения новых, ещё по-настоящему не охарактеризованных, путей гормональной сигнализации у растений. С другой стороны, подход, основанный на применении генов белков стероидогенеза животных, может привести к созданию трансгенных растений, обладающих улучшенными с точки зрения сельского хозяйства признаками, а в случае лекарственных растений (наперстянка) – свойствами, важными для производства медицинских препаратов из растительного сырья. Не исключено также и то, что культуры тканей этих трансгенных растений могут найти биотехнологическое применение для осуществления трансформации различных стероидных соединений или их наработки.

  1. Впервые продемонстрирована  функциональная  взаимозаменяемость in vivo отдельных субъединиц эукариотических РНК-полимераз между эволюционно далёкими организмами и проведено первое систематическое исследование взаимозаменяемости in vivo (в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae) субъединиц ядерных РНК-полимераз I, II и III эволюционно отдалённых эукариотических видов: Schizosaccharomyces pombe и Homo sapiens. (Gene, 1994, 147: 63-69; Mol. Cell. Biol., 1995, 15: 4702-4710; J. Mol. Biol., 2000, 295: 1119-1127; Nucleic Acids Res., 2006, 34: 3615-3624).
  2. Впервые показано функциональное родство малых субъединиц РНК-полимераз архей (надцарство Archaea) и эукариот (Eucarya) и впервые методом межвидовой комплементации клонированы кДНК, кодирующие незаменимый компонент многосубъединичных ферментов транскрипции (общую субъединицу Rpb10
    РНК-полимераз I-III делящихся дрожжей) и белковый фактор Fet5 (Gpn3) Schizosaccharomyces pombe, ставший прототипом нового семейства GTP/ATP–связывающих белков (Gpn1-3), играющих незаменимую роль в транспорте
    РНК-полимеразных комплексов из цитоплазмы в ядро клетки (Биоорган. химия, 1997, 23: 110-117; Биоорган. химия, 1997, 23: 234-237; J. Biol. Chem., 1999, 274: 8421-8427). Эти работы удостоены Главной премии издательства МАИК «Наука» за 1998 г. по группе биологических наук (Вестник РАН, 1999, т. 69, № 11, с. 1054).
  3. Установлен субъединичный состав РНК-полимераз I и III Schizosaccharomyces pombe, клонированы и функционально охарактеризованы кДНК и гены, кодирующие все субъединицы этих ферментов (Current Genet., 1999, 36: 208-214; Биоорган. химия, 1999, 25: 791-796; Молекулярная биология, 2002, 36: 3-26; Nucleic Acids Res., 2006, 34: 3615-3624).
  4. При активном участии лаборатории завершено секвенирование и аннотирование генома делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe: в рамках международного проекта, благодаря полученным в нашей лаборатории клонам pYUK71, pYUL23 и pYUG7, в трёх локусах восстановлена непрерывность нуклеотидной последовательности хромосомы I, cовместно с сотрудниками Сенгеровского Центра (Хинкстон, Великобритания) лаборатория была ответственной за аннотирование компонентов аппаратов транскрипции и трансляции Schizosaccharomyces pombe. Впервые российская лаборатория отмечена как полноправный участник проекта полного секвенирования генома эукариотического организма (Nature, 2002, 415: 871-880). Эта работа отмечена в числе главных научных достижений РАН за 2001 г. по разделу «Науки о жизни.
    Физико-химическая биология» («Отчёт о деятельности РАН в 2001 году  /Важнейшие итоги/», с. 43).
  5. С помощью мутагенеза консервативных аминокислотных остатков определен участок (SF/YGGLLM), наиболее важный для функции in vivo общей субъединицы РНК-полимераз I-III Rpb8. С использованием супрессорного анализа и дрожжевой двухгибридной системы показано взаимодействие Rpb8 с субъединицами Rpa1, Rpb1, Rpc1 и Rpb6. Установлено, что N-концевой домен фактора элонгации TFIIS взаимодействует с компонентом Медиатора Med13 и субъединицей Spt8 комплекса SAGA и важен для стабилизации инициаторного комплекса РНК-полимеразы II на промоторах (в сотрудничестве с учёными из Отдела биохимии и молекулярной генетики Центра Атомной Энергии в Сакле [SBGM], Франция (Prof. P. Thuriaux): Mol. Cell. Biol., 2001, 21: 6056-6065; EMBO J., 2004, 23: 4232-4242). 
  6. Впервые  (совместно с Институтом генетики и молекулярной и клеточной биологии — Иллкирш, Франция, Dr. M. Vigneron) установлено, что одна из субъединиц ядерных РНК-полимераз кодируется целым семейством генов
    (BMC Mol. Biol., 2001, 2: 14). Показано, что один из начальных этапов сборки
    РНК-полимеразы II, образование гетеродимера субъединиц  Rpb11  и  Rpb3, существенно отличается у дрожжей и человека: С-концевой участок субъединицы Rpb11 абсолютно необходим при сборке дрожжевого фермента, но не является критическим для гетеродимеризации hRPB11 и hRPB3. В то же время для сборки РНК-полимеразы II  человека в сравнении со сборкой фермента дрожжей гораздо более существенна целостность a–мотива субъединицы Rpb11, расположенного в середине N-концевой части белка (Nucleic Acids Research, 2005, 33: 3582-3590). Охарактеризованы три изоформы субъединицы hRPB11 (POLR2J) человека и выяснен механизм образования этих изоформ (Биоорган. химия, 2004, 30: 621-625).
  7. Изучена молекулярная эволюция двух специфичных для приматов генных семейств: POLR2J системы транскрипции и PMS2 системы репарации MMR. Установлено, что появление и совершенствование генетической структуры каждого из этих семейств чётко коррелируют с основными этапами биологической эволюции высших приматов. Показано, что гены PMS2 и POLR2J могут рассматриваться в качестве достоверных молекулярных маркеров антропогенеза. Предложена гипотеза о трёхкомпонентной белковой системе, продуцируемой PMS2-подобными генами человека. Сформулированы принципы каскадного усиления на поздних стадиях эволюции приматов, которое могло обеспечить ускоренную молекулярную эволюцию человека (Доклады Академии наук, 2006, 408: 699-703; Генетика, 2010, 46: 1254-1257).
  8. Определён основной спектр белковых партнёров специфичных для человека изоформ субъединицы РНК-полимеразы II hRPB11 (POLR2J) – hRPB11ba, hRPB11сa и hRPB11bb, hRPB11cb. Установлено, что минорные изоформы hRPB11ba и hRPB11ca взаимодействуют сразу с несколькими субъединицами фактора инициации трансляции hEIF3: eIF3a, eIF3i, eIF3ma и eIF3mb, что указывает на существование у Homo sapiens нового типа координации транскрипции с последующими этапами генной экспрессии (процессинг и транспорт мРНК из ядра в цитоплазму к транслирующим полисомам) (Биохимия, 2011, 76: 1195-1200). Среди партнёров изоформ hRPB11bb и hRPB11cb помимо субъединицы РНК-полимеразы II hRPB6 (POLR2F) и кóрового компонента белкового комплекса экзонных сочленений Y14 (RBM8A) обнаружен ряд белков, участвующих в биогенезе микроРНК, в том числе новый, ранее не описанный вариант инициирующей нуклеазы процессинга микроРНК DROSHA, что указывает на существование особых путей сопряжения процессов транскрипции и
    РНК-интерференции в ядрах клеток человека (Цитология, 2013, 55: 172-177).
  9. Впервые продемонстрировано функциональное родство стероидогенных систем животных и растений in vivo: экспрессия кДНК гена CYP11A1, кодирующего ключевой фермент стероидогенеза животных цитохром P450scc повышает иммунитет (устойчивость к фитопатогенам) и ускоряет процессы роста и развития трансгенных растений табака, наперстянки и томата. Показано наличие у этих растений двух андренодоксиноподобных [2Fe-2S]-ферредоксинов митохондриального типа (патент РФ № 2237717 от 10.10.2004; Генетика, 2009, 45: 1217-1224, Биоорган. химия, 2010, 36: 241-250; Журнал стресс-физиологии и биохимии, 2014, 10: 85-97; BMC Plant Biology, 2017, 17: 189). Результаты этих работ вошли в перечень важнейших научных достижений РАН 2009 г. (Отчётный доклад Президиума РАН «Научные достижения РАН в 2009 году», с. 220).

Mapping on the human chromosome 7 several genes that are important for primate evolution: four POLR2J paralogues (J1J4) and sixteen PMS2 paralogues (PMS2, ψ0, ψ1ψ14). Different stages (1, 2 and 3) of POLR2J amplification are shown; two of them are specific for Homo sapiens (marked with pink circles). Mya — million years ago.

 

Избранные публикации

  1. Tsvetkov V.B., Zatsepin T.S., Belyaev E.S., Kostyukevich Y.I., Shpakovski G.V., Podgorsky V.V., Pozmogova G.E., Varizhuk A.M., Aralov A.V. (2018). i-Clamp phenoxazine for the fine tuning of DNA i-motif stability. Nucleic Acids Res. 46 (6), 2751–2764 [+]

    Non-canonical DNA structures are widely used for regulation of gene expression, in DNA nanotechnology and for the development of new DNA-based sensors. I-motifs (iMs) are two intercalated parallel duplexes that are held together by hemiprotonated C-C base pairs. Previously, iMs were used as an accurate sensor for intracellular pH measurements. However, iM stability is moderate, which in turn limits its in vivo applications. Here, we report the rational design of a new substituted phenoxazine 2'-deoxynucleotide (i-clamp) for iM stabilization. This residue contains a C8-aminopropyl tether that interacts with the phosphate group within the neighboring chain without compromising base pairing. We studied the influence of i-clamp on pH-dependent stability for intra- and intermolecular iM structures and found the optimal positions for modification. Two i-clamps on opposite strands provide thermal stabilization up to 10-11°C at a pH of 5.8. Thus, we developed a new modification that shows significant iM-stabilizing effect both at strongly and mildly acidic pH and increases iM transition pH values. i-Clamp can be used for tuning iM-based pH probes or assembling extra stable iM structures for various applications.

    ID:2074
  2. Shpakovski G.V., Spivak S.G., Berdichevets I.N., Babak O.G., Kubrak S.V., Kilchevsky A.V., Aralov A.V., Slovokhotov I.Y., Shpakovski D.G., Baranova E.N., Khaliluev M.R., Shematorova E.K. (2017). A key enzyme of animal steroidogenesis can function in plants enhancing their immunity and accelerating the processes of growth and development. BMC Plant Biol. 17 (Suppl 1), 189 [+]

    The initial stage of the biosynthesis of steroid hormones in animals occurs in the mitochondria of steroidogenic tissues, where cytochrome P450SCC (CYP11A1) encoded by the CYP11A1 gene catalyzes the conversion of cholesterol into pregnenolone - the general precursor of all the steroid hormones, starting with progesterone. This stage is missing in plants where mitochondrial cytochromes P450 (the mito CYP clan) have not been found. Generating transgenic plants with a mitochondrial type P450 from animals would offer an interesting option to verify whether plant mitochondria could serve as another site of P450 monooxygenase reaction for the steroid hormones biosynthesis.

    ID:1982
  3. Zlobin I.E., Kartashov A.V., Shpakovski G.V. (2017). Different roles of glutathione in copper and zinc chelation in Brassica napus roots. Plant Physiol. Biochem. 118, 333–341 [+]

    We investigated the specific features of copper and zinc excess action on the roots of canola (Brassica napus L.) plants. Copper rapidly accumulated in canola root cells and reached saturation during several hours of treatment, whereas the root zinc content increased relatively slowly. Excessive copper and zinc entry inside the cell resulted in significant cell damage, as evidenced by alterations in plasmalemma permeability and decreases in cellular enzymatic activity. Zinc excess specifically damaged root hair cells, which correlated with a pronounced elevation of their labile zinc level. In vitro, we showed that reduced glutathione (GSH) readily reacted with copper ions to form complexes with blocked sulfhydryl groups. In contrast, zinc ions were ineffective as glutathione blockers, and glutathione molecules did not lose their specific chemical activity in the presence of Zn2+ ions. The effect of copper and zinc excess on the glutathione pool in canola root cells was analysed by a combination of biochemical determination of total and oxidized glutathione contents and fluorescent staining of free reduced glutathione with monochlorobimane dye. Excess copper led to dose-dependent diminution of free reduced glutathione contents in the root cells, which could not be explained by the loss of total cellular glutathione or its oxidation. In contrast, we observed little effect of much higher intracellular zinc concentrations on the free reduced glutathione content. We concluded that GSH plays an important role in copper excess, but not zinc excess chelation, in canola root cells.

    ID:1981
  4. Varizhuk A.M., Zatsepin T.S., Golovin A.V., Belyaev E.S., Kostyukevich Y.I., Dedkov V.G., Shipulin G.A., Shpakovski G.V., Aralov A.V. (2017). Synthesis of oligonucleotides containing novel G-clamp analogue with C8-tethered group in phenoxazine ring: Implication to qPCR detection of the low-copy Kemerovo virus dsRNA. Bioorg. Med. Chem. 25 (14), 3597–3605 [+]

    Nowadays modified oligonucleotides are widely used in diagnostics and as novel therapeutics. Introduction of modified or unnatural residues into oligonucleotides allows fine tuning of their binding properties to complementary nucleic acids and leads to improved stability both in vitro and in vivo. Previously it was demonstrated that insertion of phenoxazine nucleotides with various groups in C9-position into oligonucleotides leads to a significant increase of duplex stability with complementary DNA and RNA. Here the synthesis of a novel G-clamp nucleoside analogue (G(8AE)-clamp) bearing 2-aminoethyl tether at C8-atom is presented. Introduction of such modified residues into oligonucleotides lead to enhanced specificity of duplex formation towards complementary DNA and RNA targets with increased thermal and 3'-exonuclease stability. According to CD-spectroscopy studies G(8AE)-clamp does not substantially disrupt helix geometry. Primers containing G(8AE)-clamp demonstrated superior sensitivity in qPCR detection of dsRNA of Kemerovo virus in comparison to native oligonucleotides.

    ID:1819
  5. Shematorova K., Slovokhotov Y.u., Khaliluev R., Berdichevets N., Baranova N., Babak G., Shpakovski D.G., Spivak S.G., Shpakovski G.V. (2014). Mitochondria as a Possible Place for Initial Stages of Steroid Biosynthesis in Plants. Journal of Stress Physiology & Biochemistry 10 (4), 85–97 [+]

    With the aim of thorough comparison of steroidogenic systems of plants and animals, transgenic plants of Solanaceae family expressing CYP11A1 cDNA encoding cytochrome P450SCC of mammalian mitochondria were further analysed. Positive effect of CYP11A1 on resistance of the transgenic tobacco plants to the infection by fungal phytopathogene Botrytis cinerea was for the first time detected. Subtle changes in mitochondria of the transgenic Nicotiana tabacum plants expressing mammalian CYP11A1 cDNA were demonstrated by transmissive electron microscopy. The main components of the electron transfer chain of plant mitochondria were for the first time cloned and characterized. It was established that plants from the Solanacea family (tomato, tobacco and potato) contain two different genes with similar exon-intron structures (all contain 8 exons) encoding mitochondrial type ferredoxins (MFDX), and one gene for mitochondrial ferredoxin reductase (MFDXR). The results obtained point out on profound relatedness of electron transfer chains of P450-dependent monooxygenases in mammalian and plant mitochondria and support our previous findings about functional compatability of steroidogenic systems of Plantae and Animalia.

    ID:1493
  6. Khaliluev M.R., Shpakovski G.V. (2013). Genetic engineering strategies for enhancing tomato resistance to fungal and bacterial pathogens. Russian Journal of Plant Physiology 60 (6), 721–732 [+]

    The classification and detailed overview of the currently known effective strategies used to increase the resistance of tomato (Solanum lycopersicum L., syn. Lycopersicon esculentumMill.) plants to infectious fungal and bacterial diseases by genetic engineering approaches are presented. Modern data on the mechanisms of the protective effect of heterologous genes on the enhancement of transgenic tomato resistance to fungal and bacterial pathogens are discussed.

     
     
    ID:2079
  7. Shematorova E.K., Shpakovski D.G., Shpakovski G.V. (2013). [Novel complexes of gene expression and their role in the appearance and evolution of the genus Homo]. Tsitologiia 55 (3), 172–7 [+]

    Using genetic (yeast two-hybrid system) and biochemical (co-precipitation of proteins from cellular lysates) approaches, we have performed a whole-genome wide search for interacting partners of the previously described by us variants of hRPB11 subunit of human RNA polymerase II - hRPB1 1balpha, hRPB11calpha and hRPB1 1bbeta, hRPB 11cbeta - in fetal brain and Jurkat cell line libraries. In consequence, the main spectrum of the protein partners of these human specific isoforms of the RNA polymerase II subunit hRPB 11 (POLR2J) has been established. Functional characteristics of the uncovered protein partners of hRPB 11balpha and hRPB 11calpha isoforms clearly indicate that these isoforms, similarly to the main (major) subunit hRPB11a, are components of the distinct transcription complexes participating not only in the transcription of the specific DNA matrices, but involving also in the later stages of mRNA biogenesis. The RNA polymerase I-III common subunit hRPB6 (POLR2F) and basal component of the exon-exon junction complex Y14 (RBM8A) have been found among the protein partners of the isoforms hRPB 11bbeta and hRPB 11cbeta together with a number of proteins involved in the biogenesis of microRNAs, including a novel, not previously described variant of the microRNA processing nuclease DROSHA, which indicates the existence of a special coordination between processes of transcription and RNA interference in the nuclei of human cells.

    ID:1492
  8. Proshkin S.A., Shematorova E.K., Souslova E.A., Proshkina G.M., Shpakovski G.V. (2011). A minor isoform of the human RNA polymerase II subunit hRPB11 (POLR2J) interacts with several components of the translation initiation factor eIF3. Biochemistry Mosc. 76 (8), 976–80 [+]

    Using the yeast two-hybrid (YTH) system we have uncovered interaction of the hRPB11cα minor isoform of Homo sapiens RNA polymerase II hRPB11 (POLR2J) subunit with three different subunits of the human translation initiation factor eIF3 (hEIF3): eIF3a, eIF3i, and eIF3m. One variant of eIF3m identified in the study is the product of translation of alternatively spliced mRNA. We have named a novel isoform of this subunit eIF3mβ. By means of the YTH system we also have shown that the new eIF3mβ isoform interacts with the eIF3a subunit. Whereas previously described subunit eIF3mα (GA17) has clear cytoplasmic localization, the novel eIF3mβ isoform is detected predominantly in the cell nucleus. The discovered interactions of the hRPB11cα isoform with several hEIF3 subunits demonstrate a new type coordination between transcription and the following (downstream) stages of gene expression (such as mRNA transport from nucleus to the active ribosomes in cytoplasm) in Homo sapiens and point out the possibility of existence of nuclear hEIF3 subcomplexes.

    ID:1486
  9. Shematorova E.K., Shpakovski D.G., Shpakovski G.V. (2010). [PSM2 and POLR2J gene families as molecular markers of the higher primate evolution]. Genetika 46 (9), 1254–7 [+]

    We have studied the molecular evolution of two gene families specific for primates: POLR2J of the transcription system and PMS2 of the MMR repair system. The appearance and improvement of the genetic structure in each of the families was shown to strongly correlate with the main stages of the higher primates biological evolution. Our results indicate that the PSM2 and POLR2J genes can serve as helpful and reliable molecular markers of anthropogenesis.

    ID:1491
  10. Spivak S.G., Berdichevets I.N., Iarmolinskiĭ D.G., Maneshina T.V., Shpakovski G.V., Kartel N.A. (2009). [Construction and characteristics of transgenic tobacco Nicotiana tabacum L. plants expressing CYP11A1 cDNA encoding cytochrome P450scc]. Genetika 45 (9), 1217–24 [+]

    In steroidogenic animal tissues cytochrome P450scc catalizes the conversion of cholesterol into pregnenolone, a common metabolic precursor of all steroid hormones. To study the possibility of functioning of mammalian cytochrome P450scc in plants and the mechanism of its integration in the plant steroidogenic system, transgenic plants of tobacco Nicotiana tabacum L. were developed carrying cDNA of CYP11A1 encoding cytochrome P450scc of bovine adrenal cortex. Pregnenolone, a product of the reaction catalyzed by cytochrome P450scc, was discovered in the steroid-containing fraction of transgenic plants. Transgenic plants are characterized by a reduced period of vegetative development (early flowering and maturation of bolls) and increased productivity. The contents of soluble protein and carbohydrates in leaves and seeds of transgenic plants are essentially higher than the contents of these components in leaves and seeds of control plants.

    ID:1488
  11. Spivak S.G., Berdichevets I.N., Litvinovskaia R.P., Drach S.V., Kartel N.A., Shpakovski G.V. (2009). [Characteristics of steroid metabolism in transgenic Nicotiana tabacum plants bearing the CYP11A1 cDNA of cytochrome P450(SCC) from the bovine adrenal cortex]. Bioorg. Khim. 36 (2), 241–50 [+]

    In the mitochondria of animal steroidogenic tissues, cytochrome P450(SCC), encoded by the CYP11A1 gene, catalyzes the conversion of cholesterol into pregnenolone - the general precursor of all steroid hormones. In this work, we study the steroid metabolism in transgenic tobacco plants carrying the CYP11A1 cDNA cytochrome P450(SCC)from the bovine adrenal cortex. The transgenic plants under investigation markedly surpass the control wild-type plants by size and are characterized by a shortened period of vegetative growth (by rapid flowering); their leaves contain pregnenolone - the product of a reaction catalyzed by cytochrome P450(SCC). The level of progesterone in transgenic tobacco leaves is higher than in the control plants of the wild type. The seeds of the transgenic plants contain less (24R)-brassinosteroids than the wild-type tobacco plants. The results obtained indicate that the synthesis of an active P450(SCC) cytochrome in transgenic Nicotiana tabacum plants has a profound effect on steroid metabolism and is responsible for the specific phenotypic features of transgenic plants bearing CYP11A1 cDNA.

    ID:1490
  12. Shpakovski D.G., Shematorova E.K., Shpakovski G.V. (2006). Human PMS2 gene family: origin, molecular evolution, and biological implications. Dokl. Biochem. Biophys. 408 (5), 175–179 [+]

    Проведен филогенетический анализ генов семейства PMS2 приматов и уточнена их классификация. Установлено, что в эволюции этого генного семейства имеются стадии, специфичные для человека. Предложена гипотеза о трёхкомпонентной белковой системе, продуцируемой PMS2-подобными генами Homo sapiens.

    ID:61
  13. Proshkina G.M., Shematorova E.K., Proshkin S.A., Zaros C., Thuriaux P., Shpakovski G.V. (2006). Ancient origin, functional conservation and fast evolution of DNA-dependent RNA polymerase III. Nucleic Acids Res. 34 (13), 3615–24 [+]

    Определены основные этапы эволюции ядерных РНК-полимераз I—III эукариот. Показано, что состоящий из трёх РНК-полимераз базовый аппарат транскрипции ядерных организмов возник очень давно и характерен для представителей всех основных царств (таксономических супергрупп) эукариот. В ходе дальнейшей эволюции трёх ферментов транскрипции состоящий из двенадцати субъединиц кор РНК-полимераз оставался консервативным, а субъединицы, специфичные для каждого из трёх типов полимераз, быстро дивергировали. В составе 12-субъединичного кóра РНК-полимеразы III впервые обнаружены три высоко консервативных домена, специфичных для этого фермента транскрипции.

    ID:60
  14. Shpakovski D.G., Shematorova E.K., Shpakovski G.V. (2004). New genes on human chromosome 7: bioinformatic analysis of a gene cluster from the POLR2J family. Bioorg. Khim. 30 (6), 621–5 [+]

    В составе хромосомы 7 человека выявлены четыре независимых гена, кодирующих различные варианты субъединицы hRPB11 РНК-полимеразы II Homo sapiens. Установлено, что при экспрессии четырёх генов POLR2J человека могут синтезироваться, по крайней мере, 14 видов зрелых, кодирующих слегка различные изоформы hRPB11, мРНК, 11 из которых охарактеризованы. Предложена и обоснована схема происхождения множественных генов семейства POLR2J путём трёх увеличивающихся в размерах дупликаций, позволяющая сделать ряд интересных наблюдений о путях эволюции отдельных человеческих генов и о механизмах генерирования белкового разнообразия у высших эукариот.

    ID:59
  15. Wood V., Gwilliam R., Rajandream M.A., Lyne M., Lyne R., (> 100 authors here) , Paulsen I., Potashkin J., Shpakovski G.V., Ussery D., Barrell B.G., Nurse P., Cerrutti L. (2002). The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe. Nature 415 (6874), 871–80 [+]

    При активном участии лаборатории завершено секвенирование и аннотация (см. также: Биоорган. химия, 1999, 25: 450–463) генома делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe. В рамках международного проекта по полному секвенированию генома Schizosaccharomyces pombe в трёх локусах восстановлена непрерывность нуклеотидной последовательности хромосомы I: три изолированных в нашей лаборатории клона (pYUK71, pYUL23 и pYUG7) вошли в список клонов, составляющих полную физическую карту генома делящихся дрожжей. Впервые российская лаборатория была отмечена как полноправный участник проекта полного секвенирования генома эукариотического организма.

    ID:58
  16. Shpakovski G.V., Gadal O., Labarre-Mariotte S., Lebedenko E.N., Miklos I., Sakurai H., Proshkin S.A., Van Mullem V., Ishihama A., Thuriaux P. (2000). Functional conservation of RNA polymerase II in fission and budding yeasts. J. Mol. Biol. 295 (5), 1119–27 [+]

    Ранее нами была впервые продемонстрирована функциональная взаимозаменяемость in vivo отдельных субъединиц эукариотических РНК-полимераз между эволюционно далекими организмами (Г. В. Шпаковский и др.: Gene, 1994, 147: 63–69; Mol. Cell. Biol., 1995, 15: 4702–4710) и и установлено функциональное родство малых субъединиц РНК-полимераз архей и эукариот (Биоорган. химия, 1997, 23: 110–117; J. Biol. Chem., 1999, 274: 8421–8427). В данной итоговой работе было проведено первое систематическое исследование взаимозаменяемости in vivo всех двенадцати субъединиц ядерной РНК-полимеразы II между эволюционно далекими видами дрожжей, Schizosaccharomyces pombe и Saccharomyces cerevisiae, а также завершены клонирование и функциональная характеристика всех компонентов РНК-полимеразы II делящихся дрожжей.

    ID:57

Шпаковский Георгий Вячеславович

  • Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте
  • ИБХ РАН, корп. 52, комн. 364
  • Тел.: +7(495)330-65-83
  • Эл. почта: gvs@ibch.ru

Прогестерон как древнейший биорегулятор растительной клетки (2017-11-29)

Впервые продемонстрирована совместимость in vivo даже самых специфичных компонентов систем биосинтеза стероидных гормонов растений и животных. Путём повышения уровня эндогенного прогестерона в специально сконструированных для этих целей трансгенных растениях табака и томата со встройками кДНК CYP11A1 животных, мы смогли существенно ускорить процессы роста и развития растений и повысить их устойчивость к абиотическим и биотическим стрессам. Формирование вышеупомянутых успешных (желаемых) фенотипов у полученных трансгенных растений семейства Паслёновые, экспрессирующих кДНК цитохрома P450scc (CYP11A1) млекопитающих, подразумевает, что прогестерон можно считать очень древним биорегулятором  растительных клеток и, пожалуй, первым настоящим гормонов, общим для растений и животных. Полученные результаты свидетельствуют об определённом сходстве путей биосинтеза стероидных соединений и систем стероидного регулирования у растений и животных и могут быть использованы в новых биотехнологиях для сельского хозяйства и фармакологии.

Новые нуклеотидные модификации для стабилизации канонических и неканонических вторичных структур нуклеиновых кислот (2017-11-29)

Разработаны новые феноксазиновые нуклеотидные модификации для стабилизации канонических (G8AE-clamp) и неканонических (i-Clamp) вторичных структур нуклеиновых кислот (НК). Введение G8AE-clamp обеспечивает превосходную стабилизацию дуплексных структур НК, а использование праймеров с данной модификацией вместо немодифицированных олигонуклеотидов приводит к значительному повышению чувствительности детекции дцРНК вируса Кемерово в природных изолятах с помощью кПЦР. На настоящий момент, i-clamp модификация показывает наилучшие стабилизирующие i-мотив (iM) свойства в широком диапазоне кислых pH и может быть использована для конструирования iM-наноустройств с заранее заданными свойствами, таких как pH сенсоры, молекулярные моторы, гидрогели, конструкции для доставки лекарственных средств и т.д.